專(zhuān)利名稱(chēng)：一種MicroRNA特異表達(dá)譜及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及ー種腫瘤生物標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用，具體涉及ー種MicroRNA特異表達(dá)譜及其應(yīng)用，所述的MicroRNA特異表達(dá)譜與肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)早期診斷和預(yù)后判斷相關(guān)。
背景技術(shù)：
自2004年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤分子標(biāo)志物研究的不斷進(jìn)展，microRNA成為當(dāng)今分子標(biāo)志物研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了 MicroRNAs (miRNAs)是ー種約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA (雙鏈)但是與siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測(cè)，這些非編碼小分子RNA (miRNAs) 參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線(xiàn)蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個(gè)研究小組在包括人類(lèi)、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。有越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs在腫瘤的診斷，腫瘤生物學(xué)行為以及預(yù)后的判斷方面有著巨大的應(yīng)用潛力。生物芯片技術(shù)是通過(guò)微縮技木，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)；它的出現(xiàn)給生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、新藥研發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭(zhēng)、司法鑒定、食品與環(huán)境監(jiān)督等眾多領(lǐng)域帶來(lái)巨大的革新甚至革命。按照芯片上固化的生物材料的不同，可將生物芯片劃分成為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列為分析對(duì)象的 “微陣列(microarray) ”，也被稱(chēng)為基因芯片(genechip)多DNA芯片(DNAchip)。microRNA芯片隨著研究者對(duì)miRNAs的研究的不斷深入，而逐漸成為對(duì)miRNAs研究的有力的輔助工具。丹麥Exiqon公司基于LNA 專(zhuān)利技木，開(kāi)發(fā)出一系列microRNA研究工具，其基于LNA 專(zhuān)利技術(shù)捕獲探針的microRNA芯片，具有高靈敏度，搞特異性，Tm值均一化，雜交溫度高，統(tǒng)ー標(biāo)記方法，節(jié)約樣品用量，無(wú)需純化樣品等特性，是microRNA高通量研究的有力輔助工具。目前臨床上常常無(wú)法做到對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，往往會(huì)延誤治療的最佳時(shí)機(jī)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性肝癌在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中排第5位，占惡性腫瘤死亡原因的第3位。肝切除曾經(jīng)是治療肝癌的主要方法，但是在我國(guó)肝癌患者中80%以上的患者有不同程度的肝硬化，而在這些患者中能夠行肝切除治療的患者僅占10% -15%。其余的患者由于腫瘤的大小，位置以及潛在肝硬化的嚴(yán)重程度等因素而無(wú)法實(shí)行肝切除木。隨著近年來(lái)肝移植術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，以及在國(guó)際公認(rèn)肝移植標(biāo)準(zhǔn)的篩選下，肝移植術(shù)已經(jīng)成為肝癌的一種有效的治療方法。但是腫瘤的復(fù)發(fā)是影響受者長(zhǎng)期存活的主要因素。目前在國(guó)際上常用的肝癌肝移植受者選擇標(biāo)準(zhǔn)主要包括米蘭標(biāo)準(zhǔn)和UCSF標(biāo)準(zhǔn)。Mazzaferro 等在1996年首次提出米蘭標(biāo)準(zhǔn)①單ー癌灶直徑く 5cm ；②癌灶< 3個(gè)，每個(gè)直徑く 3cm ；③ 無(wú)肝內(nèi)大血管浸潤(rùn)和肝外轉(zhuǎn)移。符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)的肝癌受者肝移植術(shù)后4年生存率為85%，不符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)者肝移植術(shù)后4年生存率為50% ο 2001年，Yao等提出了 UCSF (University of California, San Froncisco)標(biāo)準(zhǔn)①單ー癌灶直徑< 6. 5cm ；②癌灶< 3個(gè)，每個(gè)直徑 く 4. 5cm,累計(jì)直徑彡8cm ；③無(wú)肝內(nèi)大血管浸潤(rùn)和肝外轉(zhuǎn)移。符合UCSF標(biāo)準(zhǔn)的肝癌受者肝移植術(shù)后1年、5年生存率分別為90%、75%，不符UCSF標(biāo)準(zhǔn)者肝移植術(shù)后1年生存率為 50%。但是為什么在這些肝移植準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格篩選下，仍有一定比例的病人術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，我們不得而知?？v觀目前主要的肝癌肝移植準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)，都著重于腫瘤大體形態(tài)學(xué)指標(biāo)， 很少涉及基因及蛋白分子等實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，不可避免地使得對(duì)于腫瘤生物學(xué)行為的評(píng)估及預(yù)后的預(yù)測(cè)片面化。所以，探討肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制、尋找預(yù)警復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靶分子，可為臨床防治肝癌移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)，具有現(xiàn)實(shí)的社會(huì)需求和重要的科學(xué)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供涉及ー種腫瘤生物標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用，具體涉及ー種 MicroRNA特異表達(dá)譜及其應(yīng)用，所述的MicroRNA特異表達(dá)譜是高敏感度、高特異性的新的肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)早期診斷及預(yù)后判斷相關(guān)的ー組特異性MicroRNA表達(dá)譜，能為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的早期診斷及預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。本發(fā)明采用Exiqon公司microRNA microarray篩選出肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)病人與腫瘤為復(fù)發(fā)病人間的miRNAs的差異表達(dá)譜，并聯(lián)合應(yīng)用Taqman real-time PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果，最后擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證由芯片獲得的miRNAs的差異表達(dá)譜。本發(fā)明中，所述的具有差異表達(dá)的肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)的microRNAs，包括以下的ー組 5 種 miRNAs,分別為 hsa-mir_19a、hsa-mir—24、hsa-mir—223、has-mir—126、 has-mir-886-5p ；所述的一組miRNAs可較準(zhǔn)確區(qū)分肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的樣品和腫瘤未復(fù)發(fā)的樣品，并可準(zhǔn)確判斷病人的預(yù)后。本發(fā)明還提供所述的MicroRNA特異表達(dá)譜參數(shù)組合，可用于判斷肝癌肝移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)及病人的預(yù)后。本發(fā)明中，確定所述的MicroRNA特異表達(dá)譜包括以下步驟(1)標(biāo)本準(zhǔn)備肝癌肝移植術(shù)后離體的肝臟腫瘤石蠟包埋標(biāo)本；RNA 抽提試劑 trizol (Invitrogen)抽提 RNA，_80°C備用；(2)microRNA microarray 分析差異表達(dá)的 miRNAs采用丹麥Exiqon公司microRNA microarray芯片分析肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)標(biāo)本和腫瘤未復(fù)發(fā)標(biāo)本間差異表達(dá)的miRNAs ；采用miRCURYTMArray Power標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3 或Hy5 熒光基團(tuán)標(biāo)記 miRNA，得到用干與芯片雜交的熒光探針；在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用MAUI雜交儀將標(biāo)記好的探針和miRCURY 芯片雜交；使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用配套軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算；(3) Taqman real-time PCR方面驗(yàn)證芯片結(jié)果并擴(kuò)大樣本量進(jìn)ー步驗(yàn)證差異表達(dá) miRNAs。
上述的5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，經(jīng)過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)合臨床隨訪(fǎng)資料，結(jié)果表明，上述一組5個(gè)miRNAs可作為ー個(gè)綜合的指標(biāo)作為判斷肝癌肝移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)并判斷病人預(yù)后的參考指標(biāo)。本發(fā)明的實(shí)施例中，采用提供的5個(gè)miRNAs或綜合指標(biāo)作為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)判斷的參考，結(jié)果表明，參考準(zhǔn)確率達(dá)77% ；同時(shí)，對(duì)于根據(jù)Milan 分層后的病人亦可分別作為判斷腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后情況判斷的參考；因此，本發(fā)明的差異表達(dá)的miRNAs可用于臨床肝癌肝移植術(shù)后腫瘤高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)病人的篩選參考標(biāo)準(zhǔn)，為早期干預(yù)治療及實(shí)施個(gè)體化治療提供依據(jù)。本發(fā)明為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)早期診斷、預(yù)后判斷及早期干預(yù)治療提供了較重要的參考依據(jù)。本發(fā)明具有較大的實(shí)際臨床價(jià)值，可用于臨床檢測(cè)篩選高危復(fù)發(fā)人群， 及早開(kāi)始術(shù)后干預(yù)治療及實(shí)行個(gè)體化的治療，減少非高危復(fù)發(fā)病人不必要的治療及醫(yī)療花費(fèi)。本發(fā)明經(jīng)濟(jì)合理，每檢測(cè)一人標(biāo)本成本為1000元人民幣，明顯降低患者醫(yī)療開(kāi)支，有利于促進(jìn)醫(yī)療保險(xiǎn)制度的改革。


圖1是5個(gè)miRNAs綜合指標(biāo)判斷整個(gè)病人群體的生存率圖，其中，根據(jù)5個(gè)miRNAs綜合表達(dá)情況將整個(gè)病人群體分為高危險(xiǎn)組(High-risk signature)禾ロffcfii險(xiǎn)組(Low-risK signature;。圖2是5個(gè)miRNAs綜合指標(biāo)判斷整個(gè)病人群體無(wú)瘤生存期圖，其中，根據(jù)5個(gè)miRNAs綜合表達(dá)情況將整個(gè)病人群體分為高危險(xiǎn)組(High-risk signature)禾ロffcfii險(xiǎn)組(Low-risK signature;。圖3是5個(gè)miRNAs綜合指標(biāo)判斷符合Milan標(biāo)準(zhǔn)的病人的生存率圖其中，根據(jù)5個(gè)miRNAs綜合表達(dá)情況將整個(gè)病人群體分為高危險(xiǎn)組(High-risk signature)禾ロffcfii險(xiǎn)組(Low-risK signature;。圖4是5個(gè)miRNAs綜合指標(biāo)判斷符合Milan標(biāo)準(zhǔn)的病人無(wú)瘤生存期圖其中，根據(jù)5個(gè)miRNAs綜合表達(dá)情況將整個(gè)病人群體分為高危險(xiǎn)組(High-risk signature)禾ロffcfii險(xiǎn)組(Low-risK signature;。圖5是5個(gè)miRNAs綜合指標(biāo)判斷超過(guò)Milan標(biāo)準(zhǔn)的病人的生存率圖其中，根據(jù)5個(gè)miRNAs綜合表達(dá)情況將整個(gè)病人群體分為高危險(xiǎn)組(High-risk signature)禾ロffcfii險(xiǎn)組(Low-risK signature;。圖6是5個(gè)miRNAs綜合指標(biāo)判斷超過(guò)Milan標(biāo)準(zhǔn)的病人的無(wú)瘤生存期圖其中，根據(jù)5個(gè)miRNAs綜合表達(dá)情況將整個(gè)病人群體分為高危險(xiǎn)組(High-risk signature)禾ロffcfii險(xiǎn)組(Low-risK signature;。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一、標(biāo)本準(zhǔn)備肝癌肝移植術(shù)后離體肝臟腫瘤石蠟包埋標(biāo)本，分別為移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)組(5例) 移植術(shù)后腫瘤未復(fù)發(fā)組(5例)，以10 μ m的厚度連續(xù)切片20張，裝于干凈EP管中常溫備
5用。ニ、RNA 抽提1.樣品處理上述樣品加入液氮研磨至細(xì)粉，最后轉(zhuǎn)移至有Iml TRIzol的離心管中，反復(fù)振蕩約5min。(如為細(xì)胞樣品，則取約106 107左右的細(xì)胞數(shù)至Iml TRIzol中，反復(fù)吹打至裂解。)2.相分離室溫放置IOmin左右后，每Iml TRIzol中加入氯仿為200 μ 1，蓋上蓋子，劇烈振蕩約lmin，室溫靜置2 5min，然后12000g冷凍離心15min (6°C )，小心取出樣品，通過(guò)觀察可以發(fā)現(xiàn)樣品分三層，其中最上層含有RNA樣品。3. RNA 沉淀小心吸取上清液約450 μ 1 (每Iml TRIzol的吸取量)至含有600 μ 1冷凍異丙醇的新離心管中，混勻，_20°C放置約IOmin, 12000g冷凍離心IOmin (6°C )。4. RNA 洗滌去上清，加入500 μ 1冷凍的75%乙醇，彈起沉淀后12000g冷凍離心5min (6°C )， 去上清，再稍離，吸去上清液。5. RNA 溶解風(fēng)干約5 IOmin(注意不能風(fēng)太干，只需要沉淀泛白即可)，加入DEPC水約 30μ1。貼上標(biāo)簽后-80°C保存。6. RNA濃度測(cè)定吸取1 μ 1抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后，在Nanodrop上測(cè)定RNA濃度，以 DEPC水做空白對(duì)照，同時(shí)記錄RNA濃度及其0擬60/0擬80。7. RNA電泳檢測(cè)7. 1.變性膠制備取Ig Agarose+75ml去離子水煮沸，冷卻至70°C左右加入IOml lOXMops和15ml 甲醛及EB。倒膠至寬ロ梳子的膠板上，蓋上蓋子。7. 2.電泳緩沖液配制(IXMops)取50ml lOXMops，用去離子水稀釋至500ml，倒入電泳槽中，再在電泳緩沖液中添加EB.7. 3. RNA 樣品處理取RNA樣品3 μ 1，補(bǔ)充DEPC水至18μ 1，65°C變性IOmin后立即冷卻，加入2μ 1 10XRNA loading buffer 即可電泳7. 4. RNA 電泳先把RNA膠放入電泳槽中，100V作用電泳約5min，再在點(diǎn)樣孔中點(diǎn)入處理過(guò)的RNA 樣品，100V左右電泳至溴酚藍(lán)至膠的1/3處，取膠拍照。microRNA microarray采用miRCURYTMArray Power標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3 或Hy5 熒光基團(tuán)標(biāo)記 miRNA，可以得到用干與芯片雜交的熒光探針。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用MAUI雜交儀將標(biāo)記好的探針和miRCURY 芯片雜交。
使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用配套軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算。四、Taqman real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果并擴(kuò)大樣本量進(jìn)ー步驗(yàn)證差異表達(dá) miRNAs。1. RNA的反轉(zhuǎn)錄①按照下面的體系配制反轉(zhuǎn)錄MIX表 權(quán)利要求
1.一種MicroRNA特異表達(dá)譜，其特征在干，所述的MicroRNA特異表達(dá)譜為 hsa-mir-19a> hsa-mir-24> nsa-mir-223> has-mir-126 本ロ has_mir_886_5p0
2.按權(quán)利要求1所述的MicroRNA特異表達(dá)譜，其特征在干，所述的MicroRNA特異表達(dá)譜通過(guò)以下步驟獲得(1)標(biāo)本準(zhǔn)備肝癌肝移植術(shù)后離體肝臟腫瘤石蠟包埋標(biāo)本；RNA抽提試劑trizol抽提RNA，-80°C備用；(2)microRNAmicroarray 分析差異表達(dá)的 miRNAs采用microRNA microarray芯片分析肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)離體標(biāo)本和腫瘤未復(fù)發(fā)離體標(biāo)本間差異表達(dá)的miRNAs ；采用Array Power標(biāo)記試劑盒，用標(biāo)記酶將Hy3 或Hy5 熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA，得到用干與芯片雜交的熒光探針；在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用雜交儀將標(biāo)記好的探針與上述芯片雜交；使用芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用配套軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算；(3)Taqmanreal-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果并擴(kuò)大樣本量，進(jìn)ー步驗(yàn)證差異表達(dá)miRNAs。
3.按權(quán)利要求2所述的MicroRNA特異表達(dá)譜，其特征在干，步驟(2)所述的芯片分析肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)離體標(biāo)本和腫瘤未復(fù)發(fā)離體標(biāo)本間差異表達(dá)的miRNAs中，調(diào)節(jié)設(shè)立主要參數(shù)為檢測(cè)分子量范圍0-50，000道爾頓，激光強(qiáng)度200，檢測(cè)敏感度9，檢測(cè)點(diǎn) 20-80。
4.權(quán)利要求1所述的MicroRNA特異表達(dá)譜在制備肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)早期診斷標(biāo)準(zhǔn)中的用途。
5.權(quán)利要求1所述的MicroRNA特異表達(dá)譜在制備肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)后判斷標(biāo)準(zhǔn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種MicroRNA特異表達(dá)譜及其臨床應(yīng)用。本發(fā)明提供的5個(gè)miRNAs或綜合指標(biāo)可判斷肝癌肝移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)，準(zhǔn)確率達(dá)77％；同時(shí)，其不但可以判斷整個(gè)病例群體的腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后情況，對(duì)于根據(jù)Milan分層后的病人，所述的5個(gè)miRNAs或綜合指標(biāo)亦可分別判斷腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后情況；因此，本發(fā)明可用于臨床肝癌肝移植術(shù)后腫瘤高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)病人的篩選，幫助判斷預(yù)后，早期診斷復(fù)發(fā)，為早期干預(yù)治療及實(shí)施個(gè)體化治療提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586412SQ20111002190
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者彭志海, 樊軍衛(wèi), 韓中博 申請(qǐng)人:上海市第一人民醫(yī)院