專利名稱：：一種用于雙色微陣列熒光系統(tǒng)的可靠的熒光校正方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：這項(xiàng)發(fā)明是關(guān)于一種用于雙色熒光標(biāo)記系統(tǒng)的測(cè)量熒光發(fā)射光的可靠方法和體系，以及一種用于雙色熒光標(biāo)記系統(tǒng)的校正熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光串?dāng)_的簡(jiǎn)單方法。
背景技術(shù)：
：微陣列是一項(xiàng)普遍和有效的分子生物學(xué)研究技術(shù)，廣泛用于基因表達(dá)譜分析、基因組分析和藥物開發(fā)。在需要檢測(cè)特定靶標(biāo)分子(如DNA或RNA序列)的應(yīng)用領(lǐng)域中，微陣列技術(shù)廣為人知，同時(shí)在微陣列的制作和使用方法方面，已積累了許多的研究基礎(chǔ)。微陣列芯片上的信息讀取可以通過多種不同的方式，但最為便利并且選擇性最高的方法是通過熒光檢測(cè)，因?yàn)樾枰獧z測(cè)的靶標(biāo)分子通常具有較低的熒光背景，而且熒光檢測(cè)工具易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。微陣列方法通過熒光強(qiáng)度分析，可以并行地分析樣品中不同靶標(biāo)分子(例如核酸和蛋白)的相對(duì)數(shù)量。典型的應(yīng)用包括使用cDNA微陣列芯片進(jìn)行表達(dá)譜分析(Duggan,e"丄,NatureGeneticsSupplement,21:10-14，1999;Yang，eta丄,NatureReviewGenetics,3:579-588，2002)。微陣列芯片上固定的探針通常是已知結(jié)構(gòu)的分子，用以檢測(cè)樣品中能與探針結(jié)合的靶標(biāo)分子數(shù)量。芯片上的某些特定探針分子與樣品中的某些特定靶標(biāo)分子具有較強(qiáng)的親和力。如果這些靶標(biāo)分子存在于樣品中，它們將與探針結(jié)合，并固定在芯片上。那么基于微陣列芯片上的熒光強(qiáng)度分析，將可以同時(shí)檢測(cè)樣品中大量不同耙標(biāo)分子的相對(duì)數(shù)量。使用微陣列技術(shù)時(shí)，可以選擇兩種方案單色方案和雙色方案。單色方案中，只使用一種熒光團(tuán)標(biāo)記不同的樣品分別標(biāo)記后，與不同的芯片雜交。而雙色方案中，使用兩種熒光團(tuán)(例如Cy3和Cy5)分別標(biāo)記兩個(gè)樣品(處理樣品和對(duì)照樣品)。在單色方案中，通過熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)量單一樣品中的靶標(biāo)數(shù)量。在雙色方案中，兩個(gè)不同樣品中相同耙標(biāo)的相對(duì)數(shù)量可以同時(shí)測(cè)量，其前提是兩種熒光團(tuán)的測(cè)量互不干擾。雙色微陣列芯片的制作流程中，首先通過在薄板、芯片或載玻片上點(diǎn)制探針分子(例如cDNA片段、寡核苷酸、蛋白或組織)制作微陣列。通常，尺寸適合于樣品自動(dòng)處理和商業(yè)化熒光掃描儀檢測(cè)的載玻片或薄板用作剛性的基底。其表面經(jīng)過修飾后，包覆了聚賴氨酸或氨基，用于固定不同類型的探針分子。兩組不同的樣品(處理樣品和對(duì)照樣品，或陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照)分別使用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記(例如標(biāo)記處理樣品的Cy5和標(biāo)記對(duì)照樣品的Cy3)。將標(biāo)記后的樣品混合，與固定有可尋址探針的微陣列芯片進(jìn)行親和反應(yīng)。之后，洗去未與芯片結(jié)合的熒光標(biāo)記的靶標(biāo)分子，使用熒光掃描儀的雙通道分別讀取兩種熒光的強(qiáng)度。通過分析來(lái)自雙通道的合成的微陣列圖像，可以進(jìn)行背景校正，計(jì)算和歸一化每個(gè)探針點(diǎn)上熒光團(tuán)的數(shù)量比率(如Cy5/Cy3)。通過數(shù)據(jù)的解釋，獲取定量的生物信息，并分析實(shí)驗(yàn)的置信度。然而，在雙色微陣列系統(tǒng)中，兩種熒光團(tuán)之間可能會(huì)相互影響。當(dāng)兩種熒光團(tuán)存在光譜重疊，并且同時(shí)存在于處理樣品和對(duì)照樣品的相同靶標(biāo)結(jié)合到芯片上的同一探針區(qū)域時(shí)，兩種熒光團(tuán)之間可能發(fā)生非輻射的相互作用，例如FRET(稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移或福斯特共振能量轉(zhuǎn)移)。由于FRET是一種距離依賴性的熒光團(tuán)相互作用，因此當(dāng)兩種熒光距離較遠(yuǎn)時(shí)，不會(huì)發(fā)生FRET作用。但是實(shí)際情況下，很難確定兩個(gè)熒光團(tuán)之間的距離。同時(shí)，由于一種熒光團(tuán)可能被另一種熒光團(tuán)的激發(fā)光所激發(fā)，并且一種熒光團(tuán)的發(fā)射熒光可能就進(jìn)入另一種熒光團(tuán)的檢測(cè)通道，這被稱作熒光串?dāng)_。FRET和熒光串?dāng)_的產(chǎn)生與熒光的光譜屬性和檢測(cè)儀器的配置有關(guān)。因此，在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，熒光信號(hào)的采集將可能受到FRET和熒光串?dāng)_的干擾。當(dāng)一種熒光團(tuán)(受體)的激發(fā)光譜與另一種熒光團(tuán)(配體)的發(fā)射光譜存在重疊，并且這兩種熒光團(tuán)之間的距離小于10mn時(shí)，這兩個(gè)熒光團(tuán)之間可能發(fā)生非輻射的FRET作用。配體(如Cy3)和受體(如Cy5)稱為FRET熒光對(duì)。配體較受體具有更短的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，以及更高的能量。當(dāng)FRET發(fā)生時(shí)，配體的測(cè)量信號(hào)不能準(zhǔn)確反應(yīng)配體的真實(shí)數(shù)量FRET將減少配體的直接熒光發(fā)射，而將配體的部分能量非輻射的轉(zhuǎn)移給受體，從而干擾配體數(shù)量的測(cè)量。若同時(shí)檢測(cè)受體熒光時(shí)，受體熒光的測(cè)量信號(hào)也將受到干擾，因?yàn)槭荏w除了被激發(fā)光源激發(fā)外，還將接受因FRET作用從配體傳遞的能量。為了消除因FRET而帶來(lái)的測(cè)量干擾，需要選擇合適光譜屬性的熒光團(tuán)，或12者控制熒光團(tuán)之間的距離超越FRET作用范圍，例如使熒光團(tuán)之間的距離大于10nm。但是，在一些實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，不可能嚴(yán)格控制熒光團(tuán)之間的距離，甚至在某些實(shí)驗(yàn)中，需要兩種熒光團(tuán)之間相互靠近。熒光串?dāng)_的發(fā)生通常是因?yàn)闊晒鈭F(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜與測(cè)量?jī)x器激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的重疊。例如，某些情況下，使用配體通道中的配體激發(fā)光可以激發(fā)受體，而受體的發(fā)射光可以進(jìn)入到配體的檢測(cè)通道(當(dāng)受體的吸收光譜與配體通道的配體激發(fā)光存在重疊)。同樣，一些情況下，使用受體通道中的受體激發(fā)光可以激發(fā)配體，而配體的發(fā)射光可以進(jìn)入到受體的檢測(cè)通道中。在一個(gè)理想的微陣列芯片平臺(tái)上(包含特定的熒光團(tuán)和熒光掃描儀組合)，F(xiàn)RET和熒光串?dāng)_都應(yīng)該得到避免，這樣，測(cè)量得到的熒光強(qiáng)度將正比于芯片上熒光團(tuán)的數(shù)目。然而雙色微陣列平臺(tái)上的常用熒光團(tuán)滿足FRET發(fā)生的光譜條件，同時(shí)，芯片上熒光團(tuán)之間的距離難以控制，因此FRET或熒光串?dāng)_難以完全避免。當(dāng)FRET存在時(shí)，需要對(duì)測(cè)量的配體熒光信號(hào)進(jìn)行校正，達(dá)到通過熒光信號(hào)準(zhǔn)確地確定熒光團(tuán)數(shù)目的目的。過去的微陣列實(shí)驗(yàn)中，兩種熒光團(tuán)的強(qiáng)度分別通過熒光掃描儀的兩個(gè)通道(通常為Cy3通道和Cy5通道)直接測(cè)量，沒有進(jìn)行FRET校正與熒光串?dāng)_校正。當(dāng)兩種熒光團(tuán)(例如Cy3與Cy5)同時(shí)存在與芯片上的同一個(gè)探針點(diǎn)上時(shí)，具有更高能量的熒光團(tuán)(例如Cy3)可被看作配體。高能量的熒光團(tuán)可以提供能量，去激發(fā)低能量的熒光團(tuán)；而低能量的熒光團(tuán)卻不能提供足夠的能量去激發(fā)高能量的熒光團(tuán)。當(dāng)芯片上的配體與受體發(fā)生FRET時(shí)，配體熒光信號(hào)將降低，因此部分的配體能量將會(huì)通過非輻射途徑傳遞給受體，而非以光子的形式進(jìn)入熒光檢測(cè)通道。而只有配體發(fā)射波長(zhǎng)的熒光光子才能夠被配體通道的檢測(cè)器接收，而受體發(fā)射波長(zhǎng)的熒光光子與配體非輻射的能量無(wú)法被配體通道的檢測(cè)器接收，因此通過配體的熒光強(qiáng)度將低估芯片上的配體數(shù)量。本發(fā)明提供了一種用于雙色微陣列實(shí)驗(yàn)的可靠的利用三通道熒光掃描儀的熒光強(qiáng)度測(cè)量方案。掃描儀的每個(gè)通道分別接收特定的熒光發(fā)射信號(hào)，整合三個(gè)通道的熒光信號(hào)可以進(jìn)行FRET校正與熒光串?dāng)_校正。這種可靠的熒光測(cè)量方法可以準(zhǔn)確測(cè)量微陣列芯片上的熒光強(qiáng)度，為后續(xù)的微陣列分析提供可靠的數(shù)據(jù)。配體通道指使用配體激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，通過配體發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)；受體通道指使用受體激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，通過受體發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)；FRET通道指使用配體激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，通過受體發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)
發(fā)明內(nèi)容總論此發(fā)明提供了包含F(xiàn)RET校正和熒光串?dāng)_校正的可靠熒光測(cè)量的技術(shù)和設(shè)備。我們首先描述FRET校正方案，然后考慮熒光串?dāng)_的校正。主要包含三個(gè)步驟a)確定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)參數(shù)(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)b)獲取配體通道熒光發(fā)射、受體通道熒光發(fā)射和FRET通道熒光發(fā)射。其中配體通道用于觀察配體熒光，受體通道用于觀察受體熒光，F(xiàn)RET通道用于觀察受體因FRET激發(fā)而產(chǎn)生的敏化發(fā)射。c)通過確定的系統(tǒng)參數(shù)和測(cè)量的熒光發(fā)射強(qiáng)度，通過此發(fā)明的公式計(jì)算完全的熒光強(qiáng)度。熒光信號(hào)的FRET校正配體和受體熒光團(tuán)可以是任意合適的熒光團(tuán)組合。它們可以是商業(yè)化的熒光染料，包括cyanine染料、Alexa染料、Cy5一26—6、Cy5Tl、Cy5T6、Cy5T7、Cy5T8、Sq5T5、Sq5T7，、Sq5T8、Sq5T6、Cy5.5T8、Cy5.5T7、Sq5T2、Sq5Tl、Sq5T4、Sq5T3、Sq5T10、Sq5、Cy5.5T9、Cy5.5T5、Cy5.5T10、Cy5.5、Cy5.5T12和Cy5.5T6。這些熒光染料的結(jié)構(gòu)參見Tu等的論文(NucleicAcidsResearch,26:2797-2802,1998)。這些染料的發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為630-700nm。其他可用的染料包括DY-630、DiD、Dy-635、DY-640、Bodipy630/650、ATTO655和ATTO680，這些染料的結(jié)構(gòu)參見Buschmann等的論文(BioconjugateChemisty,14:195-204，2003)。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用Cy3(配體)和Cy5(受體)染料，它們是常見的花氰染料，包含不同的垸基和苯環(huán)，其結(jié)構(gòu)如下所示Cy3Cy5我們定義々。'。"，^為(假設(shè)不存在配體時(shí))受體的全部發(fā)射熒光，而々。'W為(假設(shè)不存在受體時(shí))配體的全部發(fā)射熒光。當(dāng)熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率保持不變時(shí)，^。'。M，(OT和/r。,。。r分別正比于配體的數(shù)量和受體的數(shù)量。當(dāng)樣品中只存在一種熒光團(tuán)時(shí)，不存在FRET作用，可通過熒光強(qiáng)度定量熒光豐度(液相中，豐度指濃度；固相上，豐度指密度)。當(dāng)微陣列芯片的探針點(diǎn)上同時(shí)存在兩種熒光團(tuán)，F(xiàn)RET干擾或熒光串?dāng)_可能存在。除非實(shí)驗(yàn)中能夠完全排除FRET干擾或熒光串?dāng)_，為了準(zhǔn)確測(cè)量熒光信號(hào)，都需要進(jìn)行FRET校正和熒光串?dāng)_校正。我們首先不考慮系統(tǒng)的熒光串?dāng)_，只進(jìn)行FRET校正。當(dāng)微陣列實(shí)驗(yàn)中使用的熒光團(tuán)光譜滿足FRET發(fā)生的條件(受體的激發(fā)光譜與配體的發(fā)射光譜存在較大重疊)，并且兩個(gè)不同的熒光團(tuán)相互靠近(距離小于IOnm)，可能發(fā)生FRET作用。受體通道的測(cè)量值^"等于全部受體發(fā)射熒光^。'。"。"，，但配體通道的測(cè)量值^郎將因fret作用而降低，從而小于全部配體發(fā)射熒光7^^。"。f。我們使用M^表示FRET通道的測(cè)量值。為了進(jìn)行FRET校正，我們定義了校正因子G。校正因子G在給定的系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。校正因子G可使用下式定義/拜—/,、其中，^^。旨和^""。，分別表示受體淬滅后和淬滅前，參與FRET作用的直接配體發(fā)射熒光。A,^^申。"表示受體因FRET作用而產(chǎn)生的敏化熒光。通常情況下，雙標(biāo)記樣品中同時(shí)存在參與FRET作用的配體和不參加FRET作用的配體。我們稱前者在配體通道的發(fā)射熒光為^w。、稱后者在配體通道的發(fā)射熒光為7"。wD。，。因此，；,。"。r可以使用下式表示,一f;,pos(綜合公式1與公式2，我們可以得到公式3:其中，A。fw(D。旨與^"Aw之和等于實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，用^。"。'表示。i"，是實(shí)際受體敏化熒光，G在一個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。因此，不論配體與受體熒光團(tuán)是否發(fā)生FRET作用，全部配體發(fā)射熒光^。^。旨可用公式3計(jì)算，而全部受體發(fā)射熒光^w"，等于實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光^，'。f。熒光串?dāng)_校正為了全面的校正熒光測(cè)量中的干擾，需要對(duì)熒光串?dāng)_進(jìn)行校正。熒光串?dāng)_源于配體與受體的光譜重疊。為了校正熒光串?dāng)_，^,"^^"w、^"，和^。，可用公式4-5計(jì)算，此方面為Gordon等提出(BiophysicalJournal,74:2702-2713,1998):r，,a./-^.p，,1i,1("--).(/1)(Pi)^)④d匿(ZI)(")(5)、—=."^y-."^T^(6)其中，"等于只包含受體的探針點(diǎn)上受體通道的熒光強(qiáng)度與FRET通道熒光強(qiáng)度的比值，"等于只包含配體的探針點(diǎn)上配體通道的熒光強(qiáng)度與FRET通道的熒光強(qiáng)度比值，-等于只包含配體的探針點(diǎn)上受體通道的熒光強(qiáng)度與FRET通道的熒光強(qiáng)度比值，^等于只包含受體的探針點(diǎn)上配體通道的熒光強(qiáng)度與FRET通道熒光強(qiáng)度比值。這四個(gè)系統(tǒng)因子被稱為熒光串?dāng)_因子，在一個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。因?yàn)橐陨线@些系統(tǒng)因子與系統(tǒng)因子^提供了足夠的信息用于FRET校正，此發(fā)明提供了一種新穎的微陣列芯片，此芯片上包含了FRET校正所需的特定標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l僅含有配體熒光團(tuán)，標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2僅含有受體熒光團(tuán)，標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3含有相同數(shù)量的配體和受體熒光。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1與標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2可能具有相同數(shù)目的熒光團(tuán)。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3中含有的配體與受體數(shù)目也可分別同標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1中的配體和標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2中的受體數(shù)目相同。配體與受體稱為FRET熒光對(duì)，例如Cy3可作為配體，Cy5可作為受體。確定系統(tǒng)因子G當(dāng)前存在一些方法用于確定校正因子G。Chen等(BiophysicalJournal,91:39-41，2006)提出了一種確定校正因子G，這個(gè)方法要求使用兩組同時(shí)包含配體和受體的復(fù)合物，這兩組復(fù)合物中的配體與受體之間距離必須不同，從而其FRET效率不同。其他的確定校正因子G的方法存在各種不同的缺點(diǎn)，例如，有的方法需要特殊的測(cè)量?jī)x器(一種方法需要測(cè)量熒光量子產(chǎn)率)，有的方法需要制備多組同時(shí)包含有配體與受體的復(fù)合物。本文提出兩種新的確定校正因子G的方法，無(wú)需合成這類復(fù)合物，并且能夠直接使用熒光掃描儀測(cè)量，因此適合微陣列平臺(tái)的使用。我們定義系統(tǒng)的響應(yīng)因子^為配體在配體通道的檢測(cè)熒光強(qiáng)度與相同數(shù)目的受體在受體通道的檢測(cè)熒光強(qiáng)度的比值。響應(yīng)因子^在一個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)為常數(shù)。響應(yīng)因子y可用下列公式計(jì)算其中，7。rc和分別代表配體在配體通道的檢測(cè)熒光強(qiáng)度和相同數(shù)目的受體在受體通道的檢測(cè)熒光強(qiáng)度。因此改寫公式3，可以通過公式8計(jì)算校正因子G:乂i)owor^(8)其中Z'&柳,加她c、7'^，和/'^分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3(受體與配體數(shù)目相同，并發(fā)生FRET作用)上實(shí)際的敏化受體發(fā)射熒光、實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光和實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光。^用于確定發(fā)生FRET時(shí)的全部配體發(fā)射熒光。如果標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上無(wú)FRET作用存在，那么公式8的分子與分母均接近0，將給計(jì)算帶來(lái)較大誤差。J'S柳'扭必c啤附、J:c印,。r和/'fl。"。r可以使用公式4—6計(jì)算。為了確定一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)的校正因子G和熒光串?dāng)_因子，需要制備三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，包括只含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1、只含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2和含有相同數(shù)目配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3。因?yàn)樾Ｕ蜃覩十分重要，此發(fā)明提供了一個(gè)微陣列芯片的設(shè)計(jì)，在此芯片上設(shè)計(jì)了一種含有相同數(shù)目配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，受體與配體可以通過混合或綁定結(jié)合的形式存在。一些實(shí)例中，為了構(gòu)建這類標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，可將配體與受體等量混合，其數(shù)量的差異不能大于10%，最好小于5%。微陣列芯片的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上包含相同數(shù)目的配體與受體。這類標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)可以通過預(yù)先制備、綁定一種分子(同時(shí)標(biāo)記有兩個(gè)熒光團(tuán))或綁定一種復(fù)合物(復(fù)合物中包含有等量的配體與受體)實(shí)現(xiàn)，也可以通過在同一探針點(diǎn)上制備等量的配體與受體實(shí)現(xiàn)，還可以通過將等量配體標(biāo)記分子與受體標(biāo)記分子的混合物同芯片上互補(bǔ)分子綁定結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)。一些實(shí)例中，可以將標(biāo)記了其中一種熒光團(tuán)的分子固定在芯片表面，然后將標(biāo)記了另一種熒光團(tuán)的分子與芯片上固定的分子綁定結(jié)合。通過分子的結(jié)合，使得探針點(diǎn)上兩種熒光團(tuán)的數(shù)目相同。另一種制備標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3的方法是，將配體標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的互補(bǔ)分子通過兩種分子的親和力一對(duì)一的綁定結(jié)合，結(jié)合后的復(fù)合物包含等量的配體與受體。這種綁定結(jié)合反應(yīng)可以在溶液中進(jìn)行，然后將結(jié)合后的復(fù)合物通過傳統(tǒng)的方法固定到芯片表面。另一種制備標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3的方法是點(diǎn)制或綁定雙標(biāo)記的復(fù)合物到芯片上。這種復(fù)合物可以通過本文所介紹的制作Cy5-dsDNA-Cy3-順2芯片的方式產(chǎn)生，也可以通過合成的方式產(chǎn)生。另一種制備標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3的方法是將配體標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的相同分子混合后點(diǎn)制到芯片上，或?qū)⑴潴w標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的相同分子混合后與芯片上固定的互補(bǔ)分子綁定結(jié)合?；旌蠘悠分校潴w標(biāo)記的分子與受體標(biāo)記的分子等量，因此芯片探針點(diǎn)上的配體與受體的數(shù)量相同，如本文的Cy5/Cy3-dsDNA-NH2芯片制作過程。確定了一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)1的組合)的校正因子G以后，我們可以通過以下的方法確定另一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)2的組合)的校正因子G。由于熒光串?dāng)_因子"等于僅含有配體的探針點(diǎn)上配體通道的熒光信號(hào)與FRET通道的熒光信號(hào)之比，因此可以用以下的公式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>而校正因子G可以用下列公式表示(Zal,etal.，BiophysicalJournal,86:3923-3939，2004):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>這里，&和^分別表示配體通道的激發(fā)光強(qiáng)和FRET通道的激發(fā)光強(qiáng)；^和^分別表示配體通道和FRET通道的接收效率(分別與配體通道和FRET通道的探測(cè)器增益有關(guān))；^和^分別表示配體與受體的量子產(chǎn)率；^和&分別表示歸一化的配體發(fā)射光譜和受體發(fā)射光譜；^和^分別表示配體通道濾光片組的傳遞系數(shù)與FRET通道濾光片組的傳遞系數(shù)。因此，校正因子G與熒光串?dāng)_因子"的關(guān)系可用下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中，校正因子G與熒光串?dāng)_因子"成正比關(guān)系。由于參數(shù)&、A、&、&、^和&在一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)和熒光掃描儀的組合)中保持不變，與掃描儀的掃描參數(shù)(包含激發(fā)光強(qiáng)和發(fā)射光檢測(cè)器增益)無(wú)關(guān)。因此，比例系數(shù)H(也就是&J(&'&))在一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(包含特定的熒光團(tuán)和熒光掃描儀的組合)中保持不變，與掃描儀的掃描參數(shù)無(wú)關(guān)。我們通過已知的G和i計(jì)算比例系數(shù)//，一旦/f確定后，只要熒光團(tuán)和熒光掃描儀的組合不變，只改變掃描參數(shù)時(shí)，G即可通過"的測(cè)量而計(jì)算。因此，若只改變掃描參數(shù)，微陣列芯片上只需要制備兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，即可測(cè)量G和所有熒光串?dāng)_因子。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)包括只含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1和只含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2上的受體數(shù)目無(wú)需與標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1上的配體數(shù)目相同。這種方法簡(jiǎn)化了確定G的過程。在某些實(shí)例中，為了方便和靈活處理，標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2上的受體數(shù)目與標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1上的配體數(shù)目相同。FRET干擾與熒光串?dāng)_的校正在通常的雙色微陣列實(shí)驗(yàn)中，兩種熒光團(tuán)(配體與受體)分別標(biāo)記兩組樣品，例如使用Cy3作為配體，Cy5作為受體。當(dāng)配體標(biāo)記的樣品靶標(biāo)與受體標(biāo)記的樣品靶標(biāo)與芯片上同一探針點(diǎn)上的探針反應(yīng)時(shí)，不同分子之會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的接近現(xiàn)象。因此，即使配體和受體分別結(jié)合在不同分子上，F(xiàn)RET也可能發(fā)生。常用的商業(yè)化掃描儀中，配體通道不能檢測(cè)到受體熒光，而受體通道也不能檢測(cè)配體熒光，因此-和^均為0，這種條件下，校正因子G可以使用下式計(jì)算G=)CT^——^"(12)其中，^L、M"和^^分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上FRET通道的熒光信號(hào)、受體通道的熒光信號(hào)和配體通道的熒光信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上配體與受體的數(shù)目相同，并且配體與受體之間發(fā)生FRET作用。樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上^。"0。，和^。'a""一r可通過下式計(jì)算^朋4-'丄7腸/Oo/w=MoT)G(13)7腸Wcce，=(14)其中，^w、^^和M^分別表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上FRET通道的熒光信號(hào)、受體通道的熒光信號(hào)和配體通道的熒光信號(hào)。在某些實(shí)例中，此發(fā)明提供了一種微陣列芯片設(shè)計(jì)，芯片上包含一些探針點(diǎn)，用于微陣列系統(tǒng)或儀器的標(biāo)定。微陣列芯片可以包含一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)靶標(biāo)的樣品檢測(cè)探針點(diǎn)以及至少兩個(gè)用于系統(tǒng)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例中，芯片包含兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，用于本文所介紹的標(biāo)定方法。這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)即為只含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)和只含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)。這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)上的熒光團(tuán)數(shù)量可24以相同，也可以不同。在另一些實(shí)例中，此發(fā)明提供了一種包含三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的微陣列芯片設(shè)計(jì)。這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)用于可靠的熒光信號(hào)測(cè)量，包括僅含有配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1、僅含有相同數(shù)量受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2以及含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3。這些微陣列芯片可以用于測(cè)量系統(tǒng)因子(例如G、H、r、"、"、^和P)，并用本文所介紹的方法校正雙色微陣列平臺(tái)上的熒光信號(hào)。這類微陣列芯片的設(shè)計(jì)和制備這類微陣列芯片的方法屬于本發(fā)明的范圍。對(duì)于含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3，配體與受體可以先后放置到同一探針點(diǎn)上，也可以混合后同時(shí)放置到同一探針點(diǎn)上。一種特別簡(jiǎn)便的方法是將一種熒光團(tuán)標(biāo)記的分子首先固定到芯片表面，然后將另一種熒光團(tuán)標(biāo)記的互補(bǔ)分子與芯片上固定的分子結(jié)合。通過這種方式，芯片上將固定等量配體與受體。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1可以通過兩種方式構(gòu)建點(diǎn)制配體標(biāo)記的分子到芯片(也就是通過已知方法固定配體標(biāo)記分子到芯片上)，或者將配體標(biāo)記的分子與芯片上無(wú)標(biāo)記的互補(bǔ)分子綁定結(jié)合。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2可以通過兩種方式構(gòu)建點(diǎn)制受體標(biāo)記的分子到芯片(也就是通過已知方法固定受體標(biāo)記分子到芯片上)，或者將受體標(biāo)記的分子與芯片上無(wú)標(biāo)記的互補(bǔ)分子綁定結(jié)合。微陣列芯片可以包含一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)靶標(biāo)的樣品檢測(cè)探針點(diǎn)以及至少兩個(gè)用于系統(tǒng)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)含有標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)和樣品檢測(cè)探針點(diǎn)的芯片與不同熒光團(tuán)標(biāo)記的樣品混合物反應(yīng)，即可用于特定的實(shí)驗(yàn)與分析。如果樣品中的耙標(biāo)與樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上的探針結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，樣品中標(biāo)記的靶標(biāo)即可綁定到樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上，然后使用三通道掃描儀測(cè)量芯片上的熒光信號(hào)，并使用本文介紹的方法進(jìn)行計(jì)算。這類微陣列芯片可以是專門對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定的芯片，也可以是包含樣品檢測(cè)探針點(diǎn)和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的芯片?！┪㈥嚵行酒谱魍瓿?，即可使用三通道熒光掃描儀讀取芯片上的熒光信號(hào)，通過標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)確定校正所需的系統(tǒng)因子，并進(jìn)行FRET校正。這樣的操作，可以讓使用者在釆集樣品檢測(cè)探針點(diǎn)熒光信號(hào)的同時(shí)，采集用于FRET校正和熒光串?dāng)_校正的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的熒光信號(hào)。使用者也可以使用一張不含樣品檢測(cè)探針點(diǎn)而僅含有標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的微陣列芯片獨(dú)立進(jìn)行校正所需系統(tǒng)因子的測(cè)量與計(jì)算，然后使用另一張含有樣品檢測(cè)探針點(diǎn)的微陣列芯片進(jìn)行樣品分析。系統(tǒng)因子的測(cè)量可以在樣品檢測(cè)前或檢測(cè)后進(jìn)行，也可以在樣品檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行。一旦得到了校正所需的系統(tǒng)因子和樣品檢測(cè)探針點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，即可使用本發(fā)明所描述的方法校正樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，消除FRET干擾和熒光串?dāng)_干擾，獲得能夠反應(yīng)實(shí)際靶標(biāo)數(shù)量的熒光信號(hào)強(qiáng)度。此方法包括使用本文所描述的方法計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上的兩種校正后的熒光強(qiáng)度，消除FRET干擾和熒光串?dāng)_干擾。在一些實(shí)例中，熒光標(biāo)記的靶標(biāo)分子可以是cDNA、合成的寡核苷酸、蛋白或者其他的生物多聚物(如RNA、DNA、mRNA、tRNA、多肽或低聚糖)。同樣，固定在芯片上的探針分子也可以是cDNA、合成的寡核苷酸、蛋白或者其他的生物多聚物(如RNA、DNA、raRNA、tRNA、多肽或低聚糖)。此發(fā)明所涉及的熒光掃描儀是一種能夠讀取二維平面上的熒光信號(hào)的儀器。在某些方面，此發(fā)明所提供的一種三通道熒光掃描儀包含第一個(gè)熒光觀察通道中配置了適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光和適合第一種熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)器(包含發(fā)射濾光片)。第二個(gè)熒光觀察通道中配置了適合第二種熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)器(包含發(fā)射濾光片)。第三個(gè)熒光觀察通道中配置了適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)器(包含發(fā)射濾光片)。為方便理解，這里使用了第一種熒光團(tuán)和第二種熒光團(tuán)的概念代替了配體和受體的概念，第三個(gè)通道即為配體激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，受體發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)例中，掃描儀包括一張含有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)或三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的微陣列芯片，用于確定系統(tǒng)因子。此發(fā)明提供了一種用于計(jì)算配體校正后熒光強(qiáng)度的方法，包含了校正所需系統(tǒng)因子的計(jì)算以及隨后的樣品檢測(cè)探針點(diǎn)熒光信號(hào)的校正。準(zhǔn)確的配體熒光強(qiáng)度可以使用下式計(jì)算G(15)A^'。"c邵/。/"—7^ccepf0/*(16)其中，4幽。，表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上全部配體熒光強(qiáng)度，7腸"，^表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上全部受體熒光強(qiáng)度，/&""*"，(。"表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度，L。旨表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，^"'。r表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光，G可以使用下式計(jì)算得到7(17)其中，"s,"zai一M、ro^和卩^"，分別表示含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光、實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光和實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度。Z為系統(tǒng)響應(yīng)因子，可以用下式表示y=7。"4"(18)其中，八"是僅含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2的受體發(fā)射熒光強(qiáng)度，A。"是僅含有等量配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1的配體發(fā)射熒光強(qiáng)度。另一方面，此發(fā)明提供了一種方法用于在雙色微陣列分析中對(duì)熒光串?dāng)_的校正，至少包含以下步驟(1)提供僅包含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1和僅含有受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2。(2)使用這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)確定串?dāng)_校正因子^、"、^和"。其中，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1在受體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比，"等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1在配體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2在配體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比，"等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2在受體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比。用戶在采集每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上的熒光信號(hào)后，利用這四個(gè)參數(shù)可實(shí)現(xiàn)熒光串?dāng)_校正。這些方法也可以包括使用標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3進(jìn)行G的計(jì)算。用戶可以通過下面的公式校正每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的發(fā)射熒光，消除熒光串?dāng)_對(duì)測(cè)量的影響s咖"』c邵欣D"(a--).("一爐)OD(/-W^(19)(a-0)(or-^)(20)7一^^wP，其中，4wW申。r表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度，^。"w表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，L，^表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光。如果芯片上不僅存在熒光串?dāng)_，還可能發(fā)生F服T，那么可以使用含有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的微陣列芯片(標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1、標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2和標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3)取代含有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)的微陣列芯片(標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1和標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2),標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3用語(yǔ)確定FRET校正因子G。當(dāng)FRET可能發(fā)生時(shí)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3測(cè)量得到的熒光信號(hào)包括配體通道熒光信號(hào)M;、受體通道熒光信號(hào)^^和FRET通道熒光信號(hào)M;。這些測(cè)量值通過下列公式對(duì)熒光串?dāng)_進(jìn)行校正乂S細(xì)te《必c鄰tor=M/i47"、,fl^一M^—M("-靜-爐)(/i)^0)(22)'一waw(a—)(a-咖JDonorJKizo\JU"J/0人、(Pi)(p-(24)其中，"&"她^，加、"D。旨和7'血聊r分別表示含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光、實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光和實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度。這些校正值將用于計(jì)算校正因子G。在一些實(shí)例中，熒光串?dāng)_現(xiàn)象并不顯著，因此可以將校正的步驟進(jìn)行簡(jiǎn)化。當(dāng)僅含有配體的樣品在受體通道中沒有信號(hào)，同時(shí)僅含有受體的樣品在配體通道中沒有信號(hào)時(shí)，熒光串?dāng)_因子^和P接近0。在這種情況下，樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的發(fā)射熒光可以通過下式計(jì)算''〃"(25)Acceptoc=(26)々。"。r-"^DD(27)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的發(fā)射熒光可以通過下式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其中，^u"'^C。,、^。"。r和L，^分別表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度、實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光強(qiáng)度和實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度。M^、^""和M"分別表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上FRET通道、配體通道和受體通道的熒光信號(hào)測(cè)量值。"S,"z^"^、"D。"。r和r血印加分別表示含有等量配體與受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度、實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光強(qiáng)度和實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度。M;、W;和似、分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上FRET通道、配體通道和受體通道的熒光信號(hào)測(cè)量值。因此，用戶可以使用上述的公式對(duì)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)進(jìn)行熒光串?dāng)_和FRET干擾的校正。例如，一個(gè)熟練操作者可以使用上述方法計(jì)算的^咖咖他啤欣、L，階和乙。離來(lái)校正FRET干擾和熒光串?dāng)_，獲得配體的全部發(fā)射熒光和受體的全部發(fā)射熒光。當(dāng)僅含有配體的樣品在受體通道中沒有信號(hào)，同時(shí)僅含有受體的樣品在配體通道中沒有信號(hào)時(shí)，熒光串?dāng)_因子^和^接近0。因此，實(shí)際的發(fā)射熒光/&""^^，、和々。"。f可以通過公式25-27計(jì)算，從而校正FRET干擾和熒光串?dāng)_，獲得樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上配體的全部發(fā)射熒光和受體的全部發(fā)射熒光。另一方面，此發(fā)明提供了一種確定校正因子G的方法，此因子與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有關(guān)。通過公式17、22、23、24計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的發(fā)射熒光h,"威鄉(xiāng)。r、"鄉(xiāng)'。r和^d瞎后，計(jì)算校正因子G。確定校正因子G后，可通過公式15計(jì)算校正后的全部發(fā)射熒光。同樣，當(dāng)僅含有配體的樣品在受體通道中沒有信號(hào)，同時(shí)僅含有受體的樣品在配體通道中沒有信號(hào)時(shí)，熒光串?dāng)_因子^和P接近0。這時(shí)，可以通過公式28-30計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的發(fā)射熒光7'&股',w他邵加、JV鄰斷和/'Do。r后，可利用公式17計(jì)算校正因子G。同時(shí)，本發(fā)明提供了一種新的確定校正因子G的方法。這種方法適用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中掃描儀和熒光團(tuán)沒有改變，而僅有掃描儀的掃描參數(shù)改變的情況。當(dāng)熒光團(tuán)屬性、掃描儀以及掃描參數(shù)都沒有改變時(shí)，校正因子G保持不變。當(dāng)掃描參數(shù)改變時(shí)，校正因子G改變。然后，當(dāng)使用掃描儀的掃描參數(shù)2時(shí)，校正因子G的值可以通過掃描參數(shù)1時(shí)校正因子G的值(^w"")計(jì)算。這樣可以避免重新計(jì)算新的掃描參數(shù)下校正因子G。改變掃描參數(shù)后，無(wú)需重新計(jì)算校正因子G。我們定義自'^為掃描參數(shù)2時(shí)校正因子G的值，它可以通過下式計(jì)算其中，^表示掃描參數(shù)2時(shí)僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)上配體通道熒光信號(hào)與FRET通道熒光信號(hào)的比值，H為比例系數(shù)，可通過下式計(jì)算H-々p咖me敏lGparame^l(32)其中，"w^表示掃描參數(shù)i時(shí)僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)上配體通道熒光信號(hào)與FRET通道熒光信號(hào)的比值，e^"^h表示掃描參數(shù)i時(shí)校正因子G的值，可通過公式17或其他方法確定。掃描參數(shù)1與掃描參數(shù)2的區(qū)別可以是激發(fā)光的光強(qiáng)，也可以是熒光檢測(cè)器的增益。當(dāng)激發(fā)光的光強(qiáng)或熒光檢測(cè)器的增益改變時(shí)，校正因子G均會(huì)發(fā)生變化。為了確定新掃描參數(shù)下的校正因子G，可以通過公式32首先計(jì)算H，然后使用H和公式31計(jì)算新的G值。此發(fā)明的方法可以用于任意的具有較大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)差異的熒光對(duì)。熒光團(tuán)之間應(yīng)具有較大的熒光屬性差異(包括激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng))，以便于熒光團(tuán)的單獨(dú)激發(fā)與檢測(cè)。在一些實(shí)例中，配體的發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)均比受體激發(fā)波長(zhǎng)至少小30mn。在一些實(shí)例中，配體的發(fā)射波長(zhǎng)比受體的激發(fā)波長(zhǎng)至少小50nm。配體和受體可以分別是Cy3和Cy5，也可以是微陣列分析中使用到的其他熒光團(tuán)。圖1顯示了(oligo-2)-NH2分子作為探針固定到微陣列芯片上的點(diǎn)陣模式圖。包含八個(gè)不同濃度的子陣，Dl:0.05uM，D2:0.1uM,D3:0.2uM，D4:0.4線D5:0.8線D6:1.6線D7:3.2線D8:6.4uM。圖2(a)-(i)為Cy5-dsDNA-NH2芯片、Cy3-dsDNA-NH2芯片和Cy5-dsDNA-Cy3-朋2芯片的微陣列圖像。分別使用Cy5通道，Cy3通道和FRET通道掃描獲得。本實(shí)例中，僅使用一個(gè)子陣(探針濃度為1.6"M)計(jì)算系統(tǒng)因子。掃描儀532nm激發(fā)光和640nm激發(fā)光強(qiáng)度均設(shè)為80，570nm和675nm熒光發(fā)射光檢測(cè)器增益均設(shè)為650。圖3(a)-(c)為Cy5/Cy3-dsDNA-NH2芯片的微陣列圖像。分別使用Cy5通道，Cy3通道和FRET通道掃描獲得。八個(gè)子陣的信號(hào)點(diǎn)用來(lái)計(jì)算Cy5與Cy3的信號(hào)強(qiáng)度比。掃描儀532nm激發(fā)光和640nra激發(fā)光強(qiáng)度均設(shè)為80，570nm和675nm熒光發(fā)射光檢測(cè)器增益均設(shè)為650。圖4為Cy5/Cy3-dsDNA-朋2芯片上Cy5與Cy3的信號(hào)強(qiáng)度比。未校正的Cy3信號(hào)與校正后的Cy3信號(hào)分別用于計(jì)算校正前后Cy5與Cy3的信號(hào)強(qiáng)度比。具體實(shí)施例方式這項(xiàng)發(fā)明將實(shí)施方式進(jìn)一步進(jìn)行描述。若無(wú)特殊說明，這里用到的術(shù)語(yǔ)使用它們的原始含義。微陣列和熒光掃描儀已被廣泛使用。通常，微陣列上包含有許多探針點(diǎn)，這些探針點(diǎn)以一定的模式或網(wǎng)格的形式分布在固相基底表面。固相基底可以是任意合適的材料，如玻璃、塑料、尼龍膜或硅片。探針可以使用傳統(tǒng)的方法放置到芯片表面，如點(diǎn)制、印刷、原位雜交或其他合適的方式。芯片或薄板上的點(diǎn)是一組不連續(xù)的網(wǎng)格狀探針點(diǎn)。探針點(diǎn)可以是用于樣品中靶標(biāo)檢測(cè)的探針點(diǎn)，也可以是用于標(biāo)定的質(zhì)控探針點(diǎn)或標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)。通常情況下，一張微陣列芯片上存在96個(gè)探針點(diǎn)，也可以存在超過1000個(gè)的探針點(diǎn)。每個(gè)探針點(diǎn)的直徑在lum到lmm之間。技術(shù)上，印刷的探針點(diǎn)直徑在10nm到500um之間。本申請(qǐng)所述的結(jié)合配對(duì)分子指2個(gè)分子，它們之間具有結(jié)合的親和力。每個(gè)分子稱為配對(duì)成員，每個(gè)配對(duì)成員被認(rèn)為是另一個(gè)的補(bǔ)充，兩者能夠緊密結(jié)合。它們之間的親和力可使得它們反應(yīng)后能形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物。例如，親和素(avidin或str印tavidin)和生物素(biotin)可以作為一組配對(duì)成員，親和素和生物素之間具有較強(qiáng)的親和力。5-50bp長(zhǎng)度的核酸序列與其互補(bǔ)序列雜交后也可以形成穩(wěn)定復(fù)合物，因此它們也可以作為一組配對(duì)成員。配對(duì)成員可以作為中介，依靠其親和力，將不同分子綁定成穩(wěn)定復(fù)合物。配對(duì)成員之一可以與第一種分子(熒光團(tuán)1)結(jié)合形成第一種化合物，另一配對(duì)成員可以與第二種分子(熒光團(tuán)2)結(jié)合形成第二種化合物。這兩種化合物可以通過配對(duì)成員之間的親和力連接，從而將第一種分子與第二種分子結(jié)合在一起，形成更大的復(fù)合物。這個(gè)實(shí)例中，熒光團(tuán)l和熒光團(tuán)2通過過配對(duì)成員之間的綁定結(jié)合而靠近。為了校正雙色微陣列芯片實(shí)驗(yàn)中的熒光強(qiáng)度，我們首先需要確定系統(tǒng)因子，試驗(yàn)中使用Cy5和Cy3作為標(biāo)記熒光團(tuán)，微陣列掃描儀作為熒光檢測(cè)儀器。然而，任意的具有較好激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)分辨差異的熒光對(duì)均可使用。然后，使用確定的系統(tǒng)因子，我們校正了微陣列芯片上的熒光強(qiáng)度。在此芯片上Cy5與Cy3通過雜交結(jié)合于同一探針點(diǎn)上。最后我們比較了校正前后的Cy5與Cy3的信號(hào)比值。寡核苷酸合成所有的寡核苷酸均由TaKaRa公司(寶生物工程有限公司，大連，中國(guó))合成。其細(xì)節(jié)如下表所示。表l實(shí)驗(yàn)中所用的寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實(shí)驗(yàn)中使用的熒光團(tuán)包括Cy3(最大激發(fā)波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為570nm，配體)和Cy5(最大激發(fā)波長(zhǎng)為649nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為670ran,受體)。第一組寡核苷酸(oligo-1)序列均為5'-TCCGTCATCGCTCAAG-3'，但標(biāo)記不同。3'末端標(biāo)記Cy5的版本稱為(oligo-1)-Cy5，3'末端標(biāo)記Cy3的版本稱為(oligo-1)-Cy3，3'末端標(biāo)記Cy3而5'末端標(biāo)記Cy5的版本稱為Cy5-(0ligo-l)-Cy3。第二組寡核苷酸為5'-CTTGAGCGATGACGGATTTTTTTTTTTTTTTT-3'-NH2，簡(jiǎn)稱為(oligo-2)-NH2。其3'末端含有氨基，用于同芯片上的酵基反應(yīng)，將探針固定于芯片上。5'端的16個(gè)堿基于第一組寡核苷酸互補(bǔ)。3'端的16個(gè)T堿基作為尾巴，將5'端的序列支撐起來(lái)，以利于與oligo-l雜交。芯片的構(gòu)建(oligo-2)-NH2分子溶解于DNA點(diǎn)樣緩沖液(博奧生物有限公司，北京，中國(guó))，配制8個(gè)濃度梯度(0.05uM到6.4nM)，配制的濃度梯度溶液按圖1所示的排布點(diǎn)制到微陣列芯片上，點(diǎn)制的微陣列芯片稱為(oligo-3)-Nft芯片。點(diǎn)樣使用SmartArrayer-48微陣列芯片點(diǎn)樣儀(博奧生物有限公司)，基片采用醛基芯片(博奧生物有限公司)。(oligo-1)-Cy5、(oligo-1)-Cy3和Cy5-(oligo-1)-Cy3分別溶解于微陣列雜交緩沖液(5XDenhard1/ssolution,0.2%SDS，3XSSC)，濃度均為1.0uM，各取12pL的溶液分別與(oligo-2)-朋2芯片雜交，構(gòu)建的芯片稱為Cy5-dsDNA-NH2芯片，Cy3-dsDNA-朋2芯片和Cy5-dsDNA-Cy3-朋2芯片。同時(shí)，我們將(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3按1:1混合(兩種分子的終濃度均為1.0wM)，取12yL的溶液與(oligo-2)-冊(cè)2芯片雜交，構(gòu)建的芯片稱為Cy5/Cy3-dsDNA-順2芯片。在42°C水浴條件下，經(jīng)過2小時(shí)的雜交，使用洗液I(0.2免SDS，2XSSC)和洗液II(0.2XSSC)先后清洗芯片，清洗時(shí)間均為4min，洗液溫度為42°C。清洗完畢后，使用1600rpm離心1min。離心后的芯片使用改造的LuxScan-10K/A微陣列芯片掃描儀(博奧生物有限公司)掃描。我們通過增加了一組激發(fā)光與發(fā)射濾光片的組合，使得此微陣列芯片掃描儀可以用于檢測(cè)FRET信號(hào)。改造后的芯片掃描儀具有三個(gè)熒光采集通道，包括Cy3通道(激發(fā)光為532nm，檢測(cè)的發(fā)射光為570nm)、Cy5通道(激發(fā)光為635nm，檢測(cè)的發(fā)射光為675nm)和FRET通道(激發(fā)光為532nm，檢測(cè)的發(fā)射光為675nm)。微陣列圖像使用LuxScan3.0分析軟件(博奧生物有限公司)提取探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度信息。由此，將微陣列圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為信號(hào)強(qiáng)度矩陣。確定微陣列芯片平臺(tái)的系統(tǒng)因子從圖2b和2d中可以看到，僅含有Cy3的芯片在Cy5通道沒有熒光信號(hào)，僅含有Cy5的芯片在Cy3通道也沒有熒光信號(hào)，因此^和^等于0。實(shí)驗(yàn)中，相同濃度的(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3分別與(oligo-2)-NH2雜交，從而構(gòu)建了Cy5-dsDNA-NH2芯片和Cy3-dsDNA-NH2芯片。因?yàn)?oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3的序列相同，并且雜交條件相同，因此Cy5_dsDNA-NH2芯片上的Cy5數(shù)目與Cy3-dsDNA-服2芯片上的Cy3數(shù)目大致相同。系統(tǒng)響應(yīng)因子^可以通過Cy5-ds咖A-服2芯片在Cy5通道的熒光信號(hào)(Figure2a)與Cy3-dsDNA-NH2芯片在Cy3通道的熒光信號(hào)(Figure2e)的比值確定。熒光串?dāng)_因子"可以通過Cy3-dsDNA-NH2芯片上FRET通道(Figure2f)與Cy3通道(Figure2e)的信號(hào)強(qiáng)度比值確定。同樣熒光串?dāng)_因子"可以通過Cy5-dsDNA-NH2芯片上FRET通道(Figure2c)與Cy5通道(Figure2a)的信號(hào)強(qiáng)度比值確定。公式12-14中所用到的測(cè)量值可以通過熒光掃描儀的Cy3通道、Cy5通道和FRET通道分別讀取。為了確定校正因子G，需要制備標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，此探針點(diǎn)上配體與受體數(shù)目相同，并且發(fā)生明顯FRET作用。我們可以通過FRET通道的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)判斷是否發(fā)生了FRET作用。實(shí)驗(yàn)中，我們將Cy5-(oligo-1)-Cy3與(oligo-2)-腿2芯片雜交，構(gòu)建了Cy5-dsDNA-Cy3-NH2芯片。通過咖A圓柱模型計(jì)算，單個(gè)探針上的Cy5與Cy3之間的距離小于10nm，因此存在FRET作用。芯片掃描圖如圖2g-2i所示。理論上，芯片的每個(gè)探針點(diǎn)上含有相同數(shù)目的Cy3與Cy5。熒光串?dāng)_校正后，存在較強(qiáng)的FRET信號(hào)。我們使用公式12和測(cè)量的信號(hào)值計(jì)算校正因子G。確定了G和/后，即可計(jì)算G與^的比例系數(shù)7/。因此，當(dāng)我們改變掃描參數(shù)時(shí)，新的G值可通過新的/值和比例系數(shù)^確定。而新的"值可通過僅含Cy3的探針點(diǎn)上FRET通道熒光與Cy3通道熒光的比值確定。雙色DNA微陣列芯片實(shí)驗(yàn)中的熒光測(cè)量確定了系統(tǒng)因子后，即可測(cè)量樣品檢測(cè)探針點(diǎn)的熒光信號(hào)。微陣列芯片實(shí)驗(yàn)中，通常Cy5標(biāo)記的耙標(biāo)分子與Cy3標(biāo)記的相同靶標(biāo)分子會(huì)結(jié)合到芯片上的相同樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上。由于連接于相鄰DNA上的Cy3與Cy5之間可能產(chǎn)生分子間FRET作用，Cy3的熒光測(cè)量值將會(huì)收到干擾。試驗(yàn)中，我們將Cy5-(oligo-l)與Cy3-(oligo-1)的相同濃度混合物同(oligo-2)-NH2芯片雜交，從而構(gòu)建了Cy5/Cy3-dsDNA-朋2芯片。芯片掃描圖如圖3a-3c所示。由于混合物中(oligo-1)-Cy5與(oligo-1)-Cy3濃度相同，因此每個(gè)探針點(diǎn)上Cy5的數(shù)目與Cy3的數(shù)目大致相同。當(dāng)探針濃度變化時(shí)，Cy5與Cy3的強(qiáng)度比值應(yīng)保持不變。然而從圖4可以看到，Cy5與Cy3的強(qiáng)度比值隨著探針濃度的升高而增大。這是因?yàn)?，隨著探針濃度的升高，分子間的FRET作用增強(qiáng)。通過公式13和14進(jìn)行熒光校正后，在探針濃度變化時(shí)Cy5與Cy3的強(qiáng)度比值基本保持不變。結(jié)果顯示我們的方法可以消除雙色微陣列芯片實(shí)驗(yàn)中的FRET干擾，獲取準(zhǔn)確的熒光信號(hào)。實(shí)例我們利用下列實(shí)例，進(jìn)一步解釋說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不僅僅局限于此實(shí)例。用于基因表達(dá)譜分析的微陣列芯片DNA微陣列是一種有效而常用的高通量分析基因數(shù)目的方法，可用于細(xì)胞中的基因表達(dá)譜分析。這項(xiàng)技術(shù)可以通過熒光信號(hào)分析兩組樣品中mRNA的豐度差異。在雙色微陣列實(shí)驗(yàn)方案中，處理樣品和對(duì)照樣品分別使用Cy5和Cy3標(biāo)記，混合后40與同一張芯片雜交。在基因表達(dá)譜分析中，通過在芯片表面點(diǎn)制cDNA片斷、點(diǎn)制預(yù)先合成的寡核苷酸或原位合成寡核苷酸的方法構(gòu)建微陣列芯片。從處理樣品和對(duì)照樣品中分別提取的mRNA經(jīng)純化、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等操作后，cDNA樣品分別利用配體-dUTP(例如，Cy3-dUTP標(biāo)記對(duì)照樣品)或受體-dUTP(例如，Cy5-dUTP標(biāo)記處理樣品)進(jìn)行標(biāo)記。配體與受體標(biāo)記的樣品混合后變性。去除游離的dCTP后，樣品混合物與芯片雜交。雜交后的芯片通過清洗和干燥處理，通過熒光掃描儀的兩個(gè)通道采集熒光信號(hào)。如果兩組樣品在相同的條件下進(jìn)行的標(biāo)記，并且標(biāo)記效率相同，那么就可以通過熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)比較兩組樣品中相同靶標(biāo)的相對(duì)豐度。熒光圖像經(jīng)數(shù)據(jù)提取和歸一化處理后，通過聚類分析尋找基因表達(dá)差異的信息。在這個(gè)應(yīng)用中，處理樣品的cDNA和對(duì)照樣品的cDNA都將與芯片上的cDNA探針或寡核苷酸探針雜交。當(dāng)來(lái)自于處理樣品和對(duì)照樣品的靶標(biāo)cDNA結(jié)合到芯片上的同一探針點(diǎn)上，并且結(jié)合后的探針點(diǎn)上熒光密度足夠高時(shí)，配體熒光(Cy3)信號(hào)將受到FRET作用的干擾。因此，在確定了特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的(包含特定的熒光團(tuán)、熒光掃描儀及掃描參數(shù)的組合)系統(tǒng)因子后，應(yīng)使用微陣列掃描儀的三個(gè)通道采集熒光信號(hào)，包括配體通道(如Cy3通道)、受體通道(如Cy5通道)和FRET通道(如Cy3激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，Cy5發(fā)射波長(zhǎng)接收)使用我們所提出的熒光測(cè)量方法，Cy3通道的熒光信號(hào)得以校正。然后我們即可以計(jì)算和歸一化兩種熒光信號(hào)比值，執(zhí)行后續(xù)的聚類分析。以上的實(shí)例只是對(duì)本發(fā)明的說明，本發(fā)明并不僅局限于此實(shí)例。參考文獻(xiàn)U.S.PatentDocuments6,661,909B212/2003Youvan，etal.7，209，8364/2007Scherraer，etal.Shalon'etal.,GenomeMethods(1996)6:639-645.Gordon,etal.，BiophysicalJournal(1998)74:2702-2713.Tu,etal.，NucleicAcidsResearch(1998)26:2797-2802.Duggan，etal.，NatureGeneticsSupplement(1999)21:10-14.Hegde，etal.，Biotechniques(2000)29:548-562.Yang,etal.,NatureReviewGenetics(2002)3:579-588.Buschmann,etal.，BioconjugateChemisty(2003)14:195-204,Zal,etal.,BiophysicalJournal(2004)86:3923-3939.Thaler，etal.，BiophysicalJournal(2005)89:2736-2749.Lee,etal.,BiophysicalJournal(2005)88:2939-2953.Chen,etal.，BiophysicalJournal(2006)91:39-41.Patterson,etal.，NatureBiotechnology(2006)24:1140-1150.權(quán)利要求1、一種用于雙色熒光測(cè)量系統(tǒng)的微陣列芯片，包含用于確定熒光測(cè)量校正因子的三種標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，即標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1，僅含配體，而不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2，僅含受體，而不含配體，其數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1上的配體數(shù)量相同；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3，含有等數(shù)量的配體與受體。2、如權(quán)利要求l所述的的芯片，其配體為Cy3，受體為Cy5。3、一種用于雙色熒光測(cè)量系統(tǒng)的微陣列芯片，包含用于確定熒光測(cè)量校正因子的兩種標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)，艮P:標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l，僅含配體，而不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2，僅含受體，而不含配體。4、如權(quán)利要求3所述的的芯片，其配體為Cy3，受體為Cy5。5、一種使用雙色熒光測(cè)量系統(tǒng)，確定微陣列芯片上#針點(diǎn)熒光強(qiáng)度的方法，包含使用權(quán)利要求1的微陣列芯片確定與測(cè)量系統(tǒng)相關(guān)的校正因子G、系統(tǒng)響應(yīng)因子7以及熒光串?dāng)_因子"、"、^和P。6、一種使用雙色熒光測(cè)量系統(tǒng)，確定微陣列芯片上探針點(diǎn)熒光強(qiáng)度的方法，包含使用權(quán)利要求2的微陣列芯片確定與測(cè)量系統(tǒng)相關(guān)的熒光串?dāng)_因子"、"、^和P。7、如權(quán)利要求5所述的方法中，雙色熒光測(cè)量系統(tǒng)使用一組FRET熒光對(duì)，包含一個(gè)配體和一個(gè)受體，配體是Cy3,受體是Cy5。8、一種制作如權(quán)利要求l所述微陣列芯片的方法，包括制備標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3的過程首先固定一個(gè)包含有配體和配對(duì)成員的化合物到芯片上，然后將一個(gè)包含有受體和另一配對(duì)成員的化合物與芯片反應(yīng)。這兩種化合物可以通過配對(duì)成員之間的親和力連接，從而將等數(shù)量的配體與受體結(jié)合在一起。9、一種微陣列芯片掃描儀，用于能夠讀取二維平面上的熒光信號(hào)的儀器，包含第一個(gè)熒光觀察通道，提供適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光和適合第一種熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)器(包含發(fā)射濾光片)。第二個(gè)熒光觀察通道，提供適合第二種熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)器(包含發(fā)射濾光片)。第三個(gè)熒光觀察通道，提供適合第一種熒光團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光和適合第二種熒光團(tuán)發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)器(包含發(fā)射濾光片)。10、如權(quán)利要求9所述的掃描儀，第一種熒光團(tuán)是FRET熒光對(duì)的配體，第二種熒光團(tuán)是FRET熒光對(duì)的受體，第一種熒光團(tuán)可以是Cy3,第二種熒光團(tuán)可以是Cy5。11、一種使用雙色熒光測(cè)量系統(tǒng)準(zhǔn)確地分析微陣列芯片上探針點(diǎn)熒光信號(hào)的方法，包括使用如權(quán)利要求9所述的掃描儀測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1、2和3或樣品檢測(cè)探針點(diǎn)，利用熒光信號(hào)的測(cè)量值，通過下列公式計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上準(zhǔn)確的熒光強(qiáng)度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，；w。r為樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上配體的全部發(fā)射熒光，^w,f為樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上受體的全部發(fā)射熒光，^^。^，^表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度，^。"w表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，L，'^表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光，G可通過下列公式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，^s,"w^豐。r表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光，'D。，表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，7、，^表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度，系統(tǒng)響應(yīng)因子7可以用下式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>4。"(36)其中，4"是標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2的受體發(fā)射熒光強(qiáng)度，L。"是標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l的配體發(fā)射熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1、2和3是芯片上的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，可以在同一張芯片上，也可以在不同芯片上。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l僅含有配體，不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2僅含有受體，不含配體，其數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l上的配體數(shù)量相同；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3，含有等數(shù)量的配體與受體。12、一種在使用配體與受體的雙色微陣列測(cè)量中校正熒光串?dāng)_的方法，包括(1)測(cè)量?jī)H含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1的熒光強(qiáng)度和僅含受體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2的熒光強(qiáng)度；(2)計(jì)算熒光串?dāng)_因子^、p、p和"，其中，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l在受體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比，》等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1在配體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比，^等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2在配體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比，"等于標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2在受體通道的信號(hào)與在FRET通道的信號(hào)之比；(3)測(cè)量芯片上樣品測(cè)量探針點(diǎn)的配體通道信號(hào)M。D、受體通道信號(hào)M^和FRET通道信號(hào)M^;測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3的配體通道信號(hào)M'加、受體通道信號(hào)MV和FRET通道信號(hào)M;;(4)校正熒光串?dāng)_，計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)的直接發(fā)射熒光<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(37)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(38)^(39)校正熒光串?dāng)_，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3的直接發(fā)射熒光:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，^"f^"，表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度，/。。_表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，、。w表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光，7'&"""^^，表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光，7;。"表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，7、，'。"表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度。13、如權(quán)利要求12所述的的方法中，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l在受體通道中沒有信號(hào)，并且標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2在配體通道中沒有信號(hào)時(shí)，熒光串?dāng)_因子^和^接近0，此時(shí)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接發(fā)射熒光可通過下式計(jì)算，消除熒光串?dāng)_的影響.-了Sem"戰(zhàn)必cc一r——:—"^^4=(45)標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接發(fā)射熒光可通過下式計(jì)算，消除熒光串?dāng)_的影響:/"(46)其中7s—"，表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際敏化受體熒光強(qiáng)度，^。旨表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，4"，表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光，m^為樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上fret通道信號(hào)測(cè)量值，m。D表示樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上配體通道信號(hào)測(cè)量值，m〃樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上受體通道信號(hào)測(cè)量值，"s,"^，'。r表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光，"。。"w表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，j、，^表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度，m;表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上fret通道信號(hào)測(cè)量值、似'朋表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上配體通道信號(hào)測(cè)量值，m'"分別表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上受體通道信號(hào)測(cè)量值。14、如權(quán)利要求12所述的方法中，包含使用實(shí)際的發(fā)射熒光z。，消除fret干擾和熒光串?dāng)_，并通過下列公式計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上配體的全部發(fā)射熒光、*■和受體的全部發(fā)射熒光4w，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>15、如權(quán)利要求13所述的方法中，當(dāng)僅含配體的樣品在受體通道中沒有信號(hào)，并且僅含受體的樣品在配體通道中沒有信號(hào)時(shí)，熒光串?dāng)_因子-和^接近0，進(jìn)一步包含使用實(shí)際的發(fā)射熒光/s,,w，、/*，和/。■消除fret干擾和熒光串?dāng)_'并通過下列公式計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上配體的全部發(fā)射熒光/r。'。'fl。"w和受體的全部發(fā)射熒光^w",:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>16、一種確定與測(cè)量系統(tǒng)相關(guān)的校正因子G的方法，包括使用標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的發(fā)射熒光7'&自^^，、7^，和7'Oo"。f，通過下列公式計(jì)算校正因子G:廠——J5^w"z^iri:取。r^(53)其中，^，,表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際敏化受體熒光，7;^表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接配體發(fā)射熒光，J^",表示標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3上實(shí)際的直接受體發(fā)射熒光強(qiáng)度，系統(tǒng)響應(yīng)因子y可以用下式計(jì)算-A。"(54)其中，^"是標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2的受體發(fā)射熒光強(qiáng)度，是標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1的配體發(fā)射熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l、2和3是芯片上的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，可以在同一張芯片上，也可以在不同芯片上。標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)1僅含有配體，不含受體；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)2僅含有受體，不含配體，其數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)l上的配體數(shù)量相同；標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)3，含有等數(shù)量的配體與受體。17、如權(quán)利要求16所述的方法，包含利用每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上實(shí)際的發(fā)射熒光4融w、4，和[,消除FRET干擾和熒光串?dāng)_，并通過下列公式計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)探針點(diǎn)上配體的全部發(fā)射熒光^。'。'D。"。r和受體的全部發(fā)射熒光^。m"，'w<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(55)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(56)18、一種確定校正因子^^—2的方法，^。，*2指在雙色微陣列測(cè)量中，使用掃描儀的掃描參數(shù)2時(shí)的校正因子的數(shù)值，可通過下列公式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(57)其中，A。，"w表示掃描參數(shù)2時(shí)僅含配體的標(biāo)準(zhǔn)探針點(diǎn)上配體通道熒光信號(hào)與FRET通道熒光信號(hào)的比值，//為比例系數(shù)，可通過下式計(jì)算其中，"W"H表示掃描儀的掃描參數(shù)為掃描參數(shù)1時(shí)僅含配體的探針點(diǎn)上配體通道熒光信號(hào)與FRET通道熒光信號(hào)的比值，^a，"^表示掃描參數(shù)！時(shí)校正因子G的值。每組掃描參數(shù)包括選擇配體激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光強(qiáng)度、配體發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器增益和受體發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器增益。全文摘要本文所介紹的發(fā)明提供雙色微陣列芯片測(cè)量系統(tǒng)中可靠測(cè)量熒光信號(hào)的方法和儀器。在雙色熒光實(shí)驗(yàn)中使用兩種熒光團(tuán)標(biāo)記樣品時(shí)，所提供的方法和儀器可以使用戶校正FRET干擾和熒光串?dāng)_。此發(fā)明中包含校正的方法、計(jì)算校正所需系統(tǒng)因子的方法、配套熒光掃描儀和適用于校正過程的微陣列芯片。這些方法通過在Cy5與Cy3之間存在FRET作用的微陣列芯片所證實(shí)。文檔編號(hào)G01N21/64GK101688838SQ200880000688公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年6月11日優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日發(fā)明者徐書寬,疆朱,京程,橙鄧,黃國(guó)亮申請(qǐng)人:博奧生物有限公司;清華大學(xué)