專利名稱：一種抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是感染了結(jié)核分枝桿菌的一種傳染病，是危害人類生命健康的疾病中歷史最久遠、后果最嚴重的疾病之一。在與結(jié)核分枝桿菌接觸中有一半人會被感染，已經(jīng)感染結(jié)核菌的人，終生都將有成為結(jié)核病患者的危險性，在結(jié)核菌感染者中有10 %的人會發(fā)病。結(jié)核病曾經(jīng)在全世界廣泛流行，自1945年后，多種抗結(jié)核化學(xué)藥問世，疫情曾一度緩解。但近年來由于抗結(jié)核藥的研制停滯和結(jié)核分枝桿菌耐藥率增加，全球結(jié)核病疫情再度上升。目前全球約有20億肺結(jié)核帶菌者，結(jié)核患者2000萬，每年有1000萬人新發(fā)病，300 萬人死亡。結(jié)核病是當(dāng)今世界單一致病菌致死率最高的疾病，占世界總死因的第7位。我國是全球22個結(jié)核病高發(fā)國家之一，2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示，全國活動性肺結(jié)核患病率為367/10萬。我國結(jié)核病患者人數(shù)居世界第2位，每年有13萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病疫情上升的原因之一就是耐藥尤其是多耐藥結(jié)核分枝桿菌(multiple drugs resistant-bacilus tuberculosis, MDR-TB)白勺[ii5ft。 TOO求β* 5000 力入$而才|^ 結(jié)核分枝桿菌感染，中國的結(jié)核病耐藥率高達46 %。耐藥結(jié)核病的發(fā)生與流行，將使目前的結(jié)核病治療方法失去效力，從而使結(jié)核病重新成為不治之癥。具有全新作用機制及新作用靶標的抗結(jié)核新藥的研發(fā)將是解決該流行病控制問題的最佳途徑。到目前為止，抗結(jié)核藥篩選的最可靠和實用的方法仍然是采用結(jié)核分枝桿菌作為篩選模型，而該模型最大的問題是結(jié)核分枝桿菌的生長太過緩慢。結(jié)核桿菌分裂周期長，約 18 20小時，因此，采用普通的培養(yǎng)方法篩選抗菌藥物，至少30天才能獲得結(jié)果。為了解決篩選時間長的問題，近年來新的方法不斷產(chǎn)生，比較突出的有(1)基于同位素放射技術(shù)的篩選方法。BACTEC MGIT 960 system可使結(jié)核桿菌的培養(yǎng)時間縮短到9天左右，但是， 存在費用昂貴、放射污染等問題。(2)基于變色反應(yīng)的Microplate Alamar Blue Assay方法，缺點是雜菌也可以引起顏色變化，可能出現(xiàn)假陽性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有篩選方法時間長、費用昂貴、可能出現(xiàn)假陽性等缺陷，提供一種抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
本發(fā)明抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法在結(jié)核分枝桿菌懸液中加入含待篩選藥物的PHBS液和血清，置20 36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天后加入Nitrocefin溶液，繼續(xù)培養(yǎng)20 40min，然后測定OD5tltl值，當(dāng)OD5tltl值小于0. 64時，該待篩選藥物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。當(dāng)OD5tltl值小于0.64時，表明培養(yǎng)體系中內(nèi)酰胺酶的量太少，不足以分解酶底物Nitrocefin，間接反映了培養(yǎng)體系中結(jié)核桿菌的生長被樣本抑制。
具體的，上述方法為配制IX IO8 3X 108CFU/ml的結(jié)核分枝桿菌懸液，加入1 3mg/ml含待篩選藥物的PHBS液和血清，置20 36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天后加入4 6mmol/l的Nitrocefin溶液，繼續(xù)培養(yǎng)20 40min,然后測定OD500值，當(dāng)OD500值小于0. 64 時，該待篩選藥物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。最佳的，前述抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法為在96孔板中加入 2 X 108CFU/ml的結(jié)核分枝桿菌懸液100 μ 1，加入ang/ml含待篩選藥物的PHBS液100 μ 1和血清100μ 1，置36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后加入5mmol/l的Nitrocefin溶液100 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)30min，然后用酶標儀測定OD5tltl值，當(dāng)ODStltl值小于0. 64時，該待篩選藥物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。快速篩選原理結(jié)核分枝桿菌是天然表達β -內(nèi)酰胺酶(Beta-lactamase)的細菌，為胞內(nèi)酶，所以在單位體積內(nèi)細菌數(shù)與酶量成正相關(guān)，因此，可以通過測定酶活力間接估計細菌數(shù)。Nitrocefin是Beta-lactamase的底物，Nitrocefin被水解后顏色有黃色變成粉紅色，肉眼可辯。為了提高靈敏度，可用酶標儀測定Nitrocefin水解產(chǎn)物的OD值，由此建立基于96孔板的抗結(jié)核藥物的高通量篩選模型。有抗菌活性的化合物，抑制細菌分裂，細菌數(shù)不能增加，細菌胞內(nèi)的Beta-lactamase也沒有增加，不能充分水解Nitrocef in， 則Mtrocefin水解產(chǎn)物的OD值小；無抗菌活性的化合物，細菌正常分裂，細菌數(shù)增加，細菌胞內(nèi)的Beta-lactamase增加，充分水解Nitrocef in，則Nitrocefin水解產(chǎn)物的OD值大。實驗方法用滅菌生理鹽水將H37Rv (結(jié)核分枝桿菌)培養(yǎng)物制成2 X 1012 CFU/ mL 的菌懸液，然后稀釋成:2X 10"、2X 101CI、2X 109、2X 108、2X 107、2X IO6 CFU/mL，分別在 96孔板中加入IOOyL菌懸液，依次加入IOOyL人血清、IOOyL的PHBS液(pH = 7.0)和 5mmol/l的Nitrocefin溶液100 μ L，總體積為400 μ L，置36°C培養(yǎng)箱中30min，然后用酶標儀測定OD5tltl值，用異煙胼做陽性對照，不加任何藥物的孔為陰性對照。上述操作的目的是確定能水解Nitrocefin的細菌數(shù)范圍。在本實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)細菌數(shù)為2 X IO9 CFU/mL時，Nitrocefin被水解，OD500值為0. 64。當(dāng)濃度降低至2 X IO8 CFU/mL時，不能水解Nitrocef in，因此，以2 X IO8 CFU/mL為藥物篩選接種量。如果細菌被樣本抑制，則不能水解Mtrocefin，如果樣本無抗結(jié)核桿菌的活性，則培養(yǎng)4天后，細菌數(shù)可達3. 2 X IO9 CFU/mL以上，完全可以水解Nitrocef in。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1、本發(fā)明的本質(zhì)是基于最有代表性意義的結(jié)核分枝桿菌細胞水平體外篩選模型，其檢測結(jié)果具有很強的代表性。2、本發(fā)明所建立的藥物篩選模型可通過酶標板進行測試，相比常規(guī)的細菌篩選模型而言具有樣品用量少，檢測周期短，檢測結(jié)果較為靈敏，同時能實現(xiàn)高通量篩選的優(yōu)點。3、篩選周期短，將結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時間縮短至4天左右。4、篩選費用低，同時不存在污染問題。5、篩選的準確度高。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本篩選方法做一步的闡述說明。實驗材料及其來源結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，來源于貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室。實施例1 快速篩選化合物PW-I (漢防己甲素)、PW-2 (漢防己乙素)、PW-3 (白樺脂酸)、PW-4 ( β -香樹脂醇)和化合物PW-5 (瑞枯靈)是否具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。將化合物用PHBS液溶解，配成ang/mL的PHBS溶液，高壓滅菌后備用。將結(jié)核分枝桿菌H37Rv株配制成2 X IO8 CFU/mL菌懸液，在96孔板中加入100 μ L菌懸液、化合物溶液100 μ L和血清100 μ L，這時化合物溶液的濃度為666 μ g/mL。置36 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 天后每孔加入5mmol/l的Nitrocefin溶液100 μ L，再置36 ！培養(yǎng)箱中30min，然后用酶標儀測定OD5tltl值。用異煙胼做陽性對照，不加任何藥物的孔為陰性對照。結(jié)果陰性對照(即不加入藥物)孔的OD5tltl值為0.65 士 0.12，陽性對照(異煙胼) 孔的 OD5tltl 值為 0. 02 士 0. 014，5 個化合物 PW_1、PW_2、PW_3、PW_4、Pff-5 的 OD5tltl 值為分別為 0. 71 士0. 22,0. 62士0. 16,0. 52士0. 08,0. 15士0. 02,0. 22士0. 07?？梢?，該方法能夠在 4 天左右得到抗結(jié)核篩選結(jié)果，該結(jié)果初步說明樣本PW-4和PW-5具有較強的抑制結(jié)核分枝桿菌繁殖的作用。實施例2、采用傳統(tǒng)試管法篩選化合物PW-I (漢防己甲素)、PW-2 (漢防己乙素)、 PW-3 (白樺脂酸)、PW-4 (β-香樹脂醇)和化合物PW-5 (瑞枯靈)是否具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。1、樣本配置化合物PW-1、PW-2、PW_3、PW_4、Pff-5和陽性對照藥(異煙胼)用50% 的DMSO的水溶液配成lOmg/mL的母液，用細菌濾膜除菌后保存在4°C冰箱中備用。2、抗結(jié)核桿菌試驗
配制培養(yǎng)基量取150mL蒸餾水分別加入0. 7g KH2P04、0. 06g MgS04、0. 15g枸櫞酸鎂、 0. 9g天門冬素、2. Og味精，80°C加熱溶解，冷卻至60°C時加入7. 5g馬鈴薯粉。加全蛋液 250mL及孔雀綠水溶液5mL，混勻。經(jīng)雙層無菌紗布過濾后加甘油3mL、吐溫-80 1. OmL, 0.1 % PHA 1.0 mL、小牛血清10mL、l%硫酸鋅0. 5mL、200y g/mL的煙酸溶液1 ml，充分混勻，即得培養(yǎng)基。被篩選樣本及陽性對照藥(異煙胼)在上述培養(yǎng)基分裝于玻璃大試管時，每個樣本分別稀釋為不同濃度梯度(1000 μ g/mL、800 μ g/mL、400 μ g/mL、200 μ g/mLU00 μ g/ mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL> 12. 5 μ g/mL、6. 25 μ g/mL、5 μ g/mL、4 μ g/mL、3 μ g/mL、2 Ug/mLU μ g/mL)，陰性對照直接加入培養(yǎng)基10 mL，放置斜面，采用巴氏滅菌法間歇滅菌 3d。采用H37Rv結(jié)核分枝桿菌，分散于無菌生理鹽水中，調(diào)菌液濃度為IO4 CFU/mL。取100 μ L 菌液接種于兩種羅氏培養(yǎng)基中，每種樣本接種2個培養(yǎng)管，置5.0% CO2孵箱培養(yǎng)，每日觀察結(jié)核菌生長情況。培養(yǎng)30天后觀察抑菌情況。試驗結(jié)果實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物PW-1、Pff-2、PW-3未表現(xiàn)明顯的抑制結(jié)核桿菌 H37Rv的活性，在濃度為lmg/mL時，仍有大量菌落生長?；衔颬W-4對結(jié)核桿菌H37Rv的最小抑菌濃度為400 μ g/mL,化合物PW-5對結(jié)核桿菌H37Rv的最小抑菌濃度為500 μ g/mL。 實驗結(jié)果重復(fù)3次。通過對上述2個實施例可以看出，本發(fā)明抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法能快速、高效、準確的檢測出化合物是否具備抗結(jié)核分枝桿菌活性，特別是對天然新藥及其先導(dǎo)物的高通量篩選具備操作簡單，檢測樣本量少，檢測周期短，檢測結(jié)果較靈敏的獨特優(yōu)點，為高通量篩選天然新藥及中藥抗結(jié)核活性快速篩選提供了一個高效便捷的實驗途徑。
權(quán)利要求
1.一種抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法，其特征在于在結(jié)核分枝桿菌懸液中加入含待篩選藥物的PHBS液和血清，置20 36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天后加入Nitrocefin 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)20 40min，然后測定OD5tltl值，當(dāng)OD5tltl值小于0. 64時，該待篩選藥物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。
2.按照權(quán)利要求1所述抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法，其特征在于配制 1 X IO8 3 X 108CFU/ml的結(jié)核分枝桿菌懸液，加入1 :3mg/ml含待篩選藥物的PHBS液和血清，置20 36°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天后加入4 6mmol/l的Nitrocefin溶液，繼續(xù)培養(yǎng)20 40min，然后測定OD5tltl值，當(dāng)OD5tltl值小于0. 64時，該待篩選藥物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。
3.按照權(quán)利要求2所述抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法，其特征在于在96孔板中加入2X 108CFU/ml的結(jié)核分枝桿菌懸液100 μ 1，加入ang/ml含待篩選藥物的PHBS 液100 μ 1和血清100 μ 1，置36 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后加入5mmol/l的Nitrocefin溶液 100 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)30min，然后用酶標儀測定OD5tltl值，當(dāng)ODStltl值小于0. 64時，該待篩選藥物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗結(jié)核分枝桿菌藥物的快速篩選方法，在結(jié)核分枝桿菌懸液中加入含待篩選藥物的PHBS液和血清，置20～36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天后加入Nitrocefin溶液，繼續(xù)培養(yǎng)20～40min，然后測定OD500值，當(dāng)OD500值小于0.64時，該待篩選藥物即為抗結(jié)核分枝桿菌的藥物，該方法的本質(zhì)是基于最有代表性意義的結(jié)核分枝桿菌細胞水平體外篩選模型，其檢測結(jié)果具有很強的代表性，可通過酶標板進行測試，具有樣品用量少，檢測周期短，檢測結(jié)果較為靈敏，同時能實現(xiàn)高通量篩選的優(yōu)點，篩選周期短，將結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時間縮短至4天左右，篩選費用低，同時不存在污染問題，篩選的準確度高。
文檔編號C12Q1/18GK102174638SQ20111002027
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者景書灝, 李天磊, 楊再昌, 梁光義, 潘衛(wèi)東 申請人:貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室