專利名稱：生物燃料生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將真菌酶和微生物系統(tǒng)用于工業(yè)加工，具體地說是用于將含淀粉材料 (如生淀粉)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇。
本文中所引用的所有文獻(xiàn)("本文中引用的文獻(xiàn)")和所有引用文獻(xiàn)或本文中所參考的引用文獻(xiàn)，以及源自基因組數(shù)據(jù)庫(GenBank)和本文中提到的其他數(shù)據(jù)庫，均以其全文作為參考。
不承認(rèn)本文中所引用的不同的文獻(xiàn)中任何一種均為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
背景技術(shù)：
植物生物質(zhì)是碳-中和可再生資源和生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，具體來說是纖維素原料轉(zhuǎn)化， 其作為石油的清潔替代品，并因其來源豐富且成本較低而受到大量的關(guān)注。當(dāng)前將淀粉轉(zhuǎn)化為生物乙醇的過程已然建立，但能源成本較高，因此，很明顯需要開發(fā)一種更為合理的工藝過程。
一般，將淀粉轉(zhuǎn)化為生物乙醇的工業(yè)過程過程包含四個(gè)步驟，其包括(i)從生物質(zhì)中提取淀粉，(ii)轉(zhuǎn)化淀粉來生產(chǎn)可發(fā)酵糖類，其再通過(iii)在添加酵母的基礎(chǔ)上發(fā)酵制得乙醇。在最后一步(iv)中乙醇通過蒸餾法進(jìn)行精制和濃縮。提取淀粉是通過濕磨法或干磨法完成的。淀粉可可以通過酸水解或酶水解被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖類(酶水解是目前常用的方法)。當(dāng)?shù)矸郾活A(yù)-處理制得一種粘性淤漿，然后再通過熱處理并在α-淀粉酶作用下發(fā)生液化時(shí)，酶水解開始。對(duì)淀粉進(jìn)行蒸煮，并在加入葡糖糖化酶后進(jìn)行糖化。待混合物冷卻后添加酵母使糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。這一進(jìn)程包括較大的溫度變化(通常在約32_120°C 范圍內(nèi))，其使用大量的熱能，這將大大增加過程的成本。伴隨著提高凈能源產(chǎn)值的目的，生成葡萄糖所需的水解溫度可以降低到發(fā)酵步驟的溫度，因此在同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵(SSF) 之前。研究組目前既側(cè)重于該過程中所使用的改善商業(yè)水解酶，又著重于改善生產(chǎn)該過程有效進(jìn)行所必需的水解酶的微生物。
生淀粉水解酶(RSH)混合物，StargenOOl (Genencor公司)已經(jīng)開發(fā)，其在低溫 (< 480C )下將淀粉轉(zhuǎn)化為糊精，并在SSF過程中將糊精轉(zhuǎn)化成糖類。該混合物含有源自河內(nèi)曲霉的酸穩(wěn)定性α-淀粉酶和源自黑曲霉的葡糖糖化酶。使用RSH酶可以節(jié)省熱能， 因?yàn)槿∠藝娚湔糁?，并且該工藝過程需要更少的水和較少的化學(xué)藥品。
為了消除商品酶的購買費(fèi)用，已經(jīng)以混合培養(yǎng)物方式有效地進(jìn)行SSF，其中一種有機(jī)體用于淀粉分解，而另一種有機(jī)體則用于生產(chǎn)乙醇。淀粉分解的有機(jī)體起到糖化劑的作用，因此可以取代商品葡糖糖化酶的添加。然而，在這些系統(tǒng)中淀粉分解有機(jī)體利用大多數(shù)可溶性淀粉來生長(zhǎng)，其中只留下極少的糖類用于有機(jī)體發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇。
制備淀粉分解的發(fā)酵有機(jī)體可能克服這一缺陷。一種較為經(jīng)濟(jì)-有效的工藝過程如圖2所示，其中，一種有機(jī)體產(chǎn)生足夠量的淀粉分解酶，以未修飾的生淀粉作為唯一碳源維持增長(zhǎng)來生產(chǎn)作為產(chǎn)品的乙醇。將利用酵母的生淀粉應(yīng)用于淀粉轉(zhuǎn)化過程將會(huì)極大的受益于從SS F過程，如降低熱能需求和化學(xué)品使用量。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將會(huì)消除大量與商品酶購置相關(guān)的成本。生產(chǎn)淀粉分解酶和乙醇的基因工程修飾的有機(jī)體適用于綜合生物工藝過程(CBP)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，采用CBP生產(chǎn)乙醇及其副產(chǎn)品將確保商品化學(xué)品和動(dòng)物飼料在生物煉制的工作平臺(tái)上以可持續(xù)發(fā)展的方式進(jìn)行。
基因工程廣泛用于生產(chǎn)具有淀粉行業(yè)所需特征宿主。主要是α -淀粉酶和葡糖淀粉酶在異源宿主中被表達(dá)，以確保相對(duì)于天然宿主有更高的酶生產(chǎn)率。在一個(gè)宿主中對(duì)耐熱酶的表達(dá)以及產(chǎn)生不止一種可取酶的能力可以促使本行業(yè)更具競(jìng)爭(zhēng)力的有機(jī)體的誕生。
表面展示葡糖淀粉酶(例如，Kondo等人，2002)和α -淀粉酶的酵母先前已經(jīng)制得(Shigechi等人，2002)。然而，對(duì)宿主菌株進(jìn)行基因工程修飾來表達(dá)生淀粉水解酶將更為有利。只有極少數(shù)的研究小組報(bào)道了有關(guān)能夠通過利用分泌并展現(xiàn)在酵母表面的米根霉葡糖糖化酶的最早的方式，利用生淀粉作為碳源的酵母菌株的研究結(jié)果(Ashikari et al. , 1989 ；Murai etal. , 1998)。為希望具有更好的淀粉分解活性,并由此使所制得的菌株具有更好的乙醇產(chǎn)率而與葡糖糖化酶組合的源自比斯波鏈球菌(Streptococcus Bovis)的 α _淀粉酶的幾種不同的菌株被制得(Khaw et al. , 2006 ；Shigechi et al. ,2004b)。由地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)制備的α_淀粉酶一直也被用作α_淀粉酶活性的來源。
Kim JH 等人(2010) Biotechnol Lett. February 4th,開發(fā)了一株直接從淀粉生產(chǎn)乙醇的釀酒酵母菌。構(gòu)建了兩個(gè)整合載體，其可以通過脫支活性基因(GAMl)使泡盛曲霉葡糖糖化酶基因(GAl)和德巴利酵母α-淀粉酶基因(AMY)和葡糖糖化酶同時(shí)多重整合到工業(yè)株釀酒酵母的染色體中。Yamakawa等人(2010)Appl. Microbiol. Biotechnol. Feb 24. [Epub ahead of print]表明從原料使用，對(duì)麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AGT1, α -淀粉酶和葡糖糖化酶進(jìn)行共表達(dá)的酵母二倍體菌株可以從原料進(jìn)行間歇式乙醇發(fā)酵。
本發(fā)明的目的是提供一種用于淀粉水解來生產(chǎn)酒精生產(chǎn)過程的有用的酶組合。發(fā)明還描述了一種有益酵母菌株，其中可能會(huì)在發(fā)酵過程具有特殊用途，并且還能夠通過基因工程修飾用來表達(dá)本發(fā)明的酶組合。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)(i)嗜熱棉毛菌TLGl蛋白和扣囊復(fù)膜孢酵母菌SFAl蛋白；或(ii)嗜熱棉毛菌TLGl蛋白和桔林油脂酵母(LKAl)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第一個(gè)方面還包括表達(dá)上述TLGl、SFAl和LKAl蛋白的變種(如，自然生物學(xué)變種、功能等同體、活性片段和融合蛋白)的細(xì)胞。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及一種制備由本發(fā)明的葡糖糖化酶與α-淀粉酶組合構(gòu)成的組合物的方法(即，TLGl與SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)組合)，其包括在適于生產(chǎn)葡糖糖化酶與α-淀粉酶組合的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞(優(yōu)選本發(fā)明的第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞系)。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種含有本發(fā)明的葡糖糖化酶與α-淀粉酶組合 (即，TLGl與SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)組合)的組合物。
本發(fā)明的第四個(gè)方 面提供了一種根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(the Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure),于 2010 年 4 月 I 日存放在 DBVPG的一株保藏編號(hào)為27P(本發(fā)明中稱為“s2”)的釀酒酵母或由其衍生得到的變種或突變體，以及含有相同物質(zhì)的組合物或培養(yǎng)物。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及一種將TLGl與SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合用于從含-淀粉的材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品,例如,酒精的過程。
第六個(gè)方面的發(fā)明涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品，如酒精，從其使用s2或變種或突變體含有淀粉的材料的過程。
本發(fā)明的七方面提供了一種通過本發(fā)明的第二、第五、第六個(gè)方面可獲得或獲得的廣品。


圖1顯示了使用玉米作為原料的常規(guī)乙醇生產(chǎn)過程。摘自http:1Iwm. genencor. com/cms/resources/file/ebf95c076d3afc7/STARGEN% 20Backgrounder. pdf.
圖2玉米來源的常規(guī)乙醇生產(chǎn)工藝的改進(jìn)。加入淀粉分解酵母來使生淀粉在一步法工藝過程中液化、糖化并發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。摘自http://www. Renencor. com/cms/ resources/file/ebf95c076d3afc7/STARGEN% 20Backgrounder. pdf
圖3使用實(shí)施例1中用于產(chǎn)生淀粉酶表達(dá)盒的質(zhì)粒的示意圖。來自ySFI的BGLl 基因在具有XYNSEC的框內(nèi)被泡盛曲霉葡糖淀粉酶(GA)I(I)或者米曲霉葡糖糖化酶基因 (glaA) (2)替代。yEXC2位點(diǎn)將泡盛曲霉amyl 111(3)插入具有XYNSEC的框內(nèi)。將米曲霉葡糖糖化酶基因(glaA) (4)或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(GA) I (5)PGKl啟動(dòng)子和終止子元件插入到y(tǒng)ASAA中。合成密碼子最佳化構(gòu)建體均被制成相似的。釀酒酵母2微米的自主復(fù)制序列(ARS2)是質(zhì)粒和細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶(bla)附加型復(fù)制形成的原因，并且釀酒酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶(URA3)被用作篩選標(biāo)記物。
圖4預(yù)測(cè)在釀酒酵母中表達(dá)的泡盛曲霉(Y294[ySYAG])的sGA I基因的蛋白序列。 XYNSEC分泌信號(hào)用斜體表示。生淀粉水解所必需的葡萄糖淀粉酶中所識(shí)別的序列是縮略寫法fFL(W-597)YVTVTLPA)，還有第二位色氨酸(Tml殘基是雙下劃線標(biāo)記。Gd-1區(qū)以斜體表示并文字下標(biāo)記以單下劃線。Cp-1resion或SBD以斜體表示并在文字下標(biāo)記以雙下劃線(Belshaw and Williamson, 1993 ；Fukuda et al. , 1992)。結(jié)合的在底物過渡態(tài)穩(wěn)定作用和/或基態(tài)中起作用的普通酸性或堿性催化作用的Glu 213和Tyr-85, Trp~87, Arg-89, Asp-90, Trp-154, Glu-214, Arg-339, Asp-343, Trp-351,以突顯的方式表示并在文 字下標(biāo)記以單下劃線?？赡蹾-M基iL位點(diǎn),(殘留NOT，NGS和NGS)帶有下劃虛線，雖然在酵母中表達(dá)時(shí)，只有第一和第三位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)糖化(Chen等人，1994年)。
圖5預(yù)測(cè)在在釀酒酵母中表達(dá)的泡盛曲霉(Y294[ySYAA])的sAMYL III基因的蛋白序列。分泌信號(hào)用斜體及雙下劃線表示。生淀粉水解所必需的葡萄糖淀粉酶中所確宙的序列是縮略寫法(PL(W-597)YVTVTLPAU不有第二位佴氨酸(Trp)殘基是雙下劃線標(biāo)記。區(qū)域I 4以突顯及下劃線的方式表示，并按照由第一次表征所述基因的作者所識(shí)別的序列以縮略語的方式對(duì)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記(Matsubaraet al. ,2004b)。確定用于生淀粉水解的序列在AMYL III中也存在，雖然不能完全縮略(PEWSVTVSLPV與 PLWYVTVTLPA)，并帶有雙下劃線。第二位色氨酸(Trp)也存在。
此外，具有O-糖基化特征的Γ5 jfeg器也被確認(rèn)，并以單下劃線和斜體表示。
縮寫的氨基酸即迦讓_^|,產(chǎn)以及在(源自米曲霉的 TAKA淀粉酶序列的氨基酸序號(hào))，還有EHM 以及1KS34也以文字的格式標(biāo)注于示意圖中。
圖6生淀粉水解表現(xiàn)為在分泌活性淀粉酶的集落周圍出現(xiàn)一個(gè)清楚區(qū)域。分泌 GLAA 的菌株(a)和(d)Y294[yxynsec](對(duì)照菌株)，分泌 GLAA 的菌株(b) Y294 [yASOG]，分泌 GA I 的菌株(c) Y294 [yASAG]、分泌 sGA I 的菌株(e) Y294 [ySYAG]，分泌 GLAA 和 AMYL 111 的菌株(f)，分泌 GA I 和 AMYL III 的菌株(g) Y294 [yAGAA]，分泌 sGA I and sAMYL III 的菌株(h)Y294[ySYAGAA]，以及分泌 GA I 和 sAMYL III 的菌株(i) Y294[yASAGSYAA]在含有生淀粉的瓊脂上生長(zhǎng)，然后用碘溶液染色。
圖7對(duì)于由參考菌株⑴Y294 [yxynsec]和重組淀粉分解酵母菌株(2) Y294[yASOG], (3)Y294[yASAG], (4)Y294[yASAA], (5)Y294[yOGAA], (6)Y294[yAGAA], (7) Y294 [ySYAG]，(8) Y294 [ySYAA]，(9) Y294 [ySYAGAA]，and (10) Y294 [yASAGSYAA]的總淀粉酶活性以nkat g DW細(xì)胞―1表示，而α-淀粉酶活性以⑶g DW細(xì)胞―1表示。可溶性以及生淀粉水解活性在30 °C和pH 5. 4條件下測(cè)定，而α -淀粉酶活性50 °C和pH 5. 4條件下測(cè)定。
圖8Y294[yAGAA]菌株在血清瓶中，在a) 2. 2%的葡萄糖培養(yǎng)基、b) 2%可溶性馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基以及c) 2%的rsyp培養(yǎng)基中(所有的淀粉培養(yǎng)基均添加O. 05%的葡萄糖) 進(jìn)行厭氧培養(yǎng)的發(fā)酵曲線。乙醇、麥芽糖、甘油和醋酸酯的濃度水平均采用高效液相色譜法測(cè)定，還有可發(fā)酵糖(g Γ1)采用苯酚硫酸試驗(yàn)法測(cè)定，均表示在y軸上。細(xì)胞DWfer1)濃度水平表示在次y軸上。
圖9來自嗜熱棉毛菌(TLGl)的合成(密碼子優(yōu)化)葡糖糖化酶基因的DNA 和蛋白質(zhì)序列。成熟蛋白序列(即，不分泌信號(hào)的)本發(fā)明中被稱為SEQ ID NOI。分泌信號(hào)(突出顯示加下劃線)、假.定催化Jillii抅域丄以點(diǎn)線.表丞λ.， 假定淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(雙下劃線和斜體字表示i 2:均采用下列弓丨擎及基本的局部相似性比對(duì)搜索工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行基本的局部相似性比對(duì)搜索并得到相應(yīng)的結(jié)果來獲得 http: //blast, ncb1. nl m. nih. Rov/Blast. cri " *"表不終止密碼子
圖10來自桔林油脂酵母(xsecLKAl)的合成α -淀粉酶基因的DNA和蛋白質(zhì)序列。成熟蛋白序列(即，不分泌信號(hào))本發(fā)明中被稱 SSEQ ID N O : 2。 假定催化.功能結(jié).構(gòu)域丄以點(diǎn).線.表·1.'，假定淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(雙下劃線和斜體字表示)均采用下列引擎及基本的局部相似件比對(duì)搜索工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行基本的局部相似性比對(duì)搜索并得到相應(yīng)的結(jié)果來獲得
http: //blast, ncb1.` nl m. nih. Rov/Blast. cri " * "表不終止密石馬子
圖11來自扣囊復(fù)膜孢酵母菌(SFAl)的合成α -淀粉酶基因的DNA和蛋白質(zhì)序列。成熟蛋白序列(即，不分泌信號(hào))本發(fā)明中被稱為SEQ ID Ν0:3。.假定催化.功直I結(jié).構(gòu)域.J.里點(diǎn).線逢巫1..，假定淀體+5 示^均釆用下列引擎及基本的局部相似件比對(duì)搜索工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行基本的局部相似性比對(duì)搜索并得到相應(yīng)的結(jié)果來獲得
http: //blast, ncb1. nlm. nih. Rov/Blast. cri " * "表不終止密石馬子
圖12本研究中用于產(chǎn)生淀粉酶表達(dá)盒質(zhì)粒示意圖。(a) SFAl基因被插入到載體pBKDl中，產(chǎn)生pSFAl。(b)的xsecLKAl基因被插入到載體pBKDl中，產(chǎn)生pLKAl。(c)TLGl 基因被插入到載體PBKD2中，產(chǎn)生pTLGl。
圖13顯示將EN01P-TLG1-EN0IT元件帶亞克隆到pSFAl來產(chǎn)生質(zhì)粒pTLGSFA的圖示。以類似的方法將EN0IP-TLG1-EN0IT元件插入到pLKA來產(chǎn)生pTLGLKA。
圖14在(A)可溶性淀粉和(b)生淀粉中進(jìn)行淀粉水解會(huì)在分泌活性淀粉酶的周圍顯示出一個(gè)清楚的區(qū)域。(I)泡盛曲霉合成葡糖糖化酶、sGA 1,(2) sGA1、和泡盛曲霉合成α-淀粉酶sAMYL III，(3) sGAI和泡盛曲霉野生型α -淀粉酶AMYL III，(4)桔林油脂酵母α -淀粉酶LKAl，(5)扣囊復(fù)膜孢酵母菌α -淀粉酶SFA，(6) AMYL III，(7) LKA和TLG，(8)5 4和11^，(9)嗜熱棉毛菌葡糖糖化酶TLGl，(10)釀酒酵母yMHIOOO。
圖15在具有葡萄糖(200gL_l)的麗S培養(yǎng)基中釀酒酵母菌株的發(fā)酵性能以(a) 累積糖利用率(每100毫升MNS消耗的葡萄糖克數(shù))和(b)每日葡萄糖的消耗率的形式報(bào)告。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次(± SD)。
圖16具有葡萄糖(150gL_l)和木糖(50gL_l)的MNS培養(yǎng)基中釀酒酵母菌株的發(fā)酵性能以(a)累積糖利用率(每100毫升麗S消耗的葡萄糖克數(shù))和(b)每日葡萄糖的消耗率的形式報(bào)告。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次(±SD)。
圖17具有葡萄糖(IOOgL-1)和木糖(IOOgL-1)的MNS培養(yǎng)基中釀酒酵母菌株的發(fā)酵性能以(a)累積糖利用率(每100毫升麗S消耗的葡萄糖克數(shù))和(b)每日葡萄糖的消耗率的形式報(bào)告。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次(±SD)。
圖18用于在釀酒酵母中對(duì)amyIII進(jìn)行構(gòu)成性表達(dá)的δ -整合載體，pBCFamylIII 的構(gòu)建。
圖19用于在釀酒酵母中對(duì)SgaI進(jìn)行構(gòu)成性表達(dá)的δ -整合載體,pBCFsgal的構(gòu)建。
圖20用于在釀酒酵母中進(jìn)行構(gòu)成性表達(dá)的含有amylIII和SgaI元件的δ -整合載體，pBGA的構(gòu)建。
圖21釀酒酵母SBCF2的半乳糖淀粉分解活性，以SgaI多次整合進(jìn)行釀酒酵母s2 重組，在添加有0.75%酵母浸膏的￥ 0(籲)215((_)&11(1 2xSC_改良肉湯中生長(zhǎng)?；钚?， 在4. 5pH的緩沖液中，在50°C條件下檢測(cè)，表示為nKat (g dw細(xì)胞)_1，是每秒每克干 菌量產(chǎn)生Inmol葡萄糖所需的酶的活力。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次(土SD)。
圖22釀酒酵母LH4的半乳糖淀粉分解活性，以SgaI多次整合進(jìn)行釀酒酵母Hl重組，在添加有0.75%酵母浸膏的￥ 0(籲)2乂5((_)&11(1 2xSC_改良肉湯中生長(zhǎng)?；钚?，在 4.5pH的緩沖液中，在50°C條件下檢測(cè)，表示為nKat(g dw細(xì)胞)_1。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次(土SD)。
圖23工程菌株LH4、sBCF2和他們各自的野生型釀酒酵母Hl和s2在YPD中生長(zhǎng) 72h的無細(xì)胞培養(yǎng)上清液(nKat mL-1)的半乳糖淀粉分解活性。試驗(yàn)在4. 5-5. 0-5. 4-6. OpH 的枸櫞酸-磷酸緩沖溶液(O.1 %可溶性淀粉)中在50°C條件下進(jìn)行。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次(土 SD)。
圖24野生型釀酒酵母s2 (a)和sBCF2 (b)以及sBCF6 (c)工程菌株在GFM培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)。
乙醇和淀粉的濃度(gL-Ι)表示在y軸上。干生物量(gL_l)濃度水平表示在次y軸上。一式三份(土 SD)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
圖25在SFM厭氧生長(zhǎng)的野生型釀酒酵母s2 (a)和sBCF2 (b)以及sBCF6 (c)工程菌株的發(fā)酵性能。乙醇和淀粉的濃度(gL-Ι)表示在y軸上。干生物量(gL-Ι)濃度水平表示在次y軸上。一式三份(土SD)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
圖26將可溶性淀粉放入(在_20°C條件下存放后)含有野生型釀酒酵母s2 (a)和 sBCF2 (b)和sBCF6(c)工程菌株的SFM培養(yǎng)基中保存。
圖27在RSFM培養(yǎng)基中厭氧生長(zhǎng)的野生型釀酒酵母s2 (a)和sBCF2 (b)和sBCF6 (c) 工程菌株的發(fā)酵性能。乙醇和可發(fā)酵糖的濃度(gL-Ι)表示在y軸上。干生物量(gL-Ι)水平表示在次y軸上。一式三份(土SD)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
圖28酵母菌菌株在完全Wollum培養(yǎng)基(A)上和EMM基礎(chǔ)平板(B)上孵育。參考菌株(陰性釀酒酵母DMS 70449 ;陽性糖化酵母ATCC 13007)在30°C條件下培養(yǎng)6天， 然后用碘液染色。
圖29能夠分解淀粉的釀酒酵母菌株(sl_s5),糖化酵母(S. diastaticus)菌株 (ATCC 13007)以及釀酒酵母型菌株(DSM 70449)的YPS發(fā)酵液(按照gL_l的量補(bǔ)加酵母膏，10;蛋白胨，20以及可溶性淀粉，20)中的液體培養(yǎng)物。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的方式獲得 (土SD)。
圖30能夠分解淀粉的釀酒酵母菌株(sl_s5),糖化酵母(S. diastaticus)菌株 (ATCC 13007)以及釀酒酵母型菌株(DSM 70449)的YP發(fā)酵液(按照gL_l的量補(bǔ)加酵母膏，10;蛋白胨，20以及可溶性淀粉，20)中的液體培養(yǎng)物。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的方式獲得 (土SD)。
圖31在添加或沒有添加可溶性淀粉(5gL_l)的酵母基本培養(yǎng)基中的能夠分解淀粉的釀酒酵母菌株(sl_s5)的液體培養(yǎng)物。釀酒酵母DSM70449被用作陰性對(duì)照菌株。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的方式獲得(土SD)。
圖32.能夠分解淀粉的釀酒酵母菌株(sl_s5),糖化酵母(S. diastaticus)菌株 (ATCC 13007)以及釀酒酵母型菌株(DSM 70449)的EMM發(fā)酵液(20gL_l的可溶性淀粉)中的液體培養(yǎng)物。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)的方式獲得(土SD)。
具體實(shí)施方式
術(shù)語詞匯表
本部分意在提供有關(guān)下文所列的單詞和用語(以及恰當(dāng)?shù)恼Z法變種)的解釋說明。此外，對(duì)于本發(fā)明中所用的某些單詞和用語的解釋說明可能在本說明書的其他部分予以補(bǔ)充。
本發(fā)明中所用的單數(shù)形式"a"，""和"the"包括復(fù)數(shù)引用除非另有明確規(guī)定的內(nèi)容。例如，涉及含有“一種化合物”的一種組合物包括對(duì)兩個(gè)或多個(gè)化合物的混合物一種混合物的意思。應(yīng)當(dāng)注意的是"或"這一術(shù)語為其通常使用的詞義，包括"和/或"， 除非上下文中另有規(guī)定。
本發(fā)明所用術(shù)語"大約"一詞，涉及數(shù)值，例如，在50% (±50% )的數(shù)值，優(yōu)選 ±30%、±20%、±15%、±10%、±7%、±5%或±1%。如有必要，可從本發(fā)明 的定義省略"大約"一詞。
在本說明書上下文中，"包含"一詞意味著“包括”。因此，例如，一種“包含”X的組合物或多肽"組成"可以完全由X組成，或可以包括一個(gè)或多個(gè)其他組分。在某些實(shí)時(shí)方式中，"包含"意味著"包括主要地，但不是一定完全地"。
本發(fā)明中所用術(shù)語"對(duì)照"序列是指核酸序列，其可操作地鏈接到一個(gè)多肽-編碼的序列，并允許或調(diào)節(jié)的所述譯碼序列的表達(dá)。對(duì)照序列的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，將包括，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)和其它信號(hào)序列。所述用語"在基本相同的條件下試驗(yàn)"旨在涉及在可以提供有意義的比較的條件下進(jìn)行特性/參數(shù)的比較。因此，用于進(jìn)行比較的條件在對(duì)比較的有效性產(chǎn)生重大影響的試驗(yàn)條件沒有變化的范圍內(nèi)應(yīng)該是相同。必要時(shí)，單詞"基本"從發(fā)明的定義中可省略。
本發(fā)明所用"異源"是指一種核酸或蛋白，其包括一種因人為干預(yù)被操縱而使其位于其處于自然發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)以外的位點(diǎn)的分子。例如，來自一個(gè)有機(jī)體(例如，來自一個(gè)菌株或種)的核酸序列可以導(dǎo)入另一個(gè)有機(jī)體的基因組(例如，另一個(gè)菌株或種的)或另一個(gè)基因組的核酸序列，位點(diǎn)可以移到另一個(gè)基因組或同一有機(jī)體的其他染色體內(nèi)。異源蛋白包括，例如，從異源編碼序列表達(dá)的蛋白或從將不自然地表達(dá)蛋白的細(xì)胞中的重組基因表達(dá)的蛋白。
本發(fā)明的多肽和細(xì)胞可以是"單獨(dú)的"。本發(fā)明中所用術(shù)語單獨(dú)的意指從其自然的狀態(tài)"通過人的手段的方式"改變；亦即，如果其自然發(fā)生，則其從其原始的環(huán)境被更改或刪除，或兩者兼而有之。例如，一種自然發(fā)生并自然存在于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的多肽并不是"單獨(dú)的"，但從其自然狀態(tài)的并存材料中分離出的同一多肽是"單獨(dú)的"，正如本發(fā)明中所采用的該術(shù)語。
術(shù)語"突變體"和"突變"包括任何遺傳材料中可探測(cè)的變化，如，DNA，或任何過程、機(jī)制或這種變化的結(jié)果。其包括基因突變，其中基因的結(jié)構(gòu)(例如DNA序列)改變了、源于任何突變過程的任何基因或DNA，以及由改良基因或DNA序列所表達(dá)的任何表達(dá)產(chǎn)品(如，蛋白質(zhì)或酶)。
術(shù)語"淀粉"是指含有植物的復(fù)合多糖碳水化合物，含有分子式為(C6H1005)x， 其中X可以是任意數(shù)的直鏈淀粉和支鏈淀粉的任何材料。
術(shù)語"顆粒狀淀粉"是指尚未糊化的原料(未修飾)未經(jīng)蒸煮的淀粉。在大約 25°C，淀粉顆粒開始吸水，并隨著溫度的增加，顆粒開始大力振動(dòng)。結(jié)晶度減小，并且當(dāng)?shù)矸酆退膽腋◇w被加熱到臨界點(diǎn)，指定粘貼或糊化溫度以上時(shí)，粒料崩解形成糊狀物。糊化的準(zhǔn)確溫度取決于具體的淀粉，并可以隨時(shí)由技術(shù)人員確定。
術(shù)語"糊化"是指淀粉分子通過蒸煮溶解形成一種粘性的懸浮液。用語"低于糊化溫度"是指低于開始糊化的溫度的溫度。
"操作性鏈接"指的是第一個(gè)核酸序列處于與第二核酸序列存在功能關(guān)系的狀態(tài)。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子操作性鏈接到編碼序列。操作性鏈接的DNA序列在同一閱讀框中，可以是接近或毗連的，并且是兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)所必需的。
本發(fā)明所用術(shù)語"母體多肽"是可以與術(shù)語"參考多肽"互換使用的。若是自然生物學(xué)變種，則母體多肽將是依據(jù)上文(a)所定義的多肽。
若是本發(fā)明的活性片段，則母體多肽將是依據(jù)上文(a)或(b)所定義的多肽。若是本發(fā)明的功能等同體，則母體多肽將是依據(jù)上文(a)、(b)或(C)所定義的多肽。若是本發(fā)明的融合蛋白，則母體多肽將是依據(jù)上文(a)、(b)、(C)或(d)所定義的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，"母體多肽"可以是其序列為本發(fā)明明確例舉的多肽(如SEQ ID NO.1, SEQ IDN0. 3，或 SEQ ID NO. 2)。
"表型"一詞包括由其基因型確定的或受其環(huán)境調(diào)制而成的可檢測(cè)的或外在的細(xì)胞特性。表型的例子包括生產(chǎn)蛋白質(zhì)或化合物的能力、在指定的時(shí)間，基因表達(dá)水平、形態(tài)、生長(zhǎng)速度、酶活性、耐低氧條件等條件下的生產(chǎn)一定數(shù)量的特定的氨基酸的能力。
術(shù)語"多肽"和"蛋白"可以互換使用，并且包括通過肽鍵或修飾肽鍵鏈接的任何氨基酸聚合物(二肽或更大)，不管是天然的還是以合成方法生產(chǎn)的。本發(fā)明中所述多肽可以包括非肽類成份，如碳水化合物基團(tuán)。碳水化合物和其他非肽類取代基可以通過生產(chǎn)多肽的細(xì)胞加入多肽，并將會(huì)因細(xì)胞種類而有所不同。本發(fā)明中所定義的多肽，是就其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)而言的；取代基如碳水化合物基團(tuán)通常不指定，但可能仍然存在。
發(fā)明詳述
如上所述，α -淀粉酶和葡糖淀粉酶的組合已證實(shí)特別適用于在生物乙醇生產(chǎn)過程中對(duì)含淀粉材料的處理。然而，只有某些α-淀粉酶和葡糖淀粉酶才具有水解生淀粉的能力。
大約10%的分解淀粉酶能夠水解原料或未改性淀粉內(nèi)的連接，并且這些酶通常包含淀粉結(jié)合域(SBD) (Coutinho and Reilly, 1997 ;
權(quán)利要求
1.一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)(i)TLGl和 SFAl ;或(ii)TLGl和 LKAl 其中TLGl表示一種蛋白質(zhì)保留有嗜熱棉毛菌TLGl蛋白(優(yōu)選按照SEQ.1D. NO.1的方式排列)的葡糖糖化酶活性的蛋白質(zhì)，SFAl表示保留扣囊復(fù)膜孢酵母菌SFAl蛋白的α-淀粉酶活性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選按照SEQ.1D. NO. 3的方式排列)，和LKAl表示表示保留桔林油脂酵母LKAl蛋白的α -淀粉酶活性的蛋白質(zhì)(優(yōu)選按照SEQ.1D. NO. 2的方式排列)。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其表達(dá)TLGl，SFAl和LKAl。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞是 (i) 一種能夠發(fā)酵水解淀粉生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵有機(jī)體；和/或 ( ) 一種真菌。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求3(ii)所屬的宿主細(xì)胞，其特征在于所述真菌是一種酵母。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述酵母是酵母屬某些種，優(yōu)選釀酒酵母。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述酵母是根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2010年4月I日存放在DBVPG的一株保藏編號(hào)為27P的釀酒酵母或由其衍生得到的變種或突變體。
7.一種用于制備一種由TLGl與SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合組成的組合物的方法，包括培養(yǎng)在制備TLGl與SFAl和LKAl中一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合的合適的條件下，培養(yǎng)根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。
8.一種由TLGl與SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合組成的組合物。
9.一種根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2010年4月I日存放在DBVPG的一株保藏編號(hào)為27P (本發(fā)明中稱為“s2”)的釀酒酵母或由其衍生得到的變種或突變體，以及含有相同物質(zhì)的組合物或培養(yǎng)物。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物為生物學(xué)純品。
11.一種將TLGl與SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合用于從含有淀粉的材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的過程。
12.—種米用根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2010年4月I日存放在DBVPG的一株保藏編號(hào)為27P的s2或由其衍生得到的變種或突變體制備發(fā)酵產(chǎn)品的過程。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的過程，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的過程，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)品
15.一種根據(jù)權(quán)利要求6或9所述的突變體，或者一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的過程，其特征在于所述突變體與s2之間的差異是由存在的一個(gè)或多個(gè)(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))突變的基因組成，優(yōu)選與不會(huì)影響s2的表型的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步修飾過的基因結(jié)合。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求6或9所述的變種，或者一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的過程，其特征在于所述變種表達(dá)一個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3、4、5或多個(gè)個(gè))不被s2表達(dá)并且/或者具有一個(gè)或多個(gè)s2的滅活基因，優(yōu)選含有優(yōu)選與不會(huì)影響s2的表型的一個(gè)或多個(gè)修飾過的基因的異源蛋白。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的變種或過程，其特征在于所述變種表達(dá)一個(gè)或多個(gè)異源α-淀粉酶和/或一個(gè)或多個(gè)異源葡糖淀粉酶。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的變種或過程，其特征在于變種表達(dá)至少一種能夠水解生淀粉的異源α -淀粉酶，或者至少一種能夠水解生淀粉的異源葡糖淀粉酶。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的變種或過程，其特征在于至少一種異源α-淀粉酶含有一個(gè)或多個(gè)的SFA1，LKAl和AMYL III泡盛曲霉多肽。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求18所述的變種或過程，其特征在于至少一個(gè)異葡糖淀粉酶含有TLGl或GA I泡盛曲霉多肽。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求17 20中任意一項(xiàng)所述的變種或過程，其特征在于所述變種表達(dá)與SFAl和/或LKAl結(jié)合的TLGl。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求16所述的變種或過程，其特征在于所述變種和s2(或其突變體)之間的差異由權(quán)利要求16中所陳列的修飾后的基因組成。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求14所述的過程，其特征在于所述含-淀粉材料包括生(未修飾的)淀粉。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求11、14或23所述的過程，其特征在于所述過程包括以下步驟 (i)將淀粉的轉(zhuǎn)化成含-淀粉的材料來生產(chǎn)可發(fā)酵糖；以及 ( )通過發(fā)酵有機(jī)體將對(duì)由步驟(i)制得的可發(fā)酵糖進(jìn)行發(fā)酵。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求24所述的過程，其特征在于步驟(i)包括 (a)淀粉的液化，優(yōu)選在有α-淀粉酶存在條件下進(jìn)行；和 (b)液化材料的糖化，優(yōu)選在有葡糖淀粉酶存在條件下進(jìn)行。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的過程，其特征在于所述過程通過TLGl結(jié)合使用SFAl和LKAl中的一個(gè)或兩個(gè)從含有淀粉的材料制得發(fā)酵產(chǎn)品，并且，其中步驟(i)包括 (a)采用SFAl和/或LKAl(可任選的與一個(gè)或多個(gè)其他的酶結(jié)合)將淀粉液化；以及 (b)采用TLGl(可任選的與一個(gè)或多個(gè)其他的酶結(jié)合)將步驟糖(a)中制得的液化材料糖化。
27.一種依賴于11的根據(jù)權(quán)利要求24所述的過程，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1 6任何一項(xiàng)所述得細(xì)胞被用于步驟(i)以轉(zhuǎn)化含-淀粉材料中的淀粉來生產(chǎn)可發(fā)酵糖，并且，其中所述細(xì)胞還可任意選擇地用于步驟(ii)以發(fā)酵所述可發(fā)酵糖(可任選的與一個(gè)或多個(gè)其他發(fā)酵有機(jī)體結(jié)合使用)。
28.一種依賴于14的根據(jù)權(quán)利要求24所述的過程，其特征在于所述發(fā)酵有機(jī)體是s2或由此衍生的突變體或變種(或相同物質(zhì)的任意組合)，可任選的與一個(gè)或多個(gè)其他發(fā)酵有機(jī)體結(jié)合使用。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求17 20中任意一項(xiàng)所述的過程，其特征在于所述過程包括以下步驟 (i)轉(zhuǎn)化含-淀粉材料中的淀粉來生產(chǎn)可發(fā)酵糖；以及 ( )通過發(fā)酵有機(jī)體發(fā)酵由步驟(i)中制得的所述可發(fā)酵糖，并且，s2變種被用在步驟⑴和(ii)中。
30.一種根據(jù)權(quán)利要求24 29中任意一項(xiàng)所述的過程，其特征在于步驟(i)是通過減少含-淀粉材料的粒徑進(jìn)行的。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求25所述的過程，其特征在于步驟(i) (b)與步驟(ii)同時(shí)進(jìn)行，以使所述糖化和發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行(SSF)。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求25所述的過程，其特征在于步驟(a)和(b)同時(shí)進(jìn)行。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的過程，其特征在于步驟(i) (a), (i), (b)和(ii)同時(shí)進(jìn)行。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求11 33中任意一項(xiàng)所述的過程，其特征在于發(fā)酵產(chǎn)品是酒精(如，乙醇)，并且，其中可任意選擇的，在發(fā)酵之后，所獲得的酒精通過蒸餾的方式進(jìn)行精制和濃縮。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求11 33中任意一項(xiàng)所述的過程，其特征在于所述過程包括所述過程中副產(chǎn)物的回收，其中，副產(chǎn)物可任意地選自酒糟、胚芽、蛋白粉、纖維質(zhì)、粟米油、高蛋白動(dòng)物飼料和生物質(zhì)。
36.一種根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)其特異性TLGl，其特征在于TLG1包括 (a)—種含有如SEQ.1D. NO.1所不序列的多肽； (b)一種如上述(a)中所定義的多肽的天然生物學(xué)變種； (C) 一種如上述(a)或(b)中所定義的多肽的活性片段； (d)一種如上述(a)或(b)中所定義的多肽的活性片段； (e)一種如上述(a)，(b)或(C)中所定義的多肽的功能等同體； (f)123(a) —種含有上述(a)，(b)，(c)或⑷中所定義的多肽的融合蛋白。
37.一種根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)其特異性SFAl，其特征在于所述SFAl包括 (a)—種含有如SEQ.1D. NO. 3所不序列的多肽； (b)一種如上述(a)中所定義的多肽的天然生物學(xué)變種； (C) 一種如上述(a)或(b)中所定義的多肽的活性片段； (d)一種如上述(a)，(b)或(C)中所定義的多肽的功能等同體； (e)一種含有上述(a)，(b)，(c)或(d)中所定義的多肽的融合蛋白。
38.一種根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)其特異性LKAl，其特征在于LKA1包括 (a)—種含有如SEQ.1D. NO. 2所不序列的多肽； (b)一種如上述(a)中所定義的多肽的天然生物學(xué)變種； (C) 一種如上述(a)或(b)中所定義的多肽的活性片段； (d)一種如上述(a)，(b)或(C)中所定義的多肽的功能等同體； (e)一種含有上述(a)，(b)，(c)或(d)中所定義的多肽的融合蛋白。
39.一種通過權(quán)利要求7所述方法獲得的組合物，或者一種通過權(quán)利要求11 35中任意一項(xiàng)所述過程獲得產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及源自嗜熱棉毛菌的TLG1葡糖糖化酶與(i)源自扣囊復(fù)膜孢酵母菌的SFA1α-淀粉酶；和/或(ii)LKAα-淀粉酶的組合。所述酶組合可以表達(dá)在宿主細(xì)胞(如在釀酒酵母)中，或作為酶成分提供。提供了用于制備本發(fā)明的酶組合的方法。本發(fā)明還涉及呈現(xiàn)出酶分解活性和有前途的發(fā)酵性能的酵母菌株。對(duì)于從含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品(特別是酒精)的工藝過程也進(jìn)行了介紹。
文檔編號(hào)C12P19/20GK103038340SQ201080067392
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者威廉·希伯·范齊爾, 塔尼亞·約斯特, 約翰·費(fèi)迪南德·格根斯, 馬林娜·薩伊曼, 洛倫佐·法瓦羅, 瑪麗娜·巴薩利亞, 塞吉奧·卡塞拉 申請(qǐng)人:斯泰倫博什大學(xué), 帕多瓦大學(xué)