專利名稱：異丙醇的制造方法和具有異丙醇生產(chǎn)能力的重組酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用了插入有與異丙醇生物合成相關(guān)的基因簇的具有異丙醇生產(chǎn)能力的重組酵母的異丙醇制造方法和該重組酵母。
背景技術(shù)：
近年來，石油資源的枯竭，提倡削減地球水平的二氧化碳產(chǎn)生量，可預(yù)想今后石油價(jià)格攀升，要求開發(fā)石油代替材料。例如，將通過太陽能由水和二氧化碳通過植物制成的生物質(zhì)、糖、淀粉、油脂、蛋白質(zhì)等進(jìn)行生物轉(zhuǎn)換，從而作為石油代替材料利用的嘗試正在實(shí)用化。作為一例，進(jìn)行了作為使用石油的塑料的代替物質(zhì)，生產(chǎn)來源于植物的聚乳酸、聚琥珀酸丁二醇酯的技術(shù)開發(fā)。另外，在美國、巴西等還在進(jìn)行由糖、淀粉等發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，混合在由石油純化的汽車燃料中使用。
另外，作為涂料、油墨等工業(yè)用溶劑樹脂原料重要的化成品，有丙酮、異丙醇(與2-丙醇含義相同)。異丙醇一直以來以石油為原料合成，但從石油枯竭、削減大氣中的CO2問題出發(fā)，希望使用發(fā)酵工藝從生物質(zhì)合成。到目前為止，已知丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)在發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮和異丙醇(非專利文獻(xiàn) I !Biotechnology, 2nd Edn. , voll, p285_323, 1993)。將來源于丙酮丁醇梭菌的丙酮合成基因?qū)氪竽c桿菌來合成丙酮也是公知的(非專利文獻(xiàn)2:Appl.Environ. Microbiol.，73，1079-1085，1998，專利文獻(xiàn) I :US2008/293125、專利文獻(xiàn) 2 :W02009/008377、專利文獻(xiàn) 3 W0 2009/028582)。另外，除了來源于丙酮丁醇梭菌的丙酮合成基因以外，還報(bào)告了使用導(dǎo)入了異丙醇脫氫酶基因的大腸桿菌來合成異丙醇的例子(非專利文獻(xiàn)3 Appl. Environ.Microbiol.，64，7814-7818，2007)。然而，以大腸桿菌為代表的細(xì)菌類的有機(jī)溶劑耐性低被視為問題，已知用于解決該問題的幾種方法，但對工業(yè)生產(chǎn)有機(jī)溶劑耐性尚不充分(專利文獻(xiàn) 4:W0 2007/146377、專利文獻(xiàn) 5 :W0 2007/130560、專利文獻(xiàn) 6 :W0 2008/073406、專利文獻(xiàn)7:US 6，156，532)。認(rèn)為在大腸桿菌等細(xì)菌類中，細(xì)胞膜對有機(jī)溶劑弱是問題，細(xì)菌類不適合有機(jī)溶劑生產(chǎn)。另一方面，酵母類的有機(jī)溶劑耐性高，但尚未報(bào)告在酵母中導(dǎo)入基因而生產(chǎn)異丙醇、丙酮等有機(jī)溶劑的例子?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :US 2008/293125專利文獻(xiàn)2:W0 2009/008377專利文獻(xiàn)3:W0 2009/028582專利文獻(xiàn)4:W0 2007/146377專利文獻(xiàn)5:W0 2007/130560專利文獻(xiàn)6:TO 2008/073406專利文獻(xiàn)7: US 6，156，532非專利文獻(xiàn)I:Biotechnology, 2nd Edn. , voll, p285-323, 1993
非專利文獻(xiàn)2:Appl. Environ. Microbiol.，73，1079-1085，1998非專利文獻(xiàn)3:Appl. Environ. Microbiol. , 64, 7814-7818，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題因此，本發(fā)明鑒于如上所述的實(shí)際情況，目的在于提供利用酵母通過發(fā)酵工藝以優(yōu)異的生產(chǎn)性制造異丙醇的方法，并提供異丙醇生產(chǎn)能力優(yōu)異的重組酵母。用于解決課題的方法為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過培養(yǎng)導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和編碼由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的一組酶的基因簇(異丙醇合成相關(guān)基因簇)的重組酵母，而能夠高產(chǎn)異丙醇，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明包含以下 (I) (19)。(I)異丙醇的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的重組酵母，從培養(yǎng)物中獲得異丙醇，上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑。(2)根據(jù)(I)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼催化將乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)換成乙酰乙酰輔酶A的反應(yīng)的酶。(3)根據(jù)(2)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因是來源于鏈霉菌屬的微生物的基因(ORFn基因)。(4)根據(jù)(2)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼具有序列號I所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者編碼具有相對于序列號I的氨基酸序列具有80 %以上的一致度的氨基酸序列、且具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)。(5)根據(jù)(I)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，異丙醇生物合成相關(guān)基因簇是選自乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和異丙醇脫氫酶基因中的基因。(6)根據(jù)(I)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述重組酵母中，作為異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和異丙醇脫氫酶基因中本來在該重組酵母內(nèi)部不存在的基因。(7)根據(jù)(5)或(6)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因是來源于丙麗丁醇梭囷的ctfA基因和ctfB基因。(8)根據(jù)(5)或(6)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，乙酰乙酸脫羧酶基因是來源于丙酮丁醇梭菌的adc基因。(9)根據(jù)(5)或(6)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，異丙醇脫氫酶基因是來源于拜氏梭菌的Pdh基因。(10)根據(jù)(5)或(6)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇被導(dǎo)入成為宿主的酵母的基因組內(nèi)。(10)根據(jù)(I)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇被導(dǎo)入成為宿主的酵母的基因組內(nèi)。(11)重組酵母，其中，導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑。(12)根據(jù)(11)所述的重組酵母，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼催化將乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)換成乙酰乙酰輔酶A的反應(yīng)的酶。(13)根據(jù)(12)所述的重組酵母，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因是來源于鏈霉菌屬的微生物的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因(ORFn基因)。(14)根據(jù)(12)所述的重組酵母，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼具有序列號I所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者編碼具有相對于序列號I的氨基酸序列具有80%以上的一致度的氨基酸序列、且具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)。(15)根據(jù)(11)所述的重組酵母，其特征在于，異丙醇生物合成相關(guān)基因簇是選自乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和異丙醇脫氫酶基因中的基因。 (16)根據(jù)(11)所述的重組酵母，其特征在于，作為異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和異丙醇脫氫酶基因中本來在該重組酵母內(nèi)部不存在的基因。(17)根據(jù)(15)或(16)所述的重組酵母，其特征在于，乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因是來源于丙酮丁醇梭菌的ctfA基因和ctfB基因。(18)根據(jù)(15)或(16)所述的重組酵母，其特征在于，乙酰乙酸脫羧酶基因是來源于丙酮丁醇梭菌的adc基因。(19)根據(jù)(15)或(16)所述的重組酵母，其特征在于，異丙醇脫氫酶基因是來源于拜氏梭菌的pdh基因。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，通過導(dǎo)入乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，可以制作具有優(yōu)異的異丙醇生產(chǎn)能力的重組酵母。在本發(fā)明中，通過利用具有異丙醇生產(chǎn)能力的重組酵母，可以提供生產(chǎn)性優(yōu)異的異丙醇的制造方法。即，根據(jù)本發(fā)明所涉及的異丙醇的制造方法，可以提高制造作為燃料、樹脂原料使用的異丙醇時(shí)的生產(chǎn)性，從而可以降低異丙醇生產(chǎn)成本。


圖I是顯示對于# 15-10株、ERGlO/ # 15-10株和ORFn/ # 15-10株經(jīng)時(shí)地測定
異丙醇生產(chǎn)量而得的結(jié)果的特性圖。
具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明所涉及的異丙醇的制造方法是，培養(yǎng)導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑的異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的重組酵母，從培養(yǎng)物中獲得異丙醇。乙釀乙釀輔酶A合成酶基因乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，是編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性、或者由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的基因。其中，有時(shí)也將具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶稱為硫解酶。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因。在使用編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的情況下，與使用編碼具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的情況相比，能夠制作具有非常優(yōu)異的異丙醇生產(chǎn)能力的重組酵母。編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的類型的乙酰乙酰輔酶A合成酶的基因,在例如鏈霉菌屬(Streptomyces)的放線菌中發(fā)現(xiàn)(日本特開2008-61506號公報(bào))，可以使用例如來源于鏈霉菌屬的放線菌的基因。作為該乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，可列舉例如，編碼具有序列號I的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。具有序列號I的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，是在放線菌Streptomycessp. CL190株中發(fā)現(xiàn)的、具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性、且不具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合成酶(日本 特開2008-61506號公報(bào))。編碼具有序列號I的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，可以使用參照日本特開2008-61506號公報(bào)設(shè)計(jì)的一對引物，以從放線菌Sti^ptomyces sp. CL190株獲得的基因組DNA為模板，通過核酸擴(kuò)增法(例如PCR)獲得。另一方面，編碼具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的類型的乙酰乙酰輔酶A合成酶(硫解酶)的基因，可以使用現(xiàn)有公知的基因，即在各種生物中鑒定出的本類型的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因。此外，乙酰乙酰輔酶A合成酶基因是在多數(shù)生物種中存在的甲羥戊酸途徑中所包含的基因。作為一例，可列舉來源于丙酮丁醇梭菌(作為ATCC824保藏)的硫解酶基因。來源于丙酮丁醇梭菌的硫解酶基因記為thlA基因，編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。另外，作為硫解酶基因，例如，可以使用來源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、稱猴(Macaca mulatta)、牛(Bos taurus)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、稻(Oryzasativa)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和科氏梭菌(Clostridium kluyveri)的基因。另外，在本發(fā)明中，作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，不限于編碼來源于放線菌Streptomyces sp. CL190株的具有序列號I的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，還可以是編碼具有相對于序列號I的氨基酸序列具有高類似性的氨基酸序列、且具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的基因。另外，在本發(fā)明中，作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，不限于編碼來源于丙酮丁醇梭菌的具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的硫解酶基因，還可以是編碼具有相對于序列號2的氨基酸序列具有高類似性的氨基酸序列、且具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的基因。這里，高類似性是指例如80%以上的一致度，優(yōu)選為90%以上的一致度，更優(yōu)選為95%以上的一致度，最優(yōu)選為97%以上的一致度。此外，一致度的值是使用檢索序列類似性的程序(也有時(shí)稱為同源性檢索程序)，在將序列號I或2的氨基酸序列與其他氨基酸序列比對時(shí)，作為該其他氨基酸序列中的相對于序列號I或2的氨基酸序列一致的氨基酸殘基的比例而算出的值。另外，在本發(fā)明中，作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，還可以是編碼具有在序列號I的氨基酸序列中替換、缺失、添加或插入了 I個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、且具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的基因。另外，在本發(fā)明中，作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，還可以是編碼具有在序列號2的氨基酸序列中替換、缺失、添加或插入了 I個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、且具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的基因。這里多個(gè)氨基酸是指例如2 30個(gè)氨基酸，優(yōu)選為2 20個(gè)、更優(yōu)選為2 10個(gè)、最優(yōu)選為2 5個(gè)氨基酸。而且，在本發(fā)明中，作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，還可以是與包含編碼序列號I的氨基酸序列的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸的一部或全部在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。另外，在本發(fā)明中，作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因，還可以是與包含編碼序列號2的氨基酸序列的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸的一部或全部在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。這里，在·嚴(yán)格條件下雜交是指在60°C在2XSSC洗滌條件下維持結(jié)合。雜交可以按照J(rèn). SambiOOket al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory (1989)所記載的方法等現(xiàn)有公知的方法來進(jìn)行。如上所述的、編碼具有與序列號I的氨基酸序列不同的氨基酸序列的乙酰乙酰輔酶A合成酶的基因，例如，可以從除Streptomyces sp. CL190株以外的放線菌中分離。另夕卜，編碼具有與序列號2的氨基酸序列不同的氨基酸序列的乙酰乙酰輔酶A合成酶的基因，例如，可以從除丙酮丁醇梭菌(ATCC824)以外的梭菌屬(Clostridium)細(xì)菌中分離。另外，還可以通過將編碼序列號I或2的氨基酸序列的多核苷酸通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法改變來進(jìn)行。為了在堿基序列中引入突變，可以通過Kunkel法或Gapped duplex法等公知方法或依據(jù)這些方法的方法來進(jìn)行，例如，使用利用了定點(diǎn)誘變法的突變引入用試劑盒(例如Mutant-K、Mutant_G (均為商品名、TAKARA 社制))等，或者 LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒(商品名、TAKARA社制)來引入突變。具有與序列號I的氨基酸序列不同的氨基酸序列的乙酰乙酰輔酶A合成酶的活性可以如下評價(jià)。即，首先，將編碼評價(jià)對象蛋白質(zhì)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中使其能夠表達(dá)，通過色譜法等方法純化蛋白質(zhì)。在包含所得的評價(jià)對象蛋白質(zhì)的緩沖液中添加丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A作為底物。然后，例如在所需的溫度(例如10 60°C)下保溫。然后，反應(yīng)結(jié)束后，測定底物的減少量和/或生成物(乙酰乙酰輔酶A)的生成量，從而可以對于評價(jià)對象蛋白質(zhì)，評價(jià)由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的有無及其程度。此時(shí)，在包含所得的評價(jià)對象蛋白質(zhì)的緩沖液中僅添加乙酰輔酶A作為底物，同樣地測定底物的減少量和/或生成物生成量，從而可以對于由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的有無進(jìn)行研究。具有與序列號2的氨基酸序列不同的氨基酸序列的乙酰乙酰輔酶A合成酶的活性可以如下評價(jià)。即，首先，將編碼評價(jià)對象蛋白質(zhì)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞使其能夠表達(dá)，通過色譜法等方法純化蛋白質(zhì)。在包含所得的評價(jià)對象蛋白質(zhì)的緩沖液中添加乙酰輔酶A作為底物。然后，例如在所需的溫度(例如10 60°C)下保溫。然后反應(yīng)結(jié)束后，測定底物的減少量和/或生成物(乙酰乙酰輔酶A)的生成量，從而可以對于評價(jià)對象蛋白質(zhì)，評價(jià)由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的有無及其程度。異丙醇生物合成相關(guān)基因簾異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，是指由編碼參與以乙酰乙酰輔酶A為起始化合物生物合成作為終產(chǎn)物的異丙醇的代謝途徑的酶的多個(gè)基因形成的基因簇。作為參與異丙醇生物合成代謝途徑的酶，可列舉以乙酰乙酰輔酶A為底物合成乙酰乙酸的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、以乙酰乙酸為底物合成丙酮的乙酰乙酸脫羧酶、和以丙酮為底物合成異丙醇的異丙
醇脫氫酶。編碼這些酶的各基因可以從具有異丙醇的生物合成能力的微生物中分離。作為具有異丙醇生物合成能力的微生物，不特別限定，可列舉細(xì)菌。作為具有異丙醇生物合成能力的微生物，可列舉梭菌屬的微生物，不特別限定，可列舉丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharoacetobutylicum)、金黃丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)、生抱梭菌(Clostridium sporogenes)、尸毒梭菌(Clostridium cadaver is)和假破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanomorphum)。其中，優(yōu)選使用來源于全基因組序列已被分析的丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的異丙醇生物合成相關(guān)基因簇。特別是作為乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因，可以使用來源于丙酮丁醇梭菌的CtfA基因和ctfB基因。由ctfA基因所編碼的蛋白質(zhì)的氣基酸序列不于序列號3，由ctfB基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號4。另外，作為乙酰乙酸脫羧酶基因，可以使用來源于丙酮丁醇梭菌的adc基因。由adc基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號5。另夕卜，異丙醇脫氫酶基因可以使用來源于拜氏梭菌的Pdh基因。由pdh基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號6。除了上述的CtfA基因以外，作為乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(α亞基)基因，還可使用例如，來源于大腸桿菌、索氏志賀菌(Shigella sonnei)、軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)、非共生發(fā)光桿菌(Photorhabdus asymbiotica)、臘樣芽抱桿菌(Bacilluscereus)、克氏朽1 樣酸桿菌(Citrobacter koseri)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、艱難梭菌(Clostridium difficile)和拜氏梭菌的基因。另外，除了上述的ctfB基因以外，作為乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(β亞基)基因，還可以使用來源于大腸桿菌、克氏朽1檬酸桿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、漢堡硝化桿菌(Nitrobacterhamburgensis)、釀胺鏈球菌、艱難梭菌和韋氏芽抱桿菌(Bacillus weihenstephanensis)的基因。另外，除了 adc基因以外，作為乙酰乙酸脫羧酶基因，可以使用來源于糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)、除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、豌豆根瘤菌(Rhizobium Ieguminosarum)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)、青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)、土拉熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)和拜氏梭菌的基因。另夕卜，除了 pdh基因以外，作為異丙醇脫氫酶基因，可以使用來源于深紅紅球菌(Rhodococcusruber)的基因。
另外，作為異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，不限于上述基因，還可以是來源于丙酮丁醇梭菌的ctfA基因、ctfB基因和adc基因、以及來源于拜氏梭菌的pdh基因的同源基因。同源基因可以對存儲(chǔ)了基因的堿基序列、蛋白質(zhì)的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫通過使用Blast、Fasta等公知的算法的同源性檢索來特定。使用數(shù)據(jù)庫特定的同源基因可以通過公知的方法從微生物分離而使用。即，以從微生物提取的基因組DNA為模板，使用基于所特定的同源基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物，通過核酸擴(kuò)增法來獲得包含同源基因的核酸片段。另外，對于如上所述的具有異丙醇生物合成能力的梭菌屬微生物，也可以通過公知的方法制作cDNA文庫，特定與基于來源于丙酮丁醇梭菌的ctfA基因、ctfB基因和adc基因、以及來源于拜氏梭菌的Pdh基因的堿基序列設(shè)計(jì)的探針特異性地雜交的cDNA，從而獲得如上所述的來源于具有異丙醇生物合成能力的梭菌屬微生物的同源基因。此外，來源于丙酮丁醇梭菌的ctfA基因、ctfB基因和adc基因、以及來源于拜氏梭菌的Pdh基因的同源基因的獲得方法不限于上述方法，可以應(yīng)用任何方法。

向宿主酵母的轉(zhuǎn)化上述的“乙酰乙酰輔酶A合成酶基因”和“異丙醇生物合成相關(guān)基因簇”被插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，從而被導(dǎo)入宿主酵母。這里，作為宿主酵母，只要能夠表達(dá)本發(fā)明的基因就不特別限定。可列舉例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等酵母。另外，作為宿主酵母，在使用具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的情況下，特別優(yōu)選使用油脂生產(chǎn)能力高的酵母。由于在脂質(zhì)代謝途徑中丙二酸單酰輔酶A成為底物的一部分，因而在油脂生產(chǎn)能力高的酵母中，丙二酸單酰輔酶A的合成速度和/或合成量高。因此，在使用具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的情況下，通過使用油脂生產(chǎn)能力高的酵母，可期待異丙醇生產(chǎn)性的提高。作為這樣的油脂生產(chǎn)能力高的酵母，可列舉例如，粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、細(xì)紅酵母(Rhodotorulagracilis)、高山被抱霉(Mortierella alpina)、斯達(dá)油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、絲抱酵母(Trichosporon sp·)、解脂復(fù)膜抱酵母(Saccharomycopsis Iipolytica)、馬格內(nèi)抱霉(Endomyces magnusii)、淺白隱球酵母(Cryptococcus albidus)、圓紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides)和漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)。在以酵母為宿主的情況下，表達(dá)載體優(yōu)選能在宿主酵母中自主復(fù)制，并且包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、上述基因、轉(zhuǎn)錄終止序列。另外，表達(dá)載體中還可以含有控制啟動(dòng)子活性的基因。另外，上述的“乙酰乙酰輔酶A合成酶基因”和“異丙醇生物合成相關(guān)基因簇”優(yōu)選被導(dǎo)入宿主酵母的染色體上。在染色體上導(dǎo)入有這些基因的重組酵母中，這些基因能夠穩(wěn)定地高表達(dá)，從而可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的異丙醇生產(chǎn)能力。此外，對于將這些基因?qū)氲饺旧w上不特別限定，可以適宜使用現(xiàn)有公知的方法。作為一例，可以使用利用與宿主酵母的染色體的同源重組的方法。另外，上述的“乙酰乙酰輔酶A合成酶基因”和“異丙醇生物合成相關(guān)基因簇”優(yōu)選以多拷貝被導(dǎo)入宿主酵母中的染色體上。染色體上以多拷貝導(dǎo)入有這些基因的重組酵母中，這些基因變得高表達(dá)，從而能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)異的異丙醇生產(chǎn)能力。此外，對于將這些基因以多拷貝導(dǎo)入染色體上不特別限定，可以適宜使用現(xiàn)有公知的方法。作為一例，可列舉使用多拷貝導(dǎo)入型的載體的方法。在以酵母為宿主的情況下，使用例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、畢赤酵母等。此時(shí)，作為啟動(dòng)子只要是能夠在酵母中進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)的即可，不特別限定，可列舉例如gall啟動(dòng)子、gallO啟動(dòng)子、熱激蛋白質(zhì)啟動(dòng)子、MFa I啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、AOXl啟動(dòng)子等。作為對酵母導(dǎo)入重組載體的導(dǎo)入方法，只要是在酵母中導(dǎo)入DNA的方法即可，不特別限定，例如電穿孔法[Becker, D. M. , et al. :Methods. Enzy mol.，194:182-187 (1990)]、原生質(zhì)球法[Hinnen, A. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 75:1929-1933 (1978)]、乙酸鋰法[Itoh, H. J. Bacteriol. , 153:163-168(1983)]等。另外，宿主酵母中也可以具有上述的“異丙醇生物合成相關(guān)基因”中的至少I種以上的內(nèi)部存在基因。這種情況下，導(dǎo)入上述的“異丙醇生物合成相關(guān)基因”中的除了內(nèi)部存在基因以外的基因即可。異丙醇的制造通過在含有葡萄糖等碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)導(dǎo)入有上述的“乙酰乙酰輔酶A合成酶基因”和“異丙醇生物合成相關(guān)基因簇”的重組酵母，從而進(jìn)行異丙醇的生物合成。一般來說，即使為了賦予或增強(qiáng)目的物質(zhì)的生產(chǎn)能力而在酵母中導(dǎo)入規(guī)定的基因也不能實(shí)現(xiàn)所預(yù)期的目的的情況也不少。作為原因，可列舉穩(wěn)定且以充分的量表達(dá)來源于外來生物種的基因是困難的。另外，還可列舉可能細(xì)胞內(nèi)不存在對于異丙醇的生物合成充分的量的乙酰乙酰輔酶A。例如，在2分子乙酰輔酶A通過硫解酶結(jié)合而合成乙酰乙酰輔酶A的情況下，該反應(yīng)的平衡傾向于由乙酰乙酰輔酶A合成乙酰輔酶A的方向。因此認(rèn)為，如果沒有使所合成的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)換成下一物質(zhì)的強(qiáng)的反應(yīng)，則難以向乙酰乙酰輔酶A合成方向推進(jìn)。此外，作為培養(yǎng)導(dǎo)入有上述的“乙酰乙酰輔酶A合成酶基因”和“異丙醇生物合成相關(guān)基因簇”的酵母時(shí)的培養(yǎng)條件，不特別限定，使用符合宿主酵母的營養(yǎng)缺陷型和/或耐藥性的培養(yǎng)基在通常的條件下培養(yǎng)即可。另外，所合成的異丙醇存在于培養(yǎng)基中，因而可以從通過離心分離等方法從培養(yǎng)基分離菌體之后的上清級分中獲得異丙醇。為了從上清級分中分離異丙醇，例如，在上清級分中添加乙酸乙酯和甲醇等有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢?。分離成水層和溶劑層，從溶劑層中提取異丙醇。實(shí)施例以下，使用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于以下實(shí)施例。〔實(shí)施例I〕在本實(shí)施例中，制作導(dǎo)入有作為乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的來源于Streptomyces sp. CL190株的ORFn基因或來源于釀酒酵母的ERG10基因、作為乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的來源于丙酮丁醇梭菌的ctfA基因和ctfB基因、作為乙酰乙酸脫羧酶的來源于丙酮丁醇梭菌的adc基因、和作為異丙醇脫氫酶基因的來源于拜氏梭菌的pdh基因的重組酵母，研究異丙醇生產(chǎn)能力。此外，ORFn基因編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合成酶。ERG10基因編碼具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合成酶。在本實(shí)施例中，首先，使用具有ctfA基因、ctfB基因和adc基因的表達(dá)載體(pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB)將這些基因?qū)肴旧w中，篩選出丙酮生產(chǎn)能力優(yōu)異的重組酵母。然后，對篩選出的重組酵母，使用具有Pdh基因的表達(dá)載體(pDI626PGK-T-iroH)，進(jìn)一步將該基因?qū)肴旧w中，篩選出異丙醇生產(chǎn)能力優(yōu)異的重組酵母。接著，在篩選出的重組酵母中，使用具有ORFn基因的表達(dá)載體(pESCpgkgap-HIS-ORFn)或具有ERGlO基因的表達(dá)載體(pESCpgkgap-HIS-ERG10)，進(jìn)一步將任一基因?qū)肴旧w中，評價(jià)異丙醇生產(chǎn)能力。此外，在本實(shí)施例中，作為酵母，使用釀酒酵母YPH499(Stratagene社制)。YPH499的培養(yǎng)使用以下培養(yǎng)基。YPD培養(yǎng)某2%細(xì)菌蛋白胨(DIFC0社制)
1%細(xì)菌酵母提取物(DIFC0社制)2% D-葡萄糖(和光純藥社制)SD(-URA-TRP-HIS)SD培養(yǎng)基使用BIOlOl社制的產(chǎn)品。SD (-URA-TRP-HIS)培養(yǎng)基使用除去了 SD培養(yǎng)基的尿嘧啶、色氨酸、組氨酸后的產(chǎn)物。另夕卜，酵母YPH499的基因組DNA按照以下方法調(diào)制。首先，將釀酒酵母YPH499 (Stratagene社制)在3ml的YPD培養(yǎng)基中在30°C培養(yǎng)I天。將培養(yǎng)液I. 5ml供給QIAGEN社制基因組DNA調(diào)制試劑盒(Gentra Puregene Yeast/Bact. kit)調(diào)制基因組DNA。< pESCpgkgap-HIS-ORFn 的制作>pDI626PGKpro 的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)SacI-PpgklFW :5’ TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG 3’(序列號7)SacII-PpgklRV :5，ATA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG 3，(序列號8)模板酵母YPH499的基因組DNA (O. 4 μ g)反應(yīng)液含有Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Pfu Ultra II 反應(yīng)緩沖液)(Stratagene)、IOnmol dNTP>I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase(Pfu Ultra
IIfusion HS DNA 聚合酶)(Stratagene)的 5O μ I 溶液反應(yīng)95°C5 分鐘 _(95°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 25 個(gè)循環(huán)-72 °C 3 分
鐘_4°C儲(chǔ)備PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCR purificationkit (MinElute PCR純化試劑盒)進(jìn)行純化。將所得的擴(kuò)增片段用限制性酶SacI和SacII消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下712bp的片段,使用QIAGEN社制MinElute Gel extractionkit (MinElute凝膠提取試劑盒)進(jìn)行純化。與同樣地用限制性酶SacI和SacII消化后的PDI626GAP ((APP. Env. Micro.，2009, 5536-5543))載體連接。將所得的序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制成了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pDI626PGKpro。
pDI626PGK 的制作在以下條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)SalI-TpgklFff :5，TTA AGT CGA CAT TGA ATT GM TTG AM TCG ATA GAT C 3，(序列號9)KpnI-TpgklRV2 :5，TTA AGG TAC CGC TTC AAG CTT ACA CAA CAC 3，(序列號 10)模板酵母YPH499的基因組DNA (O. 4 μ g)反應(yīng)液含有Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液 反應(yīng)95°C5 分鐘 _(95°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 25 個(gè)循環(huán)-72 °C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備PCR反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCR purification kit進(jìn)行純化，然后用限制性酶SalI和KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下330bp的片段，并使用QIAGEN社制MinElute Gel extraction kit進(jìn)行純化。與用限制性酶SalI和KpnI消化后的上述pDI626PGKpix)載體連接。將所得的序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為PDI626PGK。PDI626PGK-T 的制作將上述pDI626PGK用限制性酶SbfI消化，將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCRpurification kit進(jìn)行純化。然后,使用TaKaRaBIO社制Blunting kit (平端化試劑盒)將末端平滑化，再用限制性酶KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下3650bp的片段，使用QIAGEN社制MinElute Gel extraction kit進(jìn)行純化。將該純化產(chǎn)物作為用于連接的載體。接著，將 PRS524GAP (APP. Env. Micro.，2009，5536-5543)用限制性酶 PmaCI 和 KpnI 消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下765bp的片段,使用QIAGEN社制MinElute Gel extractionkit進(jìn)行純化，作為插入物。將它們進(jìn)行連接，對所得序列的接頭進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為PDI626PGK-T。pESCRap-HIS 的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)EcoRI-Pgap-F :5，CAC GGA ATT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA 3，(序列號11)BamHI-Pgap-R :5，CTC TGG ATC CTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC 3，(序列號12)模板pDI626GAP質(zhì)粒(Ing)反應(yīng)液含有Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C2 分鐘 _(95°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 25 個(gè)循環(huán)-72 °C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備PCR反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCR purification kit進(jìn)行純化，然后用限制性酶BamHI和EcoRI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下686bp的片段，使用QIAGEN社制MinElute Gelextraction kit進(jìn)行純化。與用限制性酶BamHI和EcoRI消化后的pESC-HIS (從STRATAGENE社購入)載體連接。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pESCgap-HIS。pESCpgkgap-HIS在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)MunI-Ppgkl-F :5，TAG GCA ATT GCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG 3，(序列號13)EcoRI-Ppgkl-R :5，ATA AGA ATT CTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG 3，(序列號14)模板pDI626PGK質(zhì)粒(Ing)·反應(yīng)液含有Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C2 分鐘 _(95°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 25 個(gè)循環(huán)-72 °C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備PCR反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCR purification kit進(jìn)行純化，然后用限制性酶MunI和EcoRI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下718bp的片段，使用QIAGEN社制MinElute Gel extraction kit進(jìn)行純化。用限制性酶EcoRI消化,與BAP處理后的上述pESCgap-HIS載體連接。通過菌落PCR確認(rèn)插入物沿正確的方向連接，調(diào)制質(zhì)粒。對序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pESCpgkgap-HIS。pCR2. I-ORFn 的制作以來源于Streptomyces sp. CL190株的ORFn基因的堿基序列為基礎(chǔ),將該堿基序列中所含的釀酒酵母中的稀有密碼子設(shè)計(jì)成出現(xiàn)頻率高的密碼子。所設(shè)計(jì)的堿基序列示于序列號15。另外，合成由本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的堿基序列構(gòu)成的核酸片段。另外，在合成的ORFn基因的上游非翻譯區(qū)添加ggatccgccacc(序列號16)的合成DNA序列，在下游非翻譯區(qū)添加ctcgag的合成DNA序列。將該合成基因?qū)胭|(zhì)粒pCR2. I (Invitrogen社制),將所得的質(zhì)粒命名為pCR2. I-ORFn。pESCpRkRap-HIS-QRFn 白勺將上述pCR2. I-ORFn用限制性酶BamHI和XhoI消化后，切下1002bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和XhoI消化后的上述pESCpgkgap-HIS載體連接。將所得序列用限制性酶進(jìn)行分析，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pESCpgkgap-HIS-ORFn。pESCpgkgap-HIS-ORFn是將以最適合在釀酒酵母YPH499中表達(dá)的方式設(shè)計(jì)了密碼子的、來源于Sti^ptomyces sp. CL190株的ORFn基因?qū)脶劸平湍竃PH499的染色體上的載體。此夕卜，該ORFn基因由PGK啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，恒常表達(dá)。< pESCpgkgap-HIS-ERG10 的制作>在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)ERGlO-F :5，GGG GGG ATC CGC CAC CAT GTC TCA GM CGT TTA CAT TGT ATC 3，(序列號W
ERGlO-R :5，GGG GCT CGA GTC ATA TCT TTT CAA TGA CAA TAG AGG 3，(序列號18)模板YPH499的基因組 DNA (O. 3 μ g)反應(yīng)液含有Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C5 分鐘 _(95°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 30 個(gè)循環(huán)-72 °C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCRpurification kit進(jìn)行純化，然后用限制性酶BamHI和XhoI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切下1209bp的片段，使用QIAGEN社制MinElute Gel extraction kit進(jìn)行純化。將所得的DNA片段與用限制性酶BamHI和XhoI消化后的上述pESCpgkgap-HIS載體連接。對序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pESCpgkgap-HIS-ERG10。pESCpgkgap-HIS-ERGlO 是將來源于釀酒酵母YPH499的硫解酶基因?qū)脶劸平湍竃PH499的染色體上的載體。此外，該ORFn基因通過PGK啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，恒常表達(dá)。< pEXP (Ura) -ADC-CTFA-CTFB 的制作 >將來源于丙酮丁醇梭菌ATCC824株的adc基因、ctfA基因和ctfB基因分別克隆到pT7Blue載體中。將所得的載體克隆到pDI626中，然后使用Gateway供體載體(GatewayDonor vector) (Invitrogen 社)制作入門克隆(Entry Clone) (pENT-ADC、pENT-CTFA和pENT-CTFB)。然后，將所得的入門克隆插入表達(dá)載體(pDEST626(2008))中，從而制作pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB。詳細(xì)如下。pENT-ADC 的制作如下制作adc基因的入門克隆(pENT-ADC)。首先，在以下條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)adc-F :5，ATG TTA AAG GAT GAA GTA ATT AAA CAA ATT AG3’(序列號 19)adc-R :5，TTA CTT AAG ATA ATC ATA TAT AAC TTC AGC TC 3，(序列號 20)模板上述ATCC824株的基因組DNA (O. 4 μ g)反應(yīng)液包含Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C5 分鐘 _(95°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 30 個(gè)循環(huán)-72°C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備將通過PCR擴(kuò)增而得的735bp的片段使用Novagen社制Perfectly Blunt CloningKit平端克隆至pT7Blue載體(夕力9 才社)中。將所克隆的序列進(jìn)行測序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌ATCC824株的adc基因的堿基序列(CA-P0165)。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pT7Blue-ADC。接著，將pT7Blue_ADC用限制性酶BamHI和SalI消化，切下771bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和SalI消化后的pDI626載體連接。將所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為PDI626-ADC。接著，以所得的pDI626-ADC為模板，用以下引物進(jìn)行PCR。
引物08-189-adc-attBl-Fw :5’GGG GAC AAG TTTG TA CAA AAA AGC AGG CTC AGT TCGAGT TTA TCA TTA TC 3，(序列號 21)08-189-adc-attB4-Rv :5’GGG GAC AAC TTT GTA TAG AAA AGT TGG GTG GGC CGCAAA TTA AAG CCT TC 3’(序列號 22)將所得的1809bp的PCR產(chǎn)物通過gateway BP反應(yīng)導(dǎo)入供體載體pD0NR221Pl_P4中。進(jìn)行所得的克隆的測序，確認(rèn)了插入物的全堿基序列中無突變位點(diǎn)。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pENT-ADC。pENT-CTFA 的制作如下制作ctfA基因的入門克隆(pENT-CTFA)。
首先，在以下條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)ctfA-F :5，ATG AAC TCT AAA ATA ATT AGA TTT GAA AAT TTA AGG 3，(序列號23)ctfA-R :5，TTA TGC AGG CTC CTT TAC TAT ATA ATT TA 3，(序列號 24)模板上述ATCC824株的基因組DNA (O. 4 μ g)反應(yīng)液包含Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C5 分鐘 _(95°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 30 個(gè)循環(huán)-72°C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備將PCR 擴(kuò)增而得的 657bp 的片段使用 Novagen 社制 Perfectly Blunt CloningKit同樣地進(jìn)行克隆。對所克隆的序列進(jìn)行測序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌ATCC824株的ctfA基因的堿基序列(CA-P0163)。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pT7Blue-CTFA。
接著，將pT7Blue_CTFA用限制性酶BamHI和SalI消化，切下693bp的片段，與同樣地用限制性酶BamHI和Sal I消化后的pDI626PGK載體連接。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為PDI626PGK-CTFA。接著，以所得的pDI626PGK-CTFA為模板，使用以下引物進(jìn)行PCR。引物08-189-ctfA-attB4r-Fw :5’ GGG GAC AAC TTT TCT ATA CAA AGT TGG CTT CAAGCT TAC ACA ACA CGG 3，(序列號 25)08-189-ctfA-attB3r-Rv :5’ GGG GAC AAC TTT ATT ATA CAA AGT TGT CAA GAATTA CTC GTG AGT AAG G 3’(序列號 26)將所得的1823bp的PCR產(chǎn)物通過gateway BP反應(yīng)而導(dǎo)入供體載體PD0NR22lP4r-P3r中。將所得的克隆進(jìn)行測序，確認(rèn)了插入物的全堿基序列中沒有突變位點(diǎn)。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pENT-CTFA。pENT-CTFB 的制作如下制作ctfB基因的入門克隆(pENT-CTFB)。首先，在以下條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)ctfB-F :5’ ATG ATT AAT GAT AAA AAC CTA GCG AAA G 3’(序列號 27)
ctfB-R :5，CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG TTC 3，(序列號 28)模板上述ATCC824株的基因組DNA (O. 4 μ g)反應(yīng)液包含Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C5 分鐘 _(95°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 2 分鐘)X 30 個(gè)循環(huán)-72°C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備將PCR擴(kuò)增而得的666bp的片段使用 Novagen社制Perfectly Blunt Cloning Kit進(jìn)行克隆。對所克隆的序列進(jìn)行測序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌ATCC824株的ctfB基因的堿基序列(CA-P0164)。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pT7Blue-CTFB。接著，將pT7Blue_CTFB用限制性酶BamHI和SalI消化，切下771bp的片段，與同 樣地用限制性酶BamHI和SalI消化后的pDI626載體連接。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pDI626-CTFB(+A)。接著，為了修正引物中的突變位點(diǎn)而使用以下引物在以下條件下進(jìn)行PCR。引物(50pmol)BamHI-ctfB-F :5’ TAG TGG ATC CGA TGA TTA ATG ATA AAA ACC 3’(序列號 29)pDI626MCS_seqF :5’ CCT AGA CTT CAG GTT GTC TAA C 3’(序列號 30)模板pDI626_CTFB(+A)(Ing)反應(yīng)液包含Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C2 分鐘 _(95°C 30 秒、55°C 30 秒、72°C I 分鐘)X 20 個(gè)循環(huán)-72 °C 3 分鐘_4°C儲(chǔ)備PCR反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液使用QIAGEN社制MinElute PCR purification kit進(jìn)行純化，然后用限制性酶BamHI和SalI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下702bp的片段，使用QIAGEN社制MinElute Gel extraction kit進(jìn)行純化。與用限制性酶BamHI和SalI消化后的PDI626載體連接。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)了突變位點(diǎn)被修正。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pDI626-CTFB。接著，以pDI626-CTFB為模板，使用以下引物進(jìn)行PCR。引物08-189-ctfB-attB3-Fw :5’GGG GAC AAC TTT GTA TAA TAA AGT TGG GCC GCA AATTAA AGC CTT C 3，(序列號 31)08-189-ctfB-attB2-Rv :5’GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA CAG TTCGAG TTT ATC ATT ATC 3’(序列號 32)將所得的1737bp的PCR產(chǎn)物通過gateway BP反應(yīng)導(dǎo)入供體載體pD0NR221P3_P2中。對所得的克隆進(jìn)行測序，確認(rèn)了插入物的全堿基序列中沒有突變位點(diǎn)。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pENT-CTFB。pDEST626(2008)的制作在以下的條件下進(jìn)行PCR。引物SacI-convA-F :5，TAG GGA GCT CAT CAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC TG 3，(序列號33)KpnI-convA-R :5，TTA AGG TAC CAT CAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC 3，(序列號34)模板RfA(Invitrogen 社制 Gateway Vector Conversion System) (0. 5ng)引物(50pmol)反應(yīng)液包含Ix Pfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)、IOnmol dNTP、I μ I Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液反應(yīng)95°C2 分鐘 _(95°C 30 秒、55 °C 30 秒、72 °C I 分鐘 30 秒)X 20 個(gè)循環(huán)-72 °C 3分鐘_4°C儲(chǔ)備此外，作為模板的RfA 是 Gateway Vector Conversion System 的 Reading Frame·CassetteA0 PCR 反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液使用 QIAGEN 社制 MinElute PCR purification kit進(jìn)行純化，然后用限制性酶SacI和KpnI消化。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下1717bp的片段，使用QIAGEN社制MinElute Gel extraction kit進(jìn)行純化,然后與用限制性酶SacI和KpnI消化后的PDI626GAP載體(APP. Env. Micro.，2009, 5536)連接。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為PDEST626 (2008)。pEXP (Ura) -ADC-CTFA-CTFB 的制作將如上所述所得的3個(gè)入門克隆(pENT-ADC、pENT-CTFA和pENT-CTFB)通過Gateway LR反應(yīng)插入表達(dá)載體pDEST626 (2008)中。對于所得的克隆，通過PCR確認(rèn)插入物大小，確認(rèn)了正確地進(jìn)行了重組。進(jìn)行測序，確認(rèn)了序列中無錯(cuò)誤。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為 pEXP(Ura)-ADC-CTFA-CTFB。< pDI626PGK-T-iPDH 的制作>pCR2. WPDH 的制作首先，以在GenBank登記的來源于拜氏梭菌NRRL B593的pdh基因的堿基序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)成使該堿基序列所含的釀酒酵母中的稀有密碼子變成出現(xiàn)頻率高的密碼子那樣。另外，在本實(shí)施例中合成包含設(shè)計(jì)的堿基序列的核酸片段(序列號35)。另外，在合成的pdh基因的上游非翻譯區(qū)添加GGGGTTTCCGCGGTCTAGAGCCACC(序列號36)的合成DNA序列，在下游非翻譯區(qū)添加GGATCCGTCGACGGGG(序列號37)的合成DNA序列。將該質(zhì)粒命名為 pCR2. 1-iPDH。pDI626PGK-T-iPDH 的制作接著，將pCR2. 1-iPDH用限制性酶SacII和Sail消化，切下1080bp的片段，與同樣地用限制性酶SacII和SalI消化后的上述pDI626PGK_T載體連接。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pDI626PGK-T-iroH。pDI626PGK-T_iroH是將以最適宜在釀酒酵母YPH499中表達(dá)的方式設(shè)計(jì)了密碼子的來源于拜氏梭菌NRRL B593株的Pdh基因?qū)脶劸平湍竃PH499的染色體上的載體。此外，該pdh基因被PGK啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控，恒常表達(dá)。< 轉(zhuǎn)化 I >在本實(shí)施例中，首先，將如上述構(gòu)建的pEXP (Ura) -ADC-CTFA-CTFB用限制性酶AatII和BssHII切割而線性化，乙醇沉淀后溶解在0. IXTE緩沖液中，使用Frozen EZyeast transformation kit (Zymoresearch 社制)轉(zhuǎn)化釀酒酵母 YPH499 (Stratagene 社制)。對所得的克隆進(jìn)行菌落PCR，確認(rèn)了在25個(gè)克隆中導(dǎo)入有adc基因、ctfA基因和ctfB基因。另外，測定所得的克隆中的丙酮生產(chǎn)量，將丙酮生產(chǎn)量最多的株命名為# 3-17。< 轉(zhuǎn)化 2 >在本實(shí)施例中，接下來將如上述構(gòu)建的pDI626PGK-T_iPDH用限制性酶AatII和BssHII切割而線性化，乙醇沉淀后，溶解于O. IXTE緩沖液中，使用Frozen EZ yeasttransformation kit (Zymoresearch社制)轉(zhuǎn)化丙酮高產(chǎn)酵母# 3-17。對所得的14個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，確認(rèn)了在13個(gè)克隆中導(dǎo)入了 pdh基因。測定所得的克隆中的異丙醇生產(chǎn)量，將異丙醇生產(chǎn)量最多的株命名為# 15-10。< 轉(zhuǎn)化 3 >在本實(shí)施例中，接著使用如上構(gòu)建的pESCpgkgap-HIS-ERG10 (0. 5 μ g)轉(zhuǎn)化# 15-10。轉(zhuǎn)化法與上述同樣地，按照Frozen EZ yeast transformationkit(Zymoresearch社制)的方法。轉(zhuǎn)化處理后涂布于SD(-URA-TRP-HIS)培養(yǎng)基，在30°C 培養(yǎng)5天，然后將出現(xiàn)的菌落進(jìn)行傳代。用PCR確認(rèn)導(dǎo)入了 ERG10基因，然后將所得的株命名為 ERGlO/ # 15-10 株。另夕卜，同樣地使用如上述構(gòu)建的pESCpgkgap-HIS-0RFn(0· 5μ g)轉(zhuǎn)化# 15-10。通過PCR確認(rèn)導(dǎo)入了 ORFn基因之后，將所得的株命名為ORFn/ # 15-10株。<異丙醇生產(chǎn)性試驗(yàn)>對于在上述的轉(zhuǎn)化3中制作的重組酵母(ERG10/ # 15-10株和ORFn/ # 15-10株)評價(jià)異丙醇的生產(chǎn)性。具體地，首先，在加入有3ml培養(yǎng)基的玻璃制一次性試管(16 X lOOmm.ASAHI TECHNO GLASS社制)中接種由甘油儲(chǔ)備液解凍的重組酵母溶液30 μ I。在30°C、以130沖程/分鐘(高崎2段振蕩培養(yǎng)機(jī)TXY-16R-2FL型)振蕩試管66小時(shí)，制作前培養(yǎng)液。接著，在包含IOOml的培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中接種Iml的前培養(yǎng)液，用才 O丨技研二段式培養(yǎng)機(jī)(IFM-I I-S型)在30°C以130轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)240小時(shí)。主培養(yǎng)開始后，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、168小時(shí)、240小時(shí)測定0. D. 600nm，進(jìn)行取樣。將培養(yǎng)液3ml 加入帶有螺帽的試管(TST SCR 16-100 ； 16 X IOOmmASAHI TECHNOGLASS社制)中，在室溫下以IOOOg離心分離(T0MYLC-230型)5分鐘。將上清液2ml加入20ml容量的HSS瓶中擰緊后，在60°C進(jìn)行15分鐘熱處理。然后通過HSS-GC/MS分析來分析丙酮、異丙醇。預(yù)先調(diào)制濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而對樣品的濃度進(jìn)行定量。以下顯示HSS-GC/MS的分析條件。頂空采樣器分析條件頂空米樣器HP7694(Hewlett-Packard)Zone Temp.Oven 60°CLoop 150 °CTR. LINE 200°CEvent Time GC CYCLE TIME :35 分鐘Vial EQ ΜΕ:15 分鐘
PRESSURIZ. TIME :0. 50 分鐘Loop Fill ΜΕ:0·2 分鐘Loop EQ TIME :0. 2 分鐘INJECT ΜΕ :1. 00 分鐘Vial PrameterSHAKE HIGH其他瓶加壓15psi Loop 大小3mlGC-MS分析備件GC/MS HP6890/5973GC/MS 系統(tǒng)(Hewlett-Packard)使用柱J&W DB-624(0. 32mmx60m、膜厚 I. 8 μ m)入口溫度260 °C檢測器溫度260°C注入?yún)?shù)分流比1/20載氣氦I. Oml/分鐘柱溫箱加熱條件40°C下5分鐘一以5°C /分鐘加熱至75°C —以100°C /分鐘加熱至260°C— 260°C下16分鐘<測定結(jié)果>對于上述的轉(zhuǎn)化2中制作的# 15-10株、上述的轉(zhuǎn)化3中制作的ERG10/ # 15-10株和ORFn/ # 15-10株，經(jīng)時(shí)地測定異丙醇生產(chǎn)量，將結(jié)果示于圖I。在圖I中，倒三角表示# 15-10株，正三角表示ERGlO/# 15-10株，黑圓表示ORFn/# 15-10株。另外，將主培養(yǎng)開始后96小時(shí)的異丙醇生產(chǎn)量比較的結(jié)果示于表I。表I
菌株生產(chǎn)量(mg/L〕
YPH4990.0# 15-10 株14.3 ERGi0/#1S-10 株2S.8 〇RFn/#15-10 株122.6培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))96小時(shí)由圖I和表I判斷可知，通過對導(dǎo)入有參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑的異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的重組酵母進(jìn)一步導(dǎo)入了乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的重組酵母，能夠大幅提高異丙醇的生產(chǎn)性。特別是在導(dǎo)入了編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的情況下，與導(dǎo)入了編碼具有由二分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因(硫解酶)的情況相比，異丙醇的生產(chǎn)性飛躍性地提高。認(rèn)為這是因?yàn)?，作為宿主使用的酵母本來具有脂質(zhì)合成能力，本來充分地具有在該脂質(zhì)合成途徑中利用的丙二酸單酰輔酶A。因此，由該結(jié)果可知，特別是通過對脂質(zhì)合成能力優(yōu)異的酵母，導(dǎo)入編碼具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的酶的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑的異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，可以制作具有更優(yōu)異的異丙醇生產(chǎn)性的重組酵母?！矃⒖祭齀〕在本參考例中，作為宿主使用大腸桿菌，制作對導(dǎo)入有參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑的異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的重組大腸桿菌進(jìn)一步導(dǎo)入了乙酰乙酰輔酶A合成酶基因的重組大腸桿菌，評價(jià)異丙醇生產(chǎn)性。<丙酮丁醇梭菌的基因組DNA的調(diào)制>
按照常規(guī)方法將丙酮丁醇梭菌ATCC (824)株在3ml的Difco社制梭菌強(qiáng)化培養(yǎng)基中在30°C厭氧培養(yǎng)2天。使用QIAGEN社制基因組DNA調(diào)制試劑盒(Gentra PuregeneYeast/Bact. kit)從培養(yǎng)液I. 5ml中制備基因組DNA。< pT7Blue-CAC2873 的制作>如下克隆作為來源于丙酮丁醇梭菌的硫解酶基因的thiA基因。首先，使用以下引物進(jìn)行PCR。CAC2873-F :5’ -ATG AAA GAA GTT GTA ATA GCT AGT GCA G-3’(序列號 38)CAC2873-R:5，-CTA GCA CTT TTC TAG CAA TAT TGC TG-3，(序列號 39)在PCR中，作為模板使用O. Iyg上述調(diào)制的丙酮丁醇梭菌ATCC(824)株的基因組DNA。另外，上述一對引物為50pmol。反應(yīng)液組成為在IxPfuUltra II reactionbuffer (Stratagene)中包含 IOnmol 的 dNTP 和 1μ I 的 Pfu Ultra II fusion HS DNApolymerase (Stratagene)的50 μ I溶液。PCR的熱循環(huán)是在95°C下5分鐘后,將95°C下30秒、60°C下30秒和72°C下3分鐘作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后在72°C下3分鐘。另外反應(yīng)結(jié)束后在4°C儲(chǔ)備。將PCR擴(kuò)增而得的約I. 2kb的片段使用Novagen社制Perfectly Blunt CloningKit平端克隆到pT7-Blue載體中。對所克隆的序列進(jìn)行測序，確認(rèn)了是丙酮丁醇梭菌ATCC(824)株的thiA基因。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pT7Blue-CAC2873。< pCDFDuet-thiA 的制作>如下構(gòu)建用于在大腸桿菌中表達(dá)上述thiA基因的表達(dá)載體。首先，使用以下引物進(jìn)行PCR。acat-Ndel-F :5’ -AAA CAT ATG AAA GAA GTT GTA ATA GC-3，(序列號 40)acat-XhoI-R :5，-AAA CTC GAG CTA GCA CTT TTC TAG CAA T-3’(序列號 41)在PCR中作為模板使用上述調(diào)制的pT7Blue_CAC2873。另外，上述一對引物為IOpmol。反應(yīng)液組成是在 IxPfu Ultra II reaction buffer (Stratagene)中包含 12.5nmol的 dNTP和 I μ I 的 Pfu Ultra II fusion HS DNA polymerase (Stratagene)的 50 μ I 溶液。PCR的熱循環(huán)是在95°C下2分鐘后，將95°C下20秒、43°C下20秒和72°C下40秒作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后，將95°C下20秒、50°C下20秒和72°C下40秒作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72°C下3分鐘。另外反應(yīng)結(jié)束后在4°C儲(chǔ)備。將PCR擴(kuò)增而得的約 I. 2bp 的 DNA片段用 MinElute PCR Purification Kit 純化，使用 Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit 試劑盒克隆到 pCR-Blunt II-Topo 載體中。將所得的載體命名為 pCR-Blunt ΙΙ-ΤΟΡΟ-thiA。將 pCR-Blunt II-TOPO-thiA 用 NdeI 和 XhoI切割，通過瓊脂糖凝膠電泳純化約I. 2Kbp的DNA片段,插入到P⑶F-Duet (Novagen社制)的NdeI-XhoI部位。將所得的質(zhì)粒作為pQ)FDuet_thiA。< pCDFDuet-orfN 的制作>如下克隆來源于丙酮丁醇梭菌的、由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因。首先，使用以下引物進(jìn)行PCR。OrfN-NdeI-F :5，-AAA CAT ATG ACC GAC GTC CGA TTC CGC AT 3’(序列號 42)
OrfN-XhoI-R :5，-AAA CTC GAG TTA CCA CTC GAT CAG GGC GA 3，(序列號 43)在PCR中作為模板使用20ng的pHI SORFn。使用日本特開2008-61506號公報(bào)所述的pHISORFn。另外，上述一對引物為15pmol。反應(yīng)液組成為在Ix PrimeSTAR GCBuffer (Mg2+plus)(夕力 9 "Μ 才社制)中包含 IOnmol 的 dNTP 和 O. 5 μ I 的 PrimeSTAR HSDNA Polymerase (夕力9 才社制)的50 μ I溶液。PCR的熱循環(huán)是在94 下I分鐘后，將98°C下10秒、53°C下5秒和72°C下I分鐘作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后，將98°C下10秒、60°C下5秒、72°C下I分鐘作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后在72°C下5分鐘。另外反應(yīng)結(jié)束后在4°C儲(chǔ)備。將PCR 擴(kuò)增而得的約 IKbp 的 DNA 片段用 MinElute PCR Purification Kit 純化，使用 Zero Blunt T0P0 PCR Cloning Kit 試劑盒克隆到 pCR-Blunt II-Topo 載體中。將所得的載體命名為 pCR-Blunt II-T0P0-orfN。將 pCR-Bluntll-TOPO-orfN 用 NdeI 和 XhoI切割，通過瓊脂糖凝膠電泳純化約IKbp的DNA片段,插入到P⑶F-Duet (Novagen社制)的NdeI-XhoI部位。將所得的質(zhì)粒命名為pCDFDuet-orfN。< pETDuet-ctfAB 的構(gòu)建>克隆作為來源于丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的CtfA基因和CtfB基因。首先，以如上所述調(diào)制的基因組DNA模板進(jìn)行以下所示的PCR。在PCR中，使用PfuUltra II fusion HS DNA polymerase (STRATAGEN社制)和以下引物(下劃線部為限制性酶位點(diǎn))。ctfAB-Ndel-F :5’_ATT CAT ATG A AC TCT A A A ATA ATT AGA TTT GAA MT TTAAGG TC-3，(序列號 44)ctfAB-Ndel-R :5，-AGA CTC GAG CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG-3，(序列號 45)PCR中的反應(yīng)液的組成如下所述。表2反應(yīng)組成總反應(yīng)體積50 μ I梭菌基因組 D\A(0.4 μ g/ μ I)I μ I (最終 0.4 μ g)
PfiilJItra II fusion HS DNA polymerase I μ I10 X PfuUItra II reaction Buffer5 μ I
dNTP Mix (每種 dNTP 各 2.5mM)5 μ I (最終每種 dNTP 各 0.25mM)
ctfAB-Ndel-F (10 μ Μ)I μ I
ClfAB-NdeI-R (10 μ Μ)I μ
滅菌水36 μ IPCR的熱循環(huán)為在95°C下2分鐘后，將95°C下30秒、54. 8°C下30秒和72°C下2分鐘作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)行，然后72°C下7分鐘。另外反應(yīng)結(jié)束后在4°C儲(chǔ)備。
·
在上述的條件下進(jìn)行PCR(eppendruf社制)，通過O. 8%瓊脂糖凝膠電泳切下1324bp的片段。使用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社制)純化切下的片段,用NdeI 和 XhoI 進(jìn)行消化。進(jìn)一步用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN 社制)純化，然后插入pETDuet-1 ( ^ 々社制)的NdeI、XhoI位點(diǎn)。對所得序列進(jìn)行測序,確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pETDuet-ctfAB。< pETDuet-ADC 的構(gòu)建>克隆作為來源于丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脫羧酶基因的adc基因。首先，以如上所述制備的基因組DNA為模板進(jìn)行以下所示的PCR。在PCR中，使用PfuUltra II fusionHS DNA polymerase (STRATAGEN社制)和以下引物(下劃線部為限制性酶位點(diǎn))。adc-Sall-F :5’_CAC GTC GAC AAG GAG ATA TAA TGT TAA AGG ATG AAG TAA TTAAAC Α-3，(序列號 46)adc-Notl-R :5’ -CAC GCG GCC GCT TAC TTA AGA TAA TCA TAT ATA ACT TCAGC-3，(序列號47)PCR中的反應(yīng)液的組成如下。表3反應(yīng)組成總反應(yīng)體積100 μ I
梭菌基因組 DNA(0.4 μ g/ μ 1}2 μ I (最終 0.8 μ g)
PfuUItra II fusion HS DNA polymerase 2 μ I10 x Pfullltra Il reaction Buffer10 μ I
dNTP Mix (每種 dNTP 各 2.5mM) 10 μ I (最終每種 dNTP 各 0.25mΜ)adc-Sall-F(lOp'I)2μ1
ad c-Notl-R (10 μ Μ)2 μ I
滅菌水62 μ IPCR的熱循環(huán)為在95°C下2分鐘后，將95‘C卜20秒、54. 8°C下20秒和72°C下3分鐘作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后在72°C下3分鐘。另外反應(yīng)結(jié)束后在13°C下儲(chǔ)備。在上述的條件下進(jìn)行PCR(eppendruf社制)，通過I %瓊脂糖凝膠電泳切下735bp的片段。使用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社制)純化切下的片段，用Sail和NotI消化。進(jìn)一步用QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社制)純化，然后插入pETDuet-1 ( ^ ^ 社制)的SalI、NotI位點(diǎn)。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pETDuet-ADC。< pETDuet-AD C-ctfAB 的構(gòu)建>如下構(gòu)建用于在大腸桿菌中表達(dá)上述ctfA基因、ctfB基因和adc基因的表達(dá)載體。首先，將上述制作的pETDuet-ADC用SalI和NotI消化，通過O. 8%瓊脂糖凝膠電泳切下包含adc基因的753bp的片段,使用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社制)純化。另外，將上述制作的pETDuet-ctfAB用SalI和NotI消化，使所得的6677bp與上述片段連接。將所得的載體命名為pETDuet-ADC-ctfAB。 < pCOLADuet-PDH 的構(gòu)建>克隆作為來源于拜氏梭菌的異丙醇脫氫酶基因的pdh基因。首先，使用上述實(shí)施例I所制作的PCR2. 1-iPDH作為模板進(jìn)行以下所示的PCR。在PCR中，使用PfuUltra IIfusion HS DNA polymerase (STRATAGEN社制)和以下引物(下劃線部為限制性酶位點(diǎn))。PDH-EcoRI-F :5，-GGA ATT CCA TGA AAG GTT TCG CAA TGT T-3’(序列號 48)PDH-PstI-R :5，_MC TGC AGA ACC MT GCA TTG GTT ACA AM TGA CTA CGG-3，(序列號49)PCR中的反應(yīng)液的組成如下。表4反應(yīng)組成總反應(yīng)體積50 μ I
pCR2.1-iPDH (0.36 μ g/ μ I)I μ I (最終 0.36 μ g)
Pfuliltra II fusion HS DNA polymerase I μ I10 X PfuUItra II reaction Buffer5 μ I
dNTP Mix (每種 dNTP 各 2.5mlVl)5 μ I (最終每種 dNTP 各 0.25mIVI)
PDH-EcoRI-F (10 μ Μ)I μ I
PDH-PstI-R ( 0 μ VI)I μ
滅菌水36 μ IPCR的熱循環(huán)為在95°C下2分鐘后，將95°C下30秒、50°C下30秒和72°C下2分鐘作為I個(gè)循環(huán)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72°C下7分鐘。另外反應(yīng)結(jié)束后在4°C下儲(chǔ)備。在上述條件下進(jìn)行PCR (eppendruf社制)，通過O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳切下1056bp的片段。使用MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN社制)純化切下的片段，用EcoRI 和 PstI 消化。用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN 社制)純化,然后插入pCOLADuet-1 ( ^ ^ 社制)的EcoRI、PstI位點(diǎn)。對所得序列進(jìn)行測序，確認(rèn)制作了目標(biāo)質(zhì)粒。將這樣獲得的質(zhì)粒命名為pCOLADuet-PDH。
<重組大腸桿菌制作>將上述制作的pCDFDuet-thiA、pCDFDuet-orfN、pETDuet-ADC-ctfAB、pCOLADuet-PDH以下述表5所示的A F的組合轉(zhuǎn)化夕力9 A 4才社制的大腸桿菌BL21 (DE3)、被分類為大腸桿菌K株的大腸桿菌NovaBlue (DE3)。將以A F的表達(dá)載體的組合轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)而得的重組大腸桿菌分別命名為A/BL21、B/BL21、C/BL21、D/BL21、E/BL21、F/BL21。將以A F的表達(dá)載體的組合轉(zhuǎn)化大腸桿菌NovaBlue (DE3)而得的重組大腸桿菌分別命名為A/NB、B/NB、C/NB、D/NB、E/NB、F/NB。表權(quán)利要求
1.異丙醇的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的重組酵母，從培養(yǎng)物中獲得異丙醇，上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼催化將乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)換成乙酰乙酰輔酶A的反應(yīng)的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因是來源于鏈霉菌屬的微生物的基因(ORFn基因)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼具有序列號I所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者編碼具有相對于序列號I的氨基酸序列具有80%以上的一致度的氨基酸序列、且具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，異丙醇生物合成相關(guān)基因簇是選自乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和異丙醇脫氫酶基因中的基因，上述重組酵母中導(dǎo)入有這些異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的基因中本來在該重組酵母內(nèi)部不存在的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因是來源于丙酮丁醇梭菌的CtfA基因和CtfB基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，乙酰乙酸脫羧酶基因是來源于丙酮丁醇梭菌的adc基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7的任一項(xiàng)所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，異丙醇脫氫酶基因是來源于拜氏梭菌的Pdh基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的異丙醇的制造方法，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇被導(dǎo)入成為宿主的酵母的基因組內(nèi)。
10.重組酵母，其中，導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和異丙醇生物合成相關(guān)基因簇，上述異丙醇生物合成相關(guān)基因簇參與由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的代謝途徑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組酵母，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼催化將乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)換成乙酰乙酰輔酶A的反應(yīng)的酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組酵母，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因是來源于鏈霉菌屬的微生物的乙酰乙酰輔酶A合成酶基因(ORFn基因)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組酵母，其特征在于，上述乙酰乙酰輔酶A合成酶基因編碼具有序列號I所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者編碼具有相對于序列號I的氨基酸序列具有80%以上的一致度的氨基酸序列、且具有由丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組酵母，其特征在于，異丙醇生物合成相關(guān)基因簇是選自乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰乙酸脫羧酶基因和異丙醇脫氫酶基因中的基因，該重組酵母中導(dǎo)入有這些異丙醇生物合成相關(guān)基因簇的基因中本來在該重組酵母內(nèi)部不存在的基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組酵母，其特征在于，乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因是來源于丙麗丁醇梭囷的ctfA基因和ctfB基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的重組酵母，其特征在于，乙酰乙酸脫羧酶基因是來源于丙酮丁醇梭菌的adc基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求14 16的任一項(xiàng)所述的重組酵母，其特征在于，異丙醇脫氫酶基因是來源于拜氏梭菌的Pdh基因。
全文摘要
利用發(fā)酵工藝以優(yōu)異的生產(chǎn)性制造異丙醇。通過培養(yǎng)導(dǎo)入有乙酰乙酰輔酶A合成酶基因、和編碼由乙酰乙酰輔酶A合成異丙醇的一組酶的基因簇(異丙醇合成相關(guān)基因簇)的重組酵母而在培養(yǎng)基高產(chǎn)異丙醇。
文檔編號C12N1/19GK102892892SQ20108006677
公開日2013年1月23日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者村松正善, 米田聰 申請人:豐田自動(dòng)車株式會(huì)社