專利名稱：與多囊卵巢綜合征相關(guān)的snp、包含snp的芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與多囊卵巢綜合征相關(guān)的SNP、包含SNP的芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多囊卵巢綜合征是一種臨床癥狀，表現(xiàn)為存在以下兩種或多種特征長期的排卵過少或停止排卵、雄性激素過量和多囊卵巢^作為無排卵性不孕癥的最主要原因，PCOS影響了 6-8%的育齡女性2_3。此外，PCOS與重要的內(nèi)分泌代謝紊亂和廣泛范圍的不利后遺癥(包括血脂障礙、動脈硬化癥、胰島素抗性和2型糖尿病4_6)有關(guān)。患有PCOS的女性中，大約50%存在胰島素抗性7。在患有葡萄糖耐量降低(IGT)和糖尿病的女性中，大約20%承認(rèn)在年輕時(shí)患有PCOS8,。 目前還沒有完全弄清楚PCOS的發(fā)病機(jī)理。遺傳傾向早已被認(rèn)為是機(jī)理之一，但是在遺傳因素和環(huán)境因素之間存在復(fù)雜的相互作用。已經(jīng)對至少70種候選基因進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性研究，這些基因主要涉及生殖激素、胰島素抗性和慢性炎癥，如卵泡刺激素受體(FSHR)、細(xì)胞色素P450家族IlA (CYP11A)、胰島素受體(INSR)和白細(xì)胞介素6 (IL-6) n_15 ;但是，沒有任何基因與PCOS相關(guān)聯(lián)16?；陉嚵械娜蚪M單核苷酸多態(tài)性(SNP)關(guān)聯(lián)性分析可以替代地提供一種全面的、無偏差的方法以大范圍地篩查患者、檢測該疾病的易感基因。本文進(jìn)行了一項(xiàng)全基因組病例-對照相關(guān)性研究以鑒定中國漢族人群中PCOS的遺傳標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人已經(jīng)確定了中國漢族人群PCOS的三個(gè)易感基因座2pl6. 3、2p21和9q33. 3。在本次大規(guī)模GWA研究中，在額外的獨(dú)立重復(fù)中進(jìn)一步驗(yàn)證了與PCOS最顯著相關(guān)的遺傳變異體。在29種變異體中，28種在中國北部漢族人群PCOS個(gè)體中完全重復(fù)，20種在中國中部和南部漢族人群中重復(fù)。盡管中國北部和南部漢族人群之間存在遺傳差異17，但是這些風(fēng)險(xiǎn)等位基因在中國PCOS女性中相當(dāng)普遍。所有PCOS相關(guān)的變異體分別定位于以下三種基因之一 LHCGR(rsl3405728)、THADA (rs12468394)和 DENND1A (rsl0986105)。LHCGR 編碼與促黃體激素(LH)和絨毛膜促性腺素(HCG)有關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。在卵巢中，LHCGR在排卵前卵泡的后期的粒層細(xì)胞中表達(dá)。重要地,在粒層細(xì)胞分化過程中的LHCGR的誘導(dǎo)使得排卵前卵泡對中期LH峰有響應(yīng)，導(dǎo)致排卵和釋放成熟卵母細(xì)胞22。在女性中，LHCGR的失活(或功能喪失)突變與增加的LH、擴(kuò)大的卵巢、經(jīng)量異常、對LH或HCG的抗性和不育有關(guān)23'24，盡管受影響的女性中的活性突變產(chǎn)生雄激素過多癥，但對生殖異常沒有其它影響25。THADA首先在由于染色體重組形成的甲狀腺腺瘤中得以鑒定，所述基因重組導(dǎo)致THADA斷裂并與過氧化物酶體增殖激活受體Y (PPARG)的一個(gè)內(nèi)含子融合26。最近，在大型歐洲GWA研究中，THADA(rs7578597)被鑒定為T2D的易感基因27 ;但是，隨后在中國患者28、芬蘭患者29和印度患者3°的T2D研究中，該結(jié)果沒有得到重復(fù)。在德國人中，THADA中rs7578597和T2D有一定的關(guān)聯(lián)傾向(p=0. 055)31。在中國人中，THADA與T2D沒有關(guān)系，但是在葡萄糖耐性測試中發(fā)現(xiàn)，THADA與2小時(shí)胰島素水平有關(guān)系28。具有風(fēng)險(xiǎn)等位基因的PCOS患者具有更大的發(fā)展胰島素抗性的可能性，因此應(yīng)當(dāng)監(jiān)視他們的T2D。THADA的功能還沒有充分表征，但是一些證據(jù)暗示它可能涉及死亡受體途徑和細(xì)胞凋亡32。THADA在所有組織中廣泛表達(dá)，特別是在淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞中高表達(dá)。這暗示了 THADA在免疫反應(yīng)中的作用。在固有性和/或適應(yīng)性免疫反應(yīng)中，THADA可能作為引起系統(tǒng)性疾病如PCOS的炎癥信號途徑中的細(xì)胞因子參與反應(yīng)。DENND1A，是另一個(gè)相關(guān)聯(lián)的9q33. 3基因，編碼DENN域(在正常和贅生性細(xì)胞中差異表達(dá))，所述DENN域可以與I型腫瘤壞死因子受體(TNFRl)雜交，作為死亡域-死亡域交互作用的負(fù)調(diào)控因子33。之前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，血清TNFRl升高與肥胖的PCOS個(gè)體相關(guān)；但是，在相同的PCOS病例群體中，TNF- α沒有同時(shí)增加34，表明在所述TNF系統(tǒng)中，其它細(xì)胞因子激活TNF受體或負(fù)調(diào)控因子喪失抑制功能。發(fā)明人推斷，在具有成因性DENND1A風(fēng)險(xiǎn)等位基因的PCOS患者中，DENND1A不能正常抑制，導(dǎo)致升高的TNFRl進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活炎癥途徑?？傮w上，THADA和DENND1A似乎都是通過慢性炎癥發(fā)病機(jī)理在PCOS中起作用。最 近的研究已經(jīng)顯示，一些炎癥介體，如C-反應(yīng)性蛋白(CRP) ,TNF- α和纖溶酶原激活物抑制物-I (PAI-I)在PCOS女性中增加35’36。同樣已知肥胖(在50-70%的PCOS中存在37)與慢性系統(tǒng)性炎癥和增加的炎癥細(xì)胞因子有關(guān)38。此外，已經(jīng)證明了胰島素抗性和炎癥之間的相關(guān)性39。如所說明的，肥胖和胰島素抗性是與PCOS最相關(guān)的兩個(gè)特征。發(fā)明人推斷，已經(jīng)鑒定的易感基因，THADA和DENNDIA可能作為改變卵巢功能和導(dǎo)致PCOS的促炎細(xì)胞因子。將來自基因型2型糖尿病個(gè)體的數(shù)據(jù)(同時(shí)分析的)與本研究融合以確定發(fā)明人已鑒定的PCOS相關(guān)因素是否也與T2D相關(guān)。確實(shí)，在患有PCOS的女性中，胰島素敏感性減少35%-40%，減少量在數(shù)量上與T2D中的減少量相似4°。但是，在中國漢族人群中的研究沒有發(fā)現(xiàn)在T2D中的這些相關(guān)因素。因此，即使共有相同的特征，如肥胖、代謝異常、胰島素抗性和心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)性，PCOS和T2D被假定具有對于它們發(fā)病機(jī)理而言獨(dú)立的易感因子。綜上所述，該大型GWA研究顯示，在中國漢族人群中，LHCGR、THADA和DENNDIA中的遺傳變異體與多囊卵巢綜合征密切相關(guān)，但是與2型糖尿病不相關(guān)?；谏厦娴拿枋觯景l(fā)明提供具有SNP的THADA、LHCGR和DENNDIA基因，其中THADA 基因具有一個(gè)或多個(gè)來自 NCBI 數(shù)據(jù)庫的 SNP :rsl 1891936 (A/G)、rsl7030684 (T/C)、rs4340576(G/A)、rsl2468394(A/C)、rs7567607(A/G)、rsl3429458(C/A)、rs7568365 (T/C)、rs7582497 (G/A)、rsl0176241 (G/A)、rs6744642 (T/C)、rsl2478601 (T/C)、rsl038822 (C/T)、rs7559891(A/G)、rsl873555(G/A)、rs7596052(A/G)、rsl0165527(A/G)、rs6726014(T/A)、rs2374551 (G/C)、rs6731009 (C/T)、rsl0179648 (A/G)和 rs7558302 (T/C) ；LHCGR 基因具有來自NCBI數(shù)據(jù)庫的SNP rsl3405728 (G/A) ;DENND1A基因具有來自NCBI數(shù)據(jù)庫的一個(gè)或多個(gè) SNP rsl0818854 (A/G)、rs7857605 (C/T)、rs2479106 (G/A)、rsl778890 (C/T)、rsl627536(A/T)和 rsl0986105(C/A)。如在本文中所使用的，(M/N)表示SNP中的次要等位基因/主要等位基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供具有上述SNP的探針，用于篩選、預(yù)測或診斷PC0S，其中所述探針的核苷酸序列在表5中列出或?yàn)镾eq ID. No. 1_56。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括一個(gè)或多個(gè)上述探針的芯片。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種包括上述芯片的試劑盒，所述試劑盒用于篩選、預(yù)測或診HtPCOS0本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選、預(yù)測或診斷PCOS的方法，其中，所述方法使用本文所述的芯片和/或試劑盒，其中，該方法主要包括以下步驟提取患者的外周血DNA并用所述PCOS芯片雜交；篩選并分析相關(guān)的SNP等位基因信息的結(jié)果以預(yù)測PCOS的風(fēng)險(xiǎn)。


圖I :PC0S的全基因組相關(guān)性篩選。顯示了用于SNP的負(fù)IogltlP,通過的 質(zhì)量控制5X10_8 (上面的線)是全球顯著水平，而10_6是本研究中使用的閾值。圖2 2pl6. 3、2p21 和 9q33. 3 上的 PCOS 相關(guān)信號。基因座2ρ16·3(圖2·Α)、2ρ21(圖2.B)和9q33.3(圖2.C)的詳細(xì)情況示出了全基因組顯著相關(guān)性。上面的部分示出了來自GWAS (圓形和三角形)和meta分析(方形)的單一標(biāo)記物相關(guān)性統(tǒng)計(jì)(作為-IogltlP ;左邊Y軸)。在HapMap中的每個(gè)域交叉的重組率以淡藍(lán)色示出(右邊I軸)。每個(gè)域的基因組內(nèi)容在下面部分表示。
具體實(shí)施方式
個(gè)體通過多家醫(yī)院的協(xié)作，本研究中的所有中國漢族樣本獲取于24家生殖和婦科診所。第一階段的樣品(744個(gè)PCOS病例和895個(gè)對照)主要來自于中國北方的山東省；更多的重復(fù)樣品(系列I和2)收集自貫穿中國大陸北部、中部和南部的21個(gè)省(3338個(gè)病例和5792個(gè)對照)17。額外收集了 204組PCOS家庭三人以進(jìn)行傳遞不平衡檢測。病例和對照的臨床特征在表I中示出。為進(jìn)一步說明中國漢族人群中PCOS相關(guān)因素是否與2型糖尿病相關(guān)，在由1326個(gè)2型糖尿病病例和1159個(gè)對照(包括772個(gè)女性病例和821個(gè)女性對照)組成的未公開的T2D GffAS中檢查所有顯著變異體。根據(jù)2003修訂的關(guān)于與多囊卵巢綜合征相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)和長期健康風(fēng)險(xiǎn)的共識，即以下三種標(biāo)準(zhǔn)中的任何兩種少排卵或停止排卵，雄激素過多癥的臨床和/或生物化學(xué)跡象以及多囊卵巢形態(tài)學(xué)對所有被定義為PCOS病例的受影響的個(gè)體進(jìn)行診斷。排除了具有月經(jīng)稀發(fā)或雄激素過多癥的其它原因的患者。通過由內(nèi)科醫(yī)生做全面臨床檢查從病例中收集臨床信息。通過結(jié)構(gòu)調(diào)查問卷從病例和對照收集其它的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息。所有參與者提供書面知情同意書。該研究得到各家醫(yī)院的制度上的倫理委員會許可并根據(jù)赫爾辛基宣言原則操作?；蛐头治鍪褂冒猴w全基因組人類SNP陣列6. O進(jìn)行全基因組基因型分析。如下所述進(jìn)行GffAS數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制過濾對照QC是O. 4或更大的陣列被遺棄，不進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。使用鳥鉺運(yùn)算法則產(chǎn)生基因型數(shù)據(jù)。對于樣品過濾，排除產(chǎn)生的基因型少于95%的基因座的陣列。對于SNP過濾(在樣品過濾之后)，移除在病例樣本或?qū)φ諛颖局泻艚新省?5%的SNP。排除MAF (次要等位基因頻率)<1%的SNP，或者在對照中明顯偏離哈迪-溫伯格平衡(HWE1P^ O. 001)的SNP。一共649，264個(gè)SNP通過質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并用于后續(xù)分析。
下面的標(biāo)準(zhǔn)用于選擇SNP以進(jìn)行確認(rèn)判斷來自GWAS的特別顯著SNP (基于等位基因？值< 10-6)。具有模糊的基因型分散圖塊的那些從后續(xù)階段中排除。統(tǒng)計(jì)分析為鑒定可能的人口分層，發(fā)明人使用PLINK軟件包進(jìn)行了多維標(biāo)定(MDS)分析18。同時(shí)使用PLINK在單一標(biāo)記物水平進(jìn)行全基因組相關(guān)性分析以及在病例-對照樣本中進(jìn)行HWE分析。對于重復(fù)研究，使用SHEsis進(jìn)行等位基因相關(guān)性分析19’2°。Haploview用于全基因組P值圖(圖I)21。使用R qq. plot函數(shù)產(chǎn)生Q-Q圖。使用meta分析整合GWAS和重復(fù)數(shù)據(jù)。使用R ‘meta’包進(jìn)行meta分析。使用Q-統(tǒng)計(jì)P-值評估三個(gè)階段的不均一性。Mantel-Haenszel方法用于計(jì)算固定的效果評估。實(shí)施例I :全基因組相關(guān)性研究為鑒定中國漢族人群中的PCOS遺傳易感性基因座，發(fā)明人進(jìn)行了 GWA研究，在昂飛SNP6. O上對744個(gè)受影響個(gè)體(病例)和895個(gè)對照中的906，600個(gè)SNP進(jìn)行基因型分 析。在QC過濾后，一共保留了 649，264個(gè)SNP并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?；蚪M膨脹因子(λ =I. 097)表明由于人群分層的GWAS結(jié)果造成非常輕微的膨脹，而MDS分析證明沒有明顯的人群基礎(chǔ)。初始分析揭示3個(gè)不同的基因座(2ρ16. 3、2ρ21和9q33. 3，包括15個(gè)SNP)顯示全基因組顯著相關(guān)性(P〈5X10_8)。這些基因座中的最顯著SNP是基因LHCGR(2pl6. 3)中的rsl3405728(等位基因P值=1. 29XlCT8 ;讓步比，O. 61)、基因THADA(2p21)中的rsl2468394(等位基因 P 值=3. 99Χ1(Γ10 ;讓步比，O. 60)和基因 DENNDIA(9q33. 3)中的rsl0986105(等位基因 P 值=9. 78X IiTici ;讓步比，2. 08)(圖 1、2)。實(shí)施例2 :重復(fù)研究為確認(rèn)GWAS的發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人對來自兩個(gè)重復(fù)集的個(gè)體中的28個(gè)SNP (在GWAS中顯示出最強(qiáng)相關(guān)性(p〈10_6)的那些)進(jìn)行基因型分析(表2):系列I包括來自中國北部漢族的2840個(gè)PCOS病例和5012個(gè)對照的獨(dú)立樣本集；系列2包括來自中國中部漢族和南部漢族的其它498個(gè)PCOS病例和780個(gè)對照。在系列I重復(fù)中，29個(gè)SNP中的28個(gè)得以確認(rèn)。在GWAS中發(fā)現(xiàn)的這些易感基因座中的所有被選擇的SNP (基因LHCGR的I個(gè)SNP，基因THADA的21個(gè)SNP和基因DENND1A的6個(gè)SNP)均被確認(rèn)，p值范圍從I. 18X10-7至
5.55X 10_16。此外，20個(gè)SNP在系列2重復(fù)研究中呈陽性，最顯著的SNP是基因LHCGR中的rsl3405728(p 值=7·93Χ1(Γ7)(表 2)。實(shí)施例3 :組合分析除了每個(gè)重復(fù)集的相關(guān)性測試外，發(fā)明人還使用mata分析對GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行了組合分析。所述Mantel-Haenszel方法用于評估作為固定效果模型的所有分層的集中讓步t匕。在結(jié)合GWAS和重復(fù)數(shù)據(jù)之后，在以下SNP處觀察到最顯著相關(guān)性rsl3429458(2p21，Pmeta = 1.73X10-23,讓步比=0. 67，95%CI:0. 62-0. 72)、rsl3405728(2pl6. 3，Pnieta =
7.55 X 1(Γ21，讓步比=0. 71，95%CI: O. 67-0. 77)和 rs2479106 (9q33. 3，Pmeta=8. 12 X 1(T19，讓步比=1.34，95%(1:1.26-1.43)(表2，圖2)。在這三個(gè)易感基因座中的所有選擇的SNP顯示出顯著相關(guān)性(P值范圍從2. 36X 10_13至I. 73X 10_23)。所述結(jié)合分析的結(jié)果強(qiáng)烈地支持基因LHCGR、THADA、DENND1A中的變異體與PCOS的易感性相關(guān)。實(shí)施例4:邏輯回歸為降低年齡和身體質(zhì)量指標(biāo)(BMI)對結(jié)果的潛在影響，發(fā)明人使用年齡和BMI作為變量進(jìn)行了疾病特性的邏輯回歸分析。發(fā)明人使用模型YzbfbiXADD+hX年齡+b3.BMI+e以適應(yīng)所述數(shù)據(jù),其中Y表示顯型(I表示疾病，O表示正常)，ADD表示等位基因劑量(次要等位基因)的相加效果。所有初始相關(guān)的SNP在所述發(fā)現(xiàn)和重復(fù)I系列中仍然顯著。在重復(fù)系列2中，由于樣本數(shù)量少，調(diào)整后仍有3個(gè)SNP顯著。但是，2pl6. 3、2p21和9q33. 3處的相關(guān)性沒有被年齡和BMI的效果覆蓋。實(shí)施例5 =PCOS家庭三人中的傳遞不平衡檢測在204組家庭三人中，發(fā)明人對在PCOS GffAS中鑒定的全部28個(gè)SNP進(jìn)行了傳遞不平衡檢測(TDT)。盡管由于三人的數(shù)量少，發(fā)明人已經(jīng)限定了統(tǒng)計(jì)效力，發(fā)明人仍然檢測到6個(gè)顯著的SNP (表3)，全部位于發(fā)明人之前檢測到的相同域內(nèi)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了發(fā)明人的顯著發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例6 :檢測T2D中的PCOS相關(guān)因素為說明那些相關(guān)因素是否與T2D相關(guān)，發(fā)明人額外地研究了在中國漢族人群中收·集的未公開的T2D GffAS數(shù)據(jù)集(1326個(gè)2型糖尿病病例和1159個(gè)對照；772個(gè)女性病例·和821個(gè)女性對照)。但是，發(fā)明人在PCOS中鑒定的SNP都沒有在T2D GWAS中顯示出名義上的顯著性(P=O. 05)。當(dāng)發(fā)明人查看T2D GWAS數(shù)據(jù)中的女性樣本時(shí)，僅9q33. 2的2個(gè)SNP (rsl778890、rsl0986105)顯示邊際顯著性，其無法通過多個(gè)測試校正(表4)。明顯地，2pl6. 3、2p21和9q33. 3與PCOS的相關(guān)性不應(yīng)當(dāng)是PCOS和T2D之間密切關(guān)系的副產(chǎn)物。實(shí)施例7 :通過SNP芯片預(yù)測PCOS使用微陣列打印機(jī)將SNP序列的等位基因特異寡核苷酸印刷在環(huán)氧包被的玻璃顯微鏡載片上。每個(gè)集一式兩份印刷，以使得對于每一個(gè)SNP有四個(gè)主要和次要等位基因寡核苷酸點(diǎn)。在每一個(gè)載片上印刷12個(gè)這樣的寡核苷酸塊，以使得每一載片檢測來自12個(gè)人的DNA。提取患者的外周血DNA并與PCOS芯片雜交。篩選并分析與SNP等位基因信息相關(guān)的結(jié)果以預(yù)測PCOS風(fēng)險(xiǎn)。表I :PC0S病例/對照個(gè)體的特征特征
權(quán)利要求
1.具有來自NCBI 數(shù)據(jù)庫的一個(gè)或多個(gè) SNP rsl 1891936 (A/G)、rsl7030684(T/C)、rs4340576(G/A)、rsl2468394(A/C)、rs7567607(A/G)、rsl3429458(C/A)、rs7568365 (T/C)、rs7582497(G/A)、rsl0176241(G/A)、rs6744642(T/C)、rsl2478601(T/C)、rsl038822(C/T)、rs7559891(A/G)、rsl873555(G/A)、rs7596052(A/G)、rsl0165527(A/G)、rs6726014(T/A)、rs2374551 (G/C)、rs6731009 (C/T)、rsl0179648 (A/G)和 rs7558302 (T/C)的 THADA 基因；具有來自NCBI數(shù)據(jù)庫的SNP rsl3405728(G/A)的LHCGR基因；具有來自NCBI數(shù)據(jù)庫的一個(gè)或多個(gè) SNP rsl0818854 (A/G)、rs7857605 (C/T)、rs2479106 (G/A)、rsl778890 (C/T)、rsl627536(A/T)和 rsl0986105 (C/A)的 DENND1A 基因。
2.具有權(quán)利要求I的SNP、用于篩選、預(yù)測或診斷PCOS的探針，其特征在于，所述探針的核苷酸序列如Seq ID. No. 1-56所不。
3.包括一個(gè)或多個(gè)如權(quán)利要求2所述的探針的芯片。
4.權(quán)利要求3的芯片在篩選、預(yù)測或診斷PCOS中的應(yīng)用。
5.包括權(quán)利要求3的芯片的試劑盒。
6.權(quán)利要求5的試劑盒在篩選、預(yù)測或診斷PCOS中的應(yīng)用。
7.一種篩選、預(yù)測或診斷PCOS的方法，其特征在于，所述方法使用權(quán)利要求3的芯片或權(quán)利要求5的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步驟提取患者的外周血DNA并用PCOS芯片雜交；篩選并分析相關(guān)的SNP等位基因信息的結(jié)果以預(yù)測PCOS的風(fēng)險(xiǎn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了與多囊卵巢綜合征(PCOS)相關(guān)的SNP，這些SNP在數(shù)以千計(jì)的中國PCOS病例中被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明還提供了具有所述SNP的探針和包括一個(gè)或多個(gè)這些探針的芯片。所述探針和芯片可以用于篩選、預(yù)測或診斷PCOS。
文檔編號C12Q1/68GK102918158SQ201080067164
公開日2013年2月6日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者陳子江, 賀林, 師詠勇, 馬金龍, 趙躍然, 趙涵, 石玉華, 耿玲, 游力 申請人:山東大學(xué), 山東山大附屬生殖醫(yī)院有限公司, 上海交通大學(xué)