專(zhuān)利名稱(chēng)：Znf217乳腺癌復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移表型的一種新預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的制作方法
ZNF21 7 乳腺癌復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移表型的一種新預(yù)后和預(yù)
測(cè)生物標(biāo)志物本發(fā)明涉及用于確定乳腺癌預(yù)后的方法和試劑盒。方法涉及確定取自患者的樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平，其中ZNF217的過(guò)量表達(dá)與癌癥的轉(zhuǎn)移幾率和再發(fā)/復(fù)發(fā)幾率相關(guān)聯(lián)。癌癥是主要的健康問(wèn)題，每年使全世界幾百萬(wàn)人死亡。癌癥的診斷方法已經(jīng)得到改進(jìn)，現(xiàn)在經(jīng)常有可能在早期診斷癌癥。為了使癌癥治療有效，需要精確和簡(jiǎn)單的癌癥預(yù)后方法。經(jīng)?；诮M織學(xué)和臨床數(shù)據(jù)確定癌癥預(yù)后，如腫瘤大小、浸潤(rùn)、擴(kuò)散到淋巴結(jié)或轉(zhuǎn)移。然而，這種確定方式經(jīng)常難以當(dāng)在臨床癥狀和組織學(xué)數(shù)據(jù)不可用或不可信時(shí)早期診斷的癌癥中進(jìn)行。傳統(tǒng)地，乳腺癌標(biāo)志物如ER α (ER)(通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè))和ERBB2/HER2 (通過(guò)免疫組織化學(xué)和/或FISH檢測(cè))已經(jīng)用于癌癥預(yù)后，并且ER-陰性和/或ERBB2/HER2-陽(yáng)性的乳腺腫瘤是具有不良的預(yù)后的腫瘤。然而，約60-70 %的乳腺癌是ER+乳腺癌，而 ERBB2/HER2+乳腺癌僅代表全部乳腺癌的約15_20%。因此急需新的預(yù)后生物標(biāo)志物，或者向目前使用的生物標(biāo)志物增加新的預(yù)后/預(yù)測(cè)價(jià)值，或者預(yù)測(cè)癌癥的復(fù)發(fā)/再發(fā)，特別是在目前視為“具有較好預(yù)后的癌癥”的那些乳腺癌，即在ER-陽(yáng)性乳腺癌中，和特別地，在 ER-陽(yáng)性HER2-陰性乳腺癌中。近來(lái)，已提出了免疫組織學(xué)(ER、PR、HER2、KI67)和/或臨床(SBR)參數(shù)將乳腺癌分類(lèi)為生物上獨(dú)特和行為完全不同的亞型(Blows等，2010 ；Cheang等，2009 ；Hugh等， 2009 ；Millar等，2009 ；Nguyen等，2008)。不同分子亞組的預(yù)后和化學(xué)治療敏感性不同。 Luminal-樣癌癥是ER+和/或PR(黃體酮受體)-陽(yáng)性的，并且因此對(duì)于內(nèi)分泌治療敏感， 具有比HER2+和Triple陰性亞型更有利的預(yù)后，甚至在不進(jìn)行任何治療的情況下。Luminal B亞型與表達(dá)HER2或具有由KI67或SBR給出的高增殖表型的那些亞型等同(考慮觀察到的有絲分裂次數(shù))(Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Mi Ilar 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。已顯示Luminal B乳腺癌具有比Luminal A乳腺癌更不利的長(zhǎng)期存活率(Blows 等，2010 ；Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。最重要的是關(guān)于旨在將Luminal亞類(lèi)，特別是Luminal A亞類(lèi)重新分級(jí)的標(biāo)志物。W098/02539描述了來(lái)自癌癥相關(guān)的染色體20上擴(kuò)增區(qū)域的基因。披露的基因可以用作對(duì)20ql3擴(kuò)增子特異的探針，用于監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞基因組中相應(yīng)序列的相對(duì)拷貝。根據(jù)此文件，ZABC-I基因(ZNF217基因)定位于20ql3. 2擴(kuò)增子的核心，并且在原發(fā)性和具有20ql3. 2擴(kuò)增的乳癌細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)。根據(jù)W098/02539，是否存在20ql3蛋白和/或 20ql3蛋白的表達(dá)水平是是否存在癌癥或癌癥程度的指示。然而，在W098/02539中，腫瘤樣本中未測(cè)量ZABC-I基因(ZNF217基因)的表達(dá)水平，而較短的無(wú)病存活僅與高水平20ql3 擴(kuò)增相關(guān)聯(lián)。W02006/065940描述了新的預(yù)后和治療靶標(biāo)，HTPAP基因，當(dāng)其擴(kuò)增后可以在乳腺癌患者中賦予不良的預(yù)后。HTPAP基因的擴(kuò)增可以與其它擴(kuò)增如ZNF217擴(kuò)增子的檢測(cè)相關(guān)。Sun Guiqin等Q008)描述了 ZNF217沉默對(duì)于人類(lèi)卵巢癌細(xì)胞系生物行為的影響 (Sun 等，2008)。根據(jù)Li Jing等Q006)，ZNF217擴(kuò)增與卵巢癌顯著相關(guān)(Li等，2006)。Quinlan等Q007)關(guān)注ZNF217是致癌基因的證據(jù)，其在多種癌癥中擴(kuò)增 (Quinlan 等，2007)。Huang Guiqing等Q005)提供了實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，顯示ZNF217抑制與化學(xué)治療和端粒功能紊亂有關(guān)的細(xì)胞死亡(Huang等，2005)。W003/079748涉及通過(guò)ZNF217抑制的癌癥治療的作用增強(qiáng)。在6.8% (Tanner 等，2000)、8% (Ginestier 等，2006 ;Plevova 等，2010)和 19 % (Letessier等，2006)的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)高水平20ql3擴(kuò)增。然而，由于幾項(xiàng)研究已顯示，在某些情況下，基因或染色體區(qū)域的擴(kuò)增水平對(duì)腫瘤樣本中基因表達(dá)水平具有主要影響，其它機(jī)制如外遺傳、轉(zhuǎn)錄或后轉(zhuǎn)錄機(jī)制也是對(duì)基因表達(dá)做出貢獻(xiàn)的重要事件。對(duì)于ZNF217的擴(kuò)增和ZNF217的表達(dá)水平也是如此，因?yàn)樵谌橄倌[瘤和不具有擴(kuò)增的乳腺細(xì)胞系中能觀察到高 ZNF217 表達(dá)水平(Collins 等，1998 ;Collins 等，2001)。此外，Mackay 等 Q009)未發(fā)現(xiàn)ZNF217表達(dá)和ZNF217基因拷貝數(shù)之間的任何顯著關(guān)聯(lián)(Mackay等，2009)。進(jìn)一步地，20ql3擴(kuò)增與乳腺癌中具有不良的預(yù)后的關(guān)聯(lián)程度還不清楚。 Letessier等Q006)未發(fā)現(xiàn)高水平20ql3擴(kuò)增和乳腺癌中不良結(jié)果之間的任何關(guān)聯(lián) (Letessier等，2006)。相反地，另一項(xiàng)研究可觀察到乳腺癌中20ql3擴(kuò)增的預(yù)后值，但是只有高水平20ql3擴(kuò)增而沒(méi)有低/中水平20ql3擴(kuò)增(Tanner等，1995)。引人注目的是， 20ql3擴(kuò)增可能同時(shí)與乳腺癌中良好的預(yù)后或預(yù)后差有關(guān)。Ginestier等Q006)觀察到兩種類(lèi)型的擴(kuò)增。在第一種類(lèi)型中，ZNF217基因座擴(kuò)增但是20ql3的另外兩個(gè)基因座沒(méi)有檢測(cè)到擴(kuò)增(Ginestier等，2006)。在第二種類(lèi)型中，擴(kuò)增區(qū)域更長(zhǎng)而且涉及ZNF217、MYBL2和 STK6中的兩個(gè)或三個(gè)基因座。兩種類(lèi)型表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)譜，并且與包括淋巴結(jié)狀態(tài)和存活率的不同組織臨床特征相關(guān)。在兩個(gè)或三個(gè)基因座擴(kuò)增的腫瘤與良好的預(yù)后相關(guān)， 而僅在ZNF217擴(kuò)增的腫瘤更頻繁地與不良的預(yù)后相關(guān)。Ginestier等進(jìn)一步確證了 ZNF217 mRNA表達(dá)水平和僅擴(kuò)增ZNF217的腫瘤中的ZNF217擴(kuò)增之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，而且ZNF217 mRNA表達(dá)水平不能將這些腫瘤與沒(méi)有任何擴(kuò)增的腫瘤相區(qū)分(Ginestier等，2006)。最后，兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ZNF217擴(kuò)增與ER-和PR-陰性狀態(tài)相關(guān)(Letessier等，2006 ； Plevova 等，2010)。因此乳腺癌中ZNF217擴(kuò)增和ZNF217表達(dá)水平的預(yù)后值仍然很不清楚。本發(fā)明顯示ZNF217的表達(dá)水平，其獨(dú)立于ZNF217基因的擴(kuò)增，代表乳腺癌患者中易再發(fā)和發(fā)展轉(zhuǎn)移的不良的預(yù)后的新標(biāo)志物。更具體地，ZNF217是乳腺癌的強(qiáng)力的不良的預(yù)后標(biāo)志物，所述乳腺癌通過(guò)目前可用的臨床標(biāo)志物/參數(shù)分類(lèi)為具有良好/更好的預(yù)后的癌癥(例如ER+亞類(lèi)，HER2-亞類(lèi)，Luminal亞類(lèi)(ER+和/或I3R+)，ER+/HER2-亞類(lèi)，SBRl 禾口 /或SBR2亞類(lèi)，無(wú)/少淋巴結(jié)侵入亞類(lèi)(彡3)，ER+和/或PR+和SBRl和/或SBR2亞類(lèi)，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亞類(lèi)，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/無(wú)/少淋巴結(jié)侵入 (彡3)亞類(lèi)，Luminal A亞類(lèi))。因此單獨(dú)或者與其它預(yù)后標(biāo)志物一起評(píng)價(jià)ZNF217表達(dá)水平可以將分類(lèi)為具有良好/更好的預(yù)后的癌癥重新分級(jí)為兩個(gè)亞類(lèi)“良好的預(yù)后”乳腺癌(低ZNF217表達(dá)水平)或“預(yù)后差”乳腺癌(高ZNF217表達(dá)水平)，從而幫助臨床醫(yī)生做出治療決定。令人吃驚地是，ZNF217比常用于癌癥預(yù)后的其它標(biāo)志物如ERBB2/HER2和ESR1/ER 的預(yù)后值更高。因此通過(guò)常規(guī)技術(shù)分類(lèi)為具有“良好的預(yù)后”，但具有表達(dá)的ZNF217水平高于正常水平的腫瘤的患者為侵襲性癌癥治療的候選者。此外，由于去調(diào)控的ZNF217表達(dá)水平與對(duì)內(nèi)分泌治療或內(nèi)分泌/化學(xué)治療的應(yīng)答減弱有關(guān)，所以ZNF217也代表抗癌治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物，并且特別是，內(nèi)分泌治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。本發(fā)明顯示ZNF217是一種強(qiáng)大的工具，用于在ER-陽(yáng)性或ER-陽(yáng)性HER2-陰性乳腺腫瘤中鑒定患有侵襲性腫瘤、對(duì)于無(wú)復(fù)發(fā)存活具有不良的預(yù)后和/或?qū)τ诳偞婊罹哂胁涣嫉念A(yù)后的患者。因此，ZNF217是不良預(yù)后的生物標(biāo)志物，與乳腺癌的實(shí)際生物標(biāo)志物相比具有增加的價(jià)值，因?yàn)閆NF217允許對(duì)ER+和/或PR+乳腺腫瘤樣本和ER+和/或 PR+/HER2-乳腺腫瘤樣本進(jìn)行分級(jí)。通常通過(guò)內(nèi)分泌療法治療ER-陽(yáng)性乳腺腫瘤。ZNF217 表達(dá)狀態(tài)的確定為臨床醫(yī)生提供有用的信息來(lái)決定最佳療程，因?yàn)镋R-陽(yáng)性HER2-陰性 ZNF217-陽(yáng)性腫瘤是易于發(fā)展轉(zhuǎn)移和/或在治療下再發(fā)的更具侵襲性的腫瘤。這些腫瘤因此為更具有侵襲性的癌癥療法的候選者。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述乳腺癌如由傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)和/或組織學(xué)分級(jí)確定的具有良好的預(yù)后，所述方法包括測(cè)定來(lái)自所述患者的樣本中 ZNF217基因的表達(dá)水平，和如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)則將癌癥分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以將如通過(guò)常規(guī)方法確定的具有“良好”預(yù)后的患者重新分級(jí)或重新分類(lèi)。優(yōu)選地，所述患者已經(jīng)診斷為患有乳腺癌，顯示選自如下的良好的預(yù)后的至少一種標(biāo)志物ER+、PR+> HER2-、低增殖指數(shù)(由SBRl和SBR2給出或由低KI67給出)、 Luminal亞類(lèi)、Luminal A亞類(lèi)和淋巴結(jié)狀態(tài)(無(wú)/少淋巴結(jié)侵入，^ 3)。在本發(fā)明的方法中，如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為易復(fù)發(fā)和/或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對(duì)先前取自所述患者的樣本測(cè)試乳腺癌的至少一種預(yù)后標(biāo)志物，并評(píng)價(jià)所述樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平；-如果樣本顯示出可將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的至少一種標(biāo)志物，當(dāng)所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)時(shí)則將乳腺癌再分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于確定患者中乳腺癌患者的預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對(duì)先前取自所述患者的樣本測(cè)試乳腺癌的至少一種預(yù)后標(biāo)志物，-如果樣本顯示至少一種將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的標(biāo)志物，則評(píng)價(jià) ZNF217基因的表達(dá)水平，
-如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，將乳腺癌分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，所述將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標(biāo)志物通過(guò)組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)和/或免疫組織化學(xué)分級(jí)系統(tǒng)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)而確定。更優(yōu)選地，所述將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標(biāo)志物選自下組ER+、 PR+、HER2-、低增殖指數(shù)(由SBRl和SBR2給出或有低KI67給出)、Luminal亞型、Luminal A亞型和淋巴結(jié)狀態(tài)(無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)(S3))。甚至更優(yōu)選地，所述將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標(biāo)志物將乳腺癌分類(lèi)為選自下組的亞類(lèi)ER+亞類(lèi)、HER2-亞類(lèi)、Luminal亞類(lèi)(ER+和/或PR+)、ER+/HER2-亞類(lèi)、SBRl和/或SBR2亞類(lèi)、無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)亞類(lèi)(彡3)、ER+和/或PR+和SBRl和/或 SBR2 亞類(lèi)、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2 亞類(lèi)、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2/ 無(wú) / 少淋巴結(jié)浸潤(rùn)(< 3)亞類(lèi)、Luminal A亞類(lèi)。表現(xiàn)為低增殖表型的SBRl和/或SBR2可以由相應(yīng)亞類(lèi)中的低KI67代替。優(yōu)選地，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥再分類(lèi)為易復(fù)發(fā)和/ 或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型。優(yōu)選地，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為對(duì)于無(wú)再發(fā)存活具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為對(duì)于總存活具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為在化學(xué)治療和/或在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為在化學(xué)治療下具有不良的預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，ZNF217基因的表達(dá)水平優(yōu)選與對(duì)照樣本相比較。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照樣本是健康群體中觀察到的ZNF217基因表達(dá)的中值水平。有利地，對(duì)照樣本是取自患有乳腺癌的患者的樣本中ZNF217表達(dá)的中值水平。優(yōu)選地，所述樣本是乳腺腫瘤樣本。本發(fā)明還涉及將如通過(guò)免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)和/或組織學(xué)分級(jí)確定的具有有利的預(yù)后的乳腺癌患者再分級(jí)的方法，所述方法包括測(cè)量來(lái)自至少一位患者的樣本中的ZNF217基因的表達(dá)水平，并且如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)則將患者再分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，乳腺癌患者具有選自如下的良好的預(yù)后的至少一個(gè)標(biāo)志物ER+、PR+、 HER2-、SBRl 和 / 或 SBR2、低 KI67、Luminal 亞類(lèi)、Luminal A 亞類(lèi)和淋巴結(jié)狀態(tài)(< 3)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括通過(guò)定量ZNF217基因的mRNA而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括通過(guò)定量由ZNF217基因編碼的多肽而測(cè)量樣本中ZNF 基因的表達(dá)水平。發(fā)明詳述本發(fā)明基于ZNF217基因的表達(dá)水平是乳腺癌的顯著預(yù)后標(biāo)志物的觀察結(jié)果。更具體地，ZNF217在乳腺癌患者中有高的預(yù)后值，所述患者先前已通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)分類(lèi)為具有 “有利”或“良好”的預(yù)后。ZNF217是通過(guò)當(dāng)前可用的臨床標(biāo)志物/指示物分類(lèi)為具有良好 /更好的預(yù)后的乳腺癌(例如ER+亞類(lèi)、HER2-亞類(lèi)、Luminal亞類(lèi)(ER+和/或I3R+)、ER+/ HER2-亞類(lèi)、SBRl和/或SBR2亞類(lèi)、無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)亞類(lèi)(彡3)、ER+和/或PR+和SBRl 和 / 或 SBR2 亞類(lèi)、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2 亞類(lèi)、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2/ 無(wú) / 少淋巴結(jié)浸潤(rùn)(彡3)亞類(lèi)、Luminal A亞類(lèi)、表現(xiàn)出低增殖表型的SBRl和/或SBR2可以由相應(yīng)亞類(lèi)中的低KI67代替)的強(qiáng)的預(yù)后不良標(biāo)志物。因此單獨(dú)或與其它預(yù)后標(biāo)志物一起評(píng)價(jià)ZNF217表達(dá)水平可以將這些分類(lèi)為具有良好/更好的預(yù)后的癌癥再分級(jí)成兩個(gè)亞類(lèi)“預(yù)后良好”的乳腺癌(低ZNF217表達(dá)水平)或“預(yù)后差”的乳腺癌(高ZNF217表達(dá)水平)，從而為臨床醫(yī)生提供有幫助的信息。令人驚訝的是，ZNF217具有高于常用于癌癥預(yù)后的其他標(biāo)志物，如ERBB2/HER2和ESR1/ER的預(yù)后值。ZNF217的過(guò)量表達(dá)或高表達(dá)水平是具有浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型、對(duì)于無(wú)再發(fā)存活具有不良的預(yù)后和/或?qū)τ诳偞婊罹哂胁涣嫉念A(yù)后的乳腺腫瘤的特征。這個(gè)基因在乳腺癌細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)增加和預(yù)后變差在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著相關(guān)。本發(fā)明涉及鑒定易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或乳腺腫瘤和/或患有或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型的乳腺癌和/或乳腺腫瘤的方法。更特別地，本發(fā)明涉及鑒定易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或乳腺腫瘤和/或患有或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型的乳腺癌和/或乳腺腫瘤的方法，其中所述乳腺癌或乳腺腫瘤先前由傳統(tǒng)技術(shù)分類(lèi)為具有有利的預(yù)后。“癌”指疾病，所述疾病中一組細(xì)胞表現(xiàn)不受控制的生長(zhǎng)/分化、浸潤(rùn)和有時(shí)轉(zhuǎn)移?！敖y(tǒng)計(jì)上顯著的”優(yōu)選指至少95%的置信水平(ρ < 0. 05)的關(guān)聯(lián)或相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“浸潤(rùn)”或“侵襲”指癌或快速生長(zhǎng)的腫瘤，其具有擴(kuò)展超越其邊界進(jìn)入臨近組織的趨勢(shì)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”指癌或腫瘤從起源器官擴(kuò)散至患者體內(nèi)的其它氣管/遠(yuǎn)端部位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述乳腺癌如通過(guò)免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)和/或組織學(xué)分級(jí)確定的具有“良好”的預(yù)后， 所述方法包括測(cè)量來(lái)自所述患者的樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平，并且如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌再分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對(duì)先前取自所述患者的樣本測(cè)試乳腺癌的至少一種預(yù)后標(biāo)志物，并評(píng)價(jià)所述樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平；-如果樣本顯示將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的至少一種標(biāo)志物，并且如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將乳腺癌再分類(lèi)為具有不良的預(yù)后?？梢酝瑫r(shí)對(duì)樣本測(cè)試至少一種傳統(tǒng)預(yù)后標(biāo)志物和ZNF217表達(dá)水平。也可以連續(xù)和獨(dú)立評(píng)價(jià)預(yù)后標(biāo)志物和ZNF217表達(dá)水平。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對(duì)先前取自所述患者的樣本測(cè)試乳腺癌的至少一種預(yù)后標(biāo)志物，-如果樣本顯示至少一種將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的標(biāo)志物，則評(píng)價(jià) ZNF217基因的表達(dá)水平，-如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將乳腺癌分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。對(duì)于通過(guò)傳統(tǒng)方法確定為具有有利的預(yù)后的乳腺癌，ZNF217表達(dá)水平的預(yù)后值增強(qiáng)。很多通過(guò)常規(guī)方法確定為具有“良好”的預(yù)后的乳腺癌患者仍然發(fā)展浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移型癌或具有降低的無(wú)再發(fā)存活率或具有降低的總存活率。測(cè)量ZNF217基因的表達(dá)水平可將這些先前分類(lèi)為具有“良好”的預(yù)后的患者再分類(lèi)為兩個(gè)亞類(lèi)“預(yù)后良好”的乳腺癌(低 ZNF217表達(dá)水平)或“預(yù)后差”的乳腺癌(高ZNF217表達(dá)水平)。術(shù)語(yǔ)“良好的預(yù)后”或“有利的”預(yù)后指患者比沒(méi)有預(yù)后優(yōu)良的一個(gè)或幾個(gè)給定標(biāo)志物的患者和/或具有預(yù)后差的一個(gè)或幾個(gè)給定標(biāo)志物的患者具有更好的預(yù)后。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物”指提供乳腺癌預(yù)后的指示物。乳腺癌腫瘤的亞分型和亞分類(lèi)通常用標(biāo)志物組合進(jìn)行。這些標(biāo)志物將乳腺癌分類(lèi)成不同的亞型或亞類(lèi)。傳統(tǒng)上使用免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)和組織學(xué)分級(jí)確定乳腺癌的預(yù)后，從而確定對(duì)于乳腺癌患者最有效的療程。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法供用于對(duì)通過(guò)常規(guī)方法如免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)和組織學(xué)分級(jí)確定的具有“良好”的預(yù)后的患者再分級(jí)或再分類(lèi)。例如浸潤(rùn)性乳腺癌的惡性可以根據(jù)任何合適的組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)評(píng)分。目前用于乳腺癌的大多數(shù)腫瘤分級(jí)系統(tǒng)組合了核分級(jí)、微管形成和有絲分裂率。最常用的分級(jí)系統(tǒng)之一是 karff-Bloom-Richardson (SBR)系統(tǒng)(Bloom 和 Richardson，1957)。SBR 等級(jí)或組織學(xué)等級(jí)對(duì)應(yīng)于腫瘤微管形成分?jǐn)?shù)，加上有絲分裂分?jǐn)?shù)的數(shù)目，加上核多形性分?jǐn)?shù)的加和。然后將組合的分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)換成下述SBR等級(jí)SBR1對(duì)應(yīng)于低等級(jí)，SBR2對(duì)應(yīng)于中等級(jí)，SBR3對(duì)應(yīng)于高等級(jí)。本發(fā)明的方法供用于對(duì)具有有利的SBR等級(jí)的乳腺癌患者再分級(jí)。在這些先前分類(lèi)為具有“良好的預(yù)后”的患者中，ZNF217的高表達(dá)水平是預(yù)后差的標(biāo)志物。其它傳統(tǒng)標(biāo)志物是基于下述受體存在與否的受體狀態(tài)雌性激素受體(ER)、黃體酮受體(PR)和/或人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2/ErbB-2)。通常地，將ER+、PR+和/或 HER2-乳腺癌分類(lèi)為具有“較好”/ “良好”的預(yù)后。通常可根據(jù)公知的方法通過(guò)免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)而確定受體狀態(tài)。ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)通常通過(guò)FISH(熒光原位雜交)而進(jìn)行。盡管很多這類(lèi)患者將經(jīng)歷他們的乳腺癌復(fù)發(fā)，但是仍將ER+和/或HER2-亞類(lèi)的乳腺癌視作具有“有利的”預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，通過(guò)評(píng)價(jià)ZNF217基因的表達(dá)水平而進(jìn)行這些患者/乳腺腫瘤的更精確的分類(lèi)或再分級(jí)。其它傳統(tǒng)上視為預(yù)后“優(yōu)良”的乳腺癌亞型是Luminal和Luminal A亞型。 Luminal-樣癌癥是ER+和/或PR+的乳腺癌。Luminal A乳腺癌為ER+和/或PR+，HER2-并且具有低增殖指數(shù)(由低KI67給出或由SBRl和SBR2給出)(Cheang等，2009 ；Hugh等，2009 ；Voduc等，2010)。Luminal A乳腺癌也可為具有ER+和/或PR+和HER2-狀態(tài)的乳腺癌(Millar等，2009 ；Nguyen等，2008)或具有ER+和/或PR+和低增殖指數(shù)(由低KI67給出或由SBRl和SBR2給出)的乳腺癌(Voduc等，2010)。Luminal B乳腺癌是具有ER+和 /或PR+并且也具有HER2+或高增殖指數(shù)(高KI67或SBR!3)狀態(tài)的那些癌癥(Cheang等， 2009 ；Hugh等，2009)。Luminal B乳腺癌也可為僅具有ER+和/或PR+和HER2+的那些癌癥(Millar 等，2009 ；Nguyen 等，2008)。在本發(fā)明的方法中，Luminal和/或Luminal A亞型的乳腺腫瘤通過(guò)評(píng)價(jià)ZNF217 基因的表達(dá)水平而再分級(jí)或再分類(lèi)。乳腺癌中另一個(gè)公知的預(yù)后指示物是淋巴結(jié)狀態(tài)?；加袥](méi)有或很少浸潤(rùn)淋巴結(jié) (^ 3)的乳腺癌的患者通常分類(lèi)為具有有利的預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，評(píng)價(jià)ZNF217基因的表達(dá)水平也供用于對(duì)組合幾種“良好”預(yù)后標(biāo)志物的乳腺腫瘤亞型再分級(jí)，所述標(biāo)志物如ER+亞類(lèi)，HER2-亞類(lèi)，Luminal亞類(lèi)(ER+ 和/或PR+)，ER+/HER2-亞類(lèi)，SBRl和/或SBR2亞類(lèi)，無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)亞類(lèi)(< 3)，ER+ 和 / 或 PR+ 和 SBRl 和 / 或 SBR2 亞類(lèi)，ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2 亞類(lèi)，ER+/HER2-/SBR1 和/或SBR2/無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)(彡3)亞類(lèi)，Luminal A亞類(lèi)。顯示低增殖表型的SBRl和 /或SBR2可以由相應(yīng)亞類(lèi)中的低KI67替代。在本發(fā)明的方法中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將具有有利預(yù)后的至少一個(gè)傳統(tǒng)指示物的乳腺癌再分類(lèi)或再分級(jí)為易復(fù)發(fā)和/或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型。在一些實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將乳腺癌再分類(lèi)或再分級(jí)為對(duì)于無(wú)再發(fā)存活具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將乳腺癌再分類(lèi)或再分級(jí)為對(duì)于總存活率具有不良的預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將乳腺癌分類(lèi)為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。百分之七十的乳腺癌患者對(duì)于雌性激素受體α (ERa) 是陽(yáng)性的，因此適合于內(nèi)分泌治療，其為旨在阻斷雌性激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞促有絲分裂作用的策略。內(nèi)分泌治療中使用不同的分子選擇性雌性激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)如他莫昔芬 (tamoxifen)，其防止雌性激素與其受體結(jié)合；選擇性雌性激素受體下調(diào)劑(SERD)如氟維司群(fulvestrant) (ICI 182，780)，也可誘導(dǎo)受體去穩(wěn)定化和降解的ER拮抗劑；芳香酶抑制劑(如依西美坦(exemestane)，來(lái)曲唑(Ietrozole)，阿那曲唑(anastrozole))，其通過(guò)阻斷芳香酶活性而抑制雄激素轉(zhuǎn)化成雌性激素。因此ZNF217的表達(dá)水平也具有預(yù)測(cè)價(jià)值。在內(nèi)分泌治療下的患者中，ZNF217表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移和侵襲型乳腺癌相關(guān)聯(lián)。因此在其它實(shí)施方案中，ZNF217的表達(dá)水平也具有預(yù)測(cè)價(jià)值。在內(nèi)分泌治療和/ 或化學(xué)治療下的患者中，ZNF217表達(dá)水平和轉(zhuǎn)移和侵襲型乳腺癌相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的方法中，ZNF217基因的表達(dá)水平優(yōu)選與對(duì)照樣本比較。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照樣本是健康群體中觀察到的ZNF基因表達(dá)的中值水平。更有利地，對(duì)照樣本是取自患有乳腺癌的患者的樣本(更優(yōu)選乳腺腫瘤樣本)中 ZNF217表達(dá)的中值水平。本發(fā)明還涉及對(duì)如通過(guò)免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)和/或組織學(xué)分級(jí)確定的具有良好的預(yù)后的乳腺癌患者再分級(jí)的方法，所述方法包含測(cè)量來(lái)自至少一名患者的樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平，和如果在所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)則將所述患者再分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括通過(guò)定量ZNF217基因的mRNA而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)定量由ZNF217基因編碼的多肽而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。本發(fā)明證明患者原發(fā)性乳腺腫瘤中ZNF217的高表達(dá)水平或過(guò)量表達(dá)易再發(fā)和/ 或發(fā)展轉(zhuǎn)移。有趣的是，ZNF217表達(dá)的預(yù)后值高于乳腺癌其它預(yù)后標(biāo)志物如ERBB2/HER2和 ESR1/ER的預(yù)后值?！邦A(yù)后”是疾病可能的進(jìn)程和結(jié)果。預(yù)后可包括癌癥并發(fā)癥、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散的可能性， 癌癥的可能的結(jié)果，恢復(fù)的可能性，總存活率和/或總死亡率。優(yōu)選地，預(yù)后是患者恢復(fù)或具有癌癥的復(fù)發(fā)/再發(fā)的概率。這個(gè)信息不僅對(duì)于患者有用，對(duì)于醫(yī)生和/或臨床醫(yī)生確定最有效的療程也有用。確定癌癥再發(fā)的可能性或轉(zhuǎn)移的可能性能幫助醫(yī)生和/或臨床醫(yī)生確定是否應(yīng)采取更保守或更激進(jìn)的治療方法。預(yù)后供用于對(duì)預(yù)測(cè)為可從給定治療方案獲益的患者進(jìn)行選擇和分類(lèi)。本發(fā)明的方法在診斷為乳腺癌之后和/或癌癥的治療，特別是在內(nèi)分泌治療下的過(guò)程中為乳腺癌提供預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，ZNF217基因的過(guò)量表達(dá)與對(duì)于無(wú)再發(fā)存活具有不良/更差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，不良的預(yù)后是具有更高水平的ZNF217基因表達(dá)的癌癥患者發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)或再發(fā)的概率高于患相同癌癥但沒(méi)有ZNF217過(guò)量表達(dá)的患者。與患相同癌癥但沒(méi)有ZNF217過(guò)量表達(dá)的患者相比，來(lái)自患者的樣本中更高水平的ZNF217基因表達(dá)與患者中癌癥再發(fā)或復(fù)發(fā)的更高概率相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，不良的預(yù)后是癌癥患者從取樣之日在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年內(nèi)癌癥有至少30^^40% ,50^^60% ,70^^80%或更多的機(jī)會(huì)再發(fā)。在一些實(shí)施方案中，有 30%或更多的機(jī)會(huì)癌癥會(huì)在10年內(nèi)再發(fā)。無(wú)再發(fā)存活(Rre)定義為在原發(fā)性乳腺癌的診斷后不再發(fā)的患者的百分比。在這種情況下，Kaplan-Meier曲線(xiàn)只代表在y時(shí)間后不再發(fā)的患者的x%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不良的預(yù)后是具有較高水平的ZNF217基因表達(dá)的癌癥患者的總生存率低于患相同癌癥而無(wú)ZNF217過(guò)量表達(dá)的患者。與患相同癌癥而無(wú)ZNF217過(guò)量表達(dá)的患者相比，來(lái)自患者的樣本中更高水平的 ZNF217基因表達(dá)與癌癥對(duì)于所述患者會(huì)是致死性的更高幾率相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，不良的預(yù)后是從取樣之日起1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年內(nèi)癌癥患者具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多的機(jī)會(huì)所述癌癥會(huì)是致死性的。在一些實(shí)施方案中，有30%或更多的機(jī)會(huì)所述癌癥在5年內(nèi)會(huì)是致命性的?？偵媛?0 定義為在原發(fā)性乳腺癌的診斷后存活的患者百分比。在這種情況下，Kaplan-Meier曲線(xiàn)簡(jiǎn)單代表y時(shí)間后存活患者的x%。本發(fā)明還涉及提供乳腺癌患者中發(fā)展轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、無(wú)再發(fā)存活率(RR5)的預(yù)后或總存活率的預(yù)后(0 的預(yù)后的方法，所述方法包括a)從所述患者獲得樣本，b)測(cè)量所述樣本中ZNF217的表達(dá)水平，c)根據(jù)ZNF217測(cè)量水平預(yù)測(cè)發(fā)生轉(zhuǎn)移、RFS或OS的可能性，其中，當(dāng)ZNF217的所述水平與對(duì)照或正常樣本相比增加時(shí)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述 OS降低。本發(fā)明還涉及提供乳腺癌患者中發(fā)展轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、無(wú)再發(fā)存活率的預(yù)后(RFS)或總存活率的預(yù)后(0 的方法，所述方法包括a)從所述患者獲得樣本，b)對(duì)所述樣本測(cè)試常規(guī)的乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物，c)如果樣本具有“良好”預(yù)后的至少一個(gè)標(biāo)志物或標(biāo)志物組合，則評(píng)價(jià)所述樣本中 ZNF217基因的表達(dá)水平，d)基于ZNF217的測(cè)量水平預(yù)測(cè)發(fā)生轉(zhuǎn)移、RFS或OS的可能性，其中當(dāng)ZNF217的所述表達(dá)水平與對(duì)照或正常樣本相比增加時(shí)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述OS降低。本發(fā)明還涉及提供乳腺癌患者中發(fā)展轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、無(wú)再發(fā)存活率的預(yù)后(RFS)或總存活率的預(yù)后(0 的方法，所述方法包括a)從所述患者獲得樣本，b)對(duì)所述樣本測(cè)試常規(guī)的乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物，并評(píng)價(jià)ZNF217基因的表達(dá)水平，c)如果樣本具有至少一個(gè)預(yù)后“優(yōu)良”標(biāo)志物或標(biāo)志物組合，則評(píng)價(jià)所述樣本中 ZNF217基因的表達(dá)水平，基于ZNF217測(cè)量水平預(yù)測(cè)發(fā)生轉(zhuǎn)移、RFS或OS的可能性，其中當(dāng) ZNF217的所述水平與對(duì)照或正常樣本相比增加時(shí)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的所述可能性增加，所述RFS 降低或所述OS降低。本發(fā)明的方法包括測(cè)量來(lái)自患者的樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法為體外方法。本發(fā)明的方法在先前取自患者的生物學(xué)樣本上進(jìn)行。通常地，患者已被診斷患有乳腺癌。術(shù)語(yǔ)“樣本”指獲得自/取自患者的任何生物學(xué)樣本，包括血液樣本、血漿樣本、組織樣本、細(xì)胞樣本或腫瘤樣本。通常地，樣本包含癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，例如乳腺癌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣本是先前取自患者的乳腺腫瘤樣本。本發(fā)明的方法包括檢測(cè)或測(cè)量ZNF217基因的表達(dá)水平。ZNF217基因是首先由 Collins等描述的20ql3. 2上的候選致癌基因(Collins等，1998)。ZNF217基因的GENBANK 登錄號(hào)是 NC_000020. 10 (RefSeq :NM_006526. 2)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”可指測(cè)量基因的轉(zhuǎn)錄水平和/或翻譯水平。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)定量ZNF217基因轉(zhuǎn)錄物(mRNA)而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過(guò)定量由ZNF217基因編碼的多肽而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。在其它實(shí)施方案中，可以間接通過(guò)測(cè)量可調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA(如miRNA) 而評(píng)價(jià)ZNF217mRNA的量。MicroRNA(miRNA)是可結(jié)合目標(biāo)信使RNA轉(zhuǎn)錄物(mRNA)的3’ 未翻譯區(qū)(3’ UTR)中互補(bǔ)序列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子，通常引起基因沉默。miRNA是短核糖核酸(RNA)分子，平均僅22個(gè)核苷酸長(zhǎng)。人類(lèi)基因組可以編碼1000個(gè)以上的miRNA，其可靶向約60%的哺乳動(dòng)物基因，并且在很多人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型中是豐富的。每個(gè)miRNA可以抑制上百個(gè)mRNA。miRNA在真核生物體中非常保守，被認(rèn)為是基因調(diào)控的至關(guān)重要并且進(jìn)化上古老的元件。其后，miRNA研究已揭示了其在負(fù)調(diào)控中的多種作用(轉(zhuǎn)錄物降解和掩蔽，翻譯抑制)并可能參與正調(diào)控(轉(zhuǎn)錄和翻譯活化)。通過(guò)影響基因調(diào)控，miRNA可能參與大多數(shù)生物過(guò)程。已經(jīng)在大量疾病狀態(tài)中出現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)，并且基于miRNA的療法正在研究當(dāng)中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾個(gè)miRNA與一些類(lèi)型的癌癥有關(guān)。通過(guò)技術(shù)人員已知的多種方法中的任何方法確定ZNF217基因的表達(dá)水平。例如通過(guò)下述方法定量ZNF217基因的mRNA或轉(zhuǎn)錄物雜交或反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增 (RT-PCR)，然后通過(guò)任何已知的方法定量檢測(cè)產(chǎn)物。在本發(fā)明的方法中可以使用任何定量擴(kuò)增方法。優(yōu)選地，用 SEQ ID NO. 1(5，-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3，)的引物和 SEQ ID NO. 2(5，-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3，)的引物進(jìn)行定量 RT-PCR。例如通過(guò)免疫印跡、ELISA、質(zhì)譜或結(jié)合試驗(yàn)定量ZNF217多肽。優(yōu)選地，在結(jié)合試驗(yàn)中用一個(gè)或幾個(gè)抗-ZNF217抗體測(cè)量ZNF217多肽水平。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)來(lái)自患者的腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平，并將所述表達(dá)水平與對(duì)照表達(dá)水平或?qū)φ諛颖局械谋磉_(dá)水平相比較。基于癌/腫瘤中ZNF的表達(dá)是否高于對(duì)照而確定癌/腫瘤的侵襲性和預(yù)后。術(shù)語(yǔ)“過(guò)量表達(dá)”指統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于對(duì)照樣本中檢測(cè)的表達(dá)水平的表達(dá)水平。如果表達(dá)水平比對(duì)照樣本中檢測(cè)的表達(dá)水平高至少10%、25%、50%、75%、100% 或更高，則將ZNF217的表達(dá)水平鑒定為“過(guò)量表達(dá)”或“高于”對(duì)照。對(duì)照可以是“正?！睂?duì)照樣本，意指非腫瘤細(xì)胞對(duì)照樣本或非癌細(xì)胞對(duì)照樣本。對(duì)照樣本可以是獲得自患者的自體對(duì)照樣本。在這種情況下，從獲得待評(píng)價(jià)樣本的同一患者獲得對(duì)照樣本。對(duì)照樣本優(yōu)選來(lái)自同一細(xì)胞類(lèi)型或來(lái)自同一器官。對(duì)照樣本可為獲得自未患癌的個(gè)體的正常對(duì)照樣本。正常對(duì)照樣本也可以是標(biāo)準(zhǔn)樣本，其包含在生物樣本中正常發(fā)現(xiàn)的相同量的 ZNF217。正常對(duì)照樣本也可以是取自至少5、10、15、20或更多個(gè)不同患者的樣本中ZNF217 表達(dá)的中值水平，所述患者患有乳腺癌或患有相同亞型的乳腺癌。對(duì)照樣本優(yōu)選收集自組織庫(kù)(Tissue Bank)或生物資源中心(ResourcesBiological Center)，其中患者的完整臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息是可用的。如果與對(duì)照樣本相比較，待評(píng)價(jià)樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥分類(lèi)或再分類(lèi)為易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或患有或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型的乳腺癌。本發(fā)明還涉及鑒定易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或患有或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型的癌癥的試劑盒，其包含源自ZNF217基因的引物和/或探針，和用于比較ZNF217基因表達(dá)水平的對(duì)照樣本。本發(fā)明還涉及鑒定易復(fù)發(fā)的腫瘤和/或患有或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型的腫瘤的試劑盒，其包含ZNF217抗體，和用于比較ZNF217基因表達(dá)水平的對(duì)照樣本。試劑盒還可以包含陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和進(jìn)行本發(fā)明的方法所需的任何試劑或任何裝置。
本發(fā)明的方法和試劑盒還可以包含“不變”對(duì)照，其可為看家基因的表達(dá)水平。本發(fā)明還涵蓋用于實(shí)施本發(fā)明的方法的所述試劑盒的用途，和具體地鑒定易復(fù)發(fā)的癌癥和/或患有或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型的癌癥或確定癌癥預(yù)后。附圖簡(jiǎn)述

圖1 :MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中ZNF217的過(guò)量表達(dá)。用抗-ZNF217抗體通過(guò) Western印跡分析來(lái)自細(xì)胞系的全部蛋白提取物。將α -微管蛋白的表達(dá)用作不變對(duì)照。圖2 :ZNF過(guò)量表達(dá)對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞系中細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的影響。(A)如材料和方法部分所述，使用BrdU標(biāo)記試劑盒分析增殖細(xì)胞。結(jié)果表示為來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 s. d.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。**根據(jù)Mudent's t-檢驗(yàn)，與相應(yīng)的 MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞相比，P < 0. 01。(B)ZNF_217轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E2蛋白表達(dá)水平的Western印跡分析。將α-微管蛋白的表達(dá)用作不變對(duì)照。圖3 :MDA-MB-231細(xì)胞中ZNF217的過(guò)量表達(dá)增加了它們?cè)谲洯傊行纬删涞哪芰?。?-孔板中將MDA-MB-231對(duì)照、ZNF217-1和ZNF217-2細(xì)胞涂布在含0. 45%瓊脂的10% FCS-DMEM上(10000個(gè)細(xì)胞/孔)。在涂布后20天拍攝顯微照片(圖㈧和計(jì)數(shù) (B))。結(jié)果表示為來(lái)自至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 s. d.。根據(jù)Mudent's t_檢驗(yàn)， 與相應(yīng)的MDA-MB-231相比，P < 0. 001。所有圖像均在1. 25倍放大倍數(shù)下拍攝。圖4 博伊登小室侵襲試驗(yàn)。在包含熒光-阻斷多孔聚碳酸酯膜插片的Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室中進(jìn)行對(duì)照、ZNF217-1和ZHF217-2細(xì)胞侵襲的定量。通過(guò)熒光在濾膜下側(cè)檢測(cè)通過(guò)Matrigel侵襲的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)濾膜的全部表面，并且對(duì)于每種條件將每個(gè)試驗(yàn)一式三份進(jìn)行兩次。結(jié)果表示為平均值士s. d.。圖5 對(duì)照、ZNF217-1和ZNF217-2細(xì)胞侵襲培養(yǎng)試驗(yàn)。(A)在Matrigel中培養(yǎng)1、 4、7、11、14和18天后來(lái)自至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表圖片。所有圖片均在1.5倍的放大倍數(shù)下拍攝。(B)使用ImageJ軟件測(cè)量對(duì)照(白色柱)、ZNF217_1 (黑色柱)和ZNF217-2 (灰色柱)細(xì)胞的Matrigel侵襲面積。結(jié)果表示為來(lái)自至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士s. d.。** 根據(jù) Mudent，s t_ 檢驗(yàn)，P < 0. 01 和 ***P < 0. 001。圖6 :ZNF217促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移(創(chuàng)傷愈合)將對(duì)照或過(guò)量表達(dá)ZNF217的MDA_MB_231細(xì)胞的匯合單層通過(guò)刮擦受傷，并在0 小時(shí)(H 小時(shí)(H 26)拍攝照片。圖片是至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表，并在2. 5倍放大倍數(shù)下拍攝。圖7 :ZNF217誘導(dǎo)表皮乳腺M(fèi)CFlOA細(xì)胞中的EMT。(A) 10倍放大倍數(shù)下MCFlOA-對(duì)照和MCF10A-ZNF217細(xì)胞形態(tài)的代表圖片。(B)如材料和方法部分所述，使用特定抗體對(duì) ZNF217、表皮標(biāo)志物(E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白和遮光蛋白)和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(波形蛋白和纖連蛋白)進(jìn)行的Western印跡分析。測(cè)量微管蛋白的表達(dá)作為不變對(duì)照。顯示的Western印跡來(lái)自至少三次獨(dú)立試驗(yàn)的一個(gè)代表實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞裂解物。圖8 :ZNF217mRNA水平的預(yù)后值。(A)來(lái)自CLBl群的乳腺腫瘤中RFS的 Kaplan-Meier曲線(xiàn)(對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試分析)。⑶來(lái)自CLBl群的乳腺腫瘤中OS的Kaplan-Meier 曲線(xiàn)(對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試分析)。圖9 來(lái)自CLB2群的乳腺腫瘤(n = 113)中ZNF217mRNA水平的預(yù)后值。RFS的Kaplan-Meier曲線(xiàn)(對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試分析)。圖10 來(lái)自CLB2群的ER-陽(yáng)性(ER+)乳腺腫瘤(n = 68)中ZNF217mRNA水平的預(yù)后值。RFS的Kaplan-Meier曲線(xiàn)(對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試分析)。圖 11 來(lái)自 CLB2 群的 ER+ 和 HER2-陰性(HER2-)乳腺腫瘤(n = 57)中 ZNF217mRNA 水平的預(yù)后值。RFS的Kaplan-Meier曲線(xiàn)(對(duì)數(shù)級(jí)測(cè)試分析)。圖12 :ZNF217和ER表達(dá)水平在乳腺癌細(xì)胞中相關(guān)聯(lián)。用抗-ZNF217和抗-ER α抗體通過(guò)Western印跡分析來(lái)自細(xì)胞系的總蛋白提取物。將α -微管蛋白的表達(dá)用作不變對(duì)照。(A)組成型表達(dá)ER的MDA-MB-231乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(S30細(xì)胞)中ZNF217的過(guò)量表達(dá)。(B)在用亂序 RNA(亂序的 MCF7)或用 siRNA_ZNF217 (MCF7siRNA_ZNF217)轉(zhuǎn)染的 MCF7 細(xì)胞中ZNF217和ERa表達(dá)的Western-印跡分析。圖13 在OH-Tam-抗性CL6. 7細(xì)胞中存在siRNA_ZNF217的情況下逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌抗性。用抗-ZNF217通過(guò)Western印跡分析來(lái)自細(xì)胞系的總蛋白提取物。將α-微管蛋白的表達(dá)用作不變對(duì)照。(A)在用亂序RNA或siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)染的MVLN和CL6. 7細(xì)胞中 ZNF217的Wfestern-印跡分析。(B)在存在或不存在200nM OH-Tam的情況下，用亂序RNA 或siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)染的MVLN和CL6. 7細(xì)胞的細(xì)胞增殖(BrdU測(cè)試)。這個(gè)試驗(yàn)在無(wú)甾醇培養(yǎng)基中進(jìn)行。當(dāng)P < 0. 05時(shí)認(rèn)為P-值(Mudent ’ s t_檢驗(yàn))顯著。
實(shí)施例材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)MCF7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自ATCC，并根據(jù)推薦在補(bǔ)加10 %胎牛血清anvitrogen，Cergy Pontoise, Paris)的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。S30細(xì)胞和它們的 MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞先前已經(jīng)描述(Levenson等，2003)。內(nèi)分泌抗性的細(xì)胞模型(MVLN和 CL6. 7細(xì)胞)先前已建立并描述(Demirpence等，1993)。MDA-MB-231-ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子使用 pcDNA6/V5-His 質(zhì)粒(Invitrogen, Cergy Pontoise, Paris),用全 長(zhǎng)ZNF217cDNA構(gòu)建ZNF217表達(dá)質(zhì)粒。簡(jiǎn)言之，通過(guò)向由Collins博士慷慨提供的 PEGFP-N1-ZNF217質(zhì)粒加入缺失的cDNA序列(編碼ZNF217蛋白的最后6個(gè)C-末端氨基酸)而獲得全長(zhǎng)ZNF217cDNA，然后將所述cDNA亞克隆入pcDNA6/V5_His質(zhì)粒 (pcDNA6/V5-His-ZNF217)。根據(jù)ATCC推薦培養(yǎng)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞(具備低內(nèi)源水平的 ZNF217)，然后用 6 μ g 空 pcDNA6/V5-His 質(zhì)?；?pcDNA6/V5-His_ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在存在20yg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen)的情況下選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群。然后分離兩個(gè)MDA-MB-231-ZNF217細(xì)胞克隆(稱(chēng)作ZNF217-1和ZNF217-2)。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，使用 Qiagen(Germantown，MD, USA)RNA 提取試劑盒提取總 RNA。使用 BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)評(píng)價(jià) RNA 質(zhì)量。MCF10A-ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子根據(jù)ATCC推薦培養(yǎng)MCF10A細(xì)胞，其是永生化的但未轉(zhuǎn)化的來(lái)自乳腺組織的人類(lèi)乳房表皮細(xì)胞(Soule 等，1990)。用 6 μ g 空 pcDNA6/V5_His 質(zhì)?；?pcDNA6/V5-His_ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在存在20yg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen)的情況下選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群。
實(shí)時(shí)定量PCR(RTQ-PCR)分析將來(lái)自每個(gè)樣本的一微克總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并如前所述(Girault等， 2003 ；Vendrell 等，2005)，使用 LightCycler 480 (Roche, Meylan, France)或 ABI Prism7700 序列檢測(cè)系統(tǒng)(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，用相應(yīng)的STOR Green試劑盒進(jìn)行RTQ-PCR測(cè)量。設(shè)計(jì)正向引物 5，-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3，和反向引物 5，-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3，特異性地靶向ZNF217轉(zhuǎn)錄物(NM_006526. 2)。靶向ESRl (雌激素受體α)轉(zhuǎn)錄物的引物是正向引物 5，-TGTTCCAAACCCATCGTCAGT-3’ ；反向引物 5，-CTCTATAACCAATGACCTCTCTGTGAA -3，。靶向ERBB2轉(zhuǎn)錄物的引物是正向引物5，-ACTGGCCCTCATCCACCATA-3，；反向引物 5， -GGTTGGCAGTGTGGAGCAG-3，。Western 印跡如前所述(Vendrell等，2004)進(jìn)行細(xì)胞提取物制備和^iestern印跡分析。由 Covalab (Lyon, France)制備ZNF217抗體；Ε-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白和纖連蛋白抗體購(gòu)自BD Biosciences (Franklin Lakes，NJ，USA)。遮光蛋白抗體來(lái)自Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA), ^ SJfiftt g Dako (Glostrup, Denmark), M 胞周期蛋白 E2 和 ERa 抗體來(lái)自 Santa CruzBiotechnology Inc. (Santa Cruz，CA，USA)，細(xì)胞周期蛋白Dl抗體來(lái)自Cel ISignaling (Beverly，MA, USA)，而細(xì)胞周期蛋白Α2和α-微管蛋白抗體來(lái)自 Sigma Chemical Co. (St. Louis，M0，USA)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)(BrdU)使用細(xì)胞增殖ELISA，BrdU (比色)試劑盒(Roche，Meylan, France)分析增殖細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，用5-溴脫氧尿苷(BrdU)將細(xì)胞標(biāo)記M小時(shí)，并根據(jù)生產(chǎn)商的推薦使用特定的抗-BrdU抗體鑒定標(biāo)記的核。軟瓊脂菌落形成試驗(yàn)首先用包含0. 75%瓊月旨(Seaplaque Agarose , Lonza, Basel, Switzerland)的瓊脂層在補(bǔ)加10% FCS(Gibco)的DMEM覆蓋六孔板。然后將MDA-MB-231對(duì)照、ZNF217-1 和ZNF217-2細(xì)胞懸浮于包含0. 45%瓊脂的10% FCS-DMEM中并涂布入孔中(10000個(gè)細(xì)胞每孔)。將培養(yǎng)物返回至培養(yǎng)箱并每2天補(bǔ)加10% FCS-DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基。二十天后，用 0.005%結(jié)晶紫(Sigma-Aldrich，SaintQuentin Fallavier, France)將細(xì)胞染色 1 小時(shí)。 然后在1. 25倍的放大倍數(shù)下拍攝菌落的顯微照片。博伊登小室侵襲試驗(yàn)在包含熒光阻斷多孔聚碳酸酯膜插片(Fluoroblock ;BD Biosciences ；孔大小為 8 μ m)的Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室中進(jìn)行細(xì)胞侵襲的定量。在Transwell室中制備生長(zhǎng)因子降低的100 μ 1 2mg/ml Matrigel (來(lái)自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤的商業(yè)上制備的重組基底膜；BD Biosciences)。將細(xì)胞培養(yǎng)為單層細(xì)胞，然后胰蛋白酶化并涂布在位于Transwell 裝置上部小室內(nèi)厚層Matrigel (約500 μ m)頂層上包含2% FCS的培養(yǎng)基中(105)。對(duì)照不做處理。然后分別用含2%和10% FCS的培養(yǎng)基填充上部和下部小室，從而建立化學(xué)誘劑的可溶性梯度，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)Matrigel的侵襲。將細(xì)胞在37°C儲(chǔ)存于5% CO2中并允許通過(guò)凝膠遷移，然后在3. 7%甲醛中固定15分鐘。通過(guò)熒光檢測(cè)濾膜下側(cè)上侵襲通過(guò)Matrigel 的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)濾膜的全部表面，并且對(duì)于每種條件將每個(gè)試驗(yàn)一式三份進(jìn)行兩次。
Matrigel 侵襲分析將厚層Matrigel (600 μ 1) (BD Biosciences)覆蓋在 8_ 孔 LabTec 小室玻片上，并進(jìn)行部分聚合。將一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞懸浮于1 μ 1 DMEM中，并接種于Matrigel層中間。在37°C溫育30分鐘后，我們加入150 μ 1 DMEM ；每2天更換培養(yǎng)基。一式三份分析樣本。使用Centre Commun de Quantimetrie (Lyon, UniversiteClaude Bernard,法國(guó))白勺{到:B Diavert H微鏡(Leica Microsystems，Rueil-Malmaison，法國(guó)，1. 5 倍放大倍數(shù))，每 1、4、7、11、14 和 18 天拍攝照片。使用由National Institute of Health(USA)開(kāi)發(fā)的ImageJ軟件測(cè)量經(jīng)過(guò) Matrigel的細(xì)胞侵襲的數(shù)量/數(shù)量級(jí)(magnitude)。創(chuàng)傷愈合使用創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的改變。將細(xì)胞以DMEM中2. 5x IO6個(gè)細(xì)胞涂布在 60-mm 培養(yǎng)板上。在 Centre Commun de Quantimetrie(Lyon)使用 P-200 移液器尖端將匯合的單層通過(guò)刮擦受傷，并在O小時(shí)和26小時(shí)拍攝照片(2. 5倍放大倍數(shù))。基因沉默由 hvitrogen 獲得靴向 ZNF217 的 Stealth siRNA(siRNA_ZNF217)和亂序的對(duì)照 RNA(亂序的)。用 lipofectamin RNAimax(Invitrogen)將五納摩爾 siRNA_ZNF217 或亂序的轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系。CLBl 群來(lái)自 Centre Leon Berard 的乳腺腫瘤樣本(n = 47)我們選擇了 47個(gè)獲得自在Centre Leon B6rard(Lyon，法國(guó))手術(shù)的女性的原發(fā)性乳腺腫瘤樣本(表1)。已獲得全部患者的知情同意，并且實(shí)驗(yàn)得到機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。乳腺腫瘤樣本切除自手術(shù)前未接受內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療或放射性治療的女性。在進(jìn)行化學(xué)治療和/或內(nèi)分泌治療時(shí)，十四名患者發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met+組)，而33名患者未發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met-組)。標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后因子如表1所示。患者(平均年齡53歲；范圍40-8 符合下述標(biāo)準(zhǔn)原發(fā)性單側(cè)乳腺癌；可用的完整的臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息；術(shù)前未進(jìn)行放射性治療或化學(xué)治療；和在CentreI^on B6rard的完全隨訪。在手術(shù)時(shí)確立陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)的組織學(xué)類(lèi)型和數(shù)目。根據(jù)karff-Bloom-Richardson (SBR)組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)(Bloom和 Richardson, 1957)給浸潤(rùn)癌瘤的惡性評(píng)分。使用x 2檢驗(yàn)，兩組間在年齡、組織學(xué)等級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小或雌激素受體狀態(tài)上沒(méi)有顯著差異(表1)。通過(guò)免疫組織化學(xué)確定雌激素受體α (ER)狀態(tài)。Met+組的患者在術(shù)后0.6-4. 6年之間發(fā)展轉(zhuǎn)移。手術(shù)后立即將腫瘤樣本放在液氮中，直至RNA提取。使用Macherey-Nagel (Hoerd，F(xiàn)rance) RNA提取試劑盒,根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，提取總 RNA。使用 BioAnalyzer2100 (Agilent Technologies,Palo Alto, CA, USA)評(píng)價(jià) RNA 質(zhì)量。來(lái)自Centre ReneHuguenin的乳腺腫瘤樣本我們選擇了 48個(gè)獲得自在Centre ReneHuguenin (St Cloud，法國(guó))手術(shù)的女性的 ER+原發(fā)性乳腺腫瘤樣本(表2)。已獲得全部患者的知情同意，并且實(shí)驗(yàn)得到機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。腫瘤取自原始手術(shù)后僅輔助內(nèi)分泌治療的患者。在進(jìn)行內(nèi)分泌治療時(shí)，二十四名患者再發(fā)并發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met+組)，而M名患者未再發(fā)和發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met-組)。標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后因子如表2所示?；颊?平均年齡70. 7歲；范圍力4-86)符合下述標(biāo)準(zhǔn)原發(fā)性單側(cè)絕經(jīng)后乳腺癌；可用的完整的臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息；術(shù)前未進(jìn)行放射性治療或化學(xué)治療；和在Centre ReMHuguenin的完全隨訪。在手術(shù)時(shí)確立陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)的組織類(lèi)型和數(shù)目。根據(jù)SBR組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)(Bloom和Richardson，1957)給浸潤(rùn)腫瘤的惡性評(píng)分。使用X2 檢驗(yàn)，兩組間在年齡、組織學(xué)等級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)或腫瘤大小上沒(méi)有顯著差異(表幻。通過(guò)使用定量生物化學(xué)方法(葡聚糖-炭末法或酶免疫試驗(yàn))在蛋白質(zhì)水平確定ER狀態(tài)，并通過(guò) RTQ-PCR確認(rèn)。所有患者都接受術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療(他莫昔芬，每天20mg，持續(xù)3-5年) 而不進(jìn)行其它治療。Met+組的患者在術(shù)后和他莫昔芬治療開(kāi)始時(shí)1. 3-10. 0年之間發(fā)展轉(zhuǎn)移。手術(shù)后立即將腫瘤樣本放在液氮中，直至RNA提取。通過(guò)酸-酚胍鹽方法從冷凍腫瘤樣本提取總RNA。通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。CLB2 群來(lái)自 Centre Leon Berard 的乳腺腫瘤樣本(n = 113)我們選擇了 113個(gè)獲得自在Centre Leon B6rard(Lyon，法國(guó))手術(shù)的女性的原發(fā)性乳腺腫瘤樣本(表7)。已獲得全部患者的知情同意，并且實(shí)驗(yàn)得到機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。乳腺腫瘤樣本采自手術(shù)前未接受內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療或放射性治療的女性。在進(jìn)行化學(xué)治療和/或內(nèi)分泌治療時(shí)，十九名患者再發(fā)(再發(fā)組)，而94名患者未再發(fā)(無(wú)再發(fā)組)。 標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后因子如表7所示?；颊?平均年齡53歲；范圍40-8 符合下述標(biāo)準(zhǔn)原發(fā)性單側(cè)乳腺癌；可用的完整的臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息；術(shù)前未進(jìn)行放射性治療或化學(xué)治療； 和在Centre Leon B6rard的完全隨訪。在手術(shù)時(shí)確立陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)的組織類(lèi)型和數(shù)目。 根據(jù)SBR組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)(Bloom和Richardson，1957)給浸潤(rùn)腫瘤的惡性評(píng)分。通過(guò)免疫組織化學(xué)確定ER和黃體酮受體(PR)狀態(tài)。通過(guò)免疫組織化學(xué)確定HER2狀態(tài)并通過(guò)FISH 對(duì)少量樣本進(jìn)行驗(yàn)證。使用χ 2檢驗(yàn)，兩組間在年齡、組織學(xué)等級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小、ER 狀態(tài)、I3R狀態(tài)或HER2狀態(tài)上沒(méi)有顯著差異(表7)。再發(fā)組的患者在術(shù)后0. 5-4. 5年之間發(fā)展轉(zhuǎn)移。手術(shù)后立即將腫瘤樣本放在液氮中，直至RNA提取。使用Macherey-Nagel RNA提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的推薦提取總RNA。使用BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies) 評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量。CLB2群中乳腺癌亞型的分類(lèi)使用目前臨床使用的免疫組織化學(xué)和臨床病理學(xué)參數(shù)，將乳腺腫瘤分為以下分子亞組Luminal 亞類(lèi)(ER+ 和 / 或 PR+)，HER2+ 亞類(lèi)(ER-/PR-/HER2+)和 iTriple 陰性亞類(lèi) (ER-/PR-/HER2-)。根據(jù) Hugh 等 0009)和 Cheang 等 0009)或 Mi Ilar 等 0009)和 Nguyen 等O008)給出的分類(lèi)將Luminal亞類(lèi)再分類(lèi)為L(zhǎng)uminal A和Luminal B亞組。在第一種分類(lèi)中，Luminal A乳腺腫瘤為ER+和/或PR+、HER2_和低增殖指數(shù)(由低KI67給出或由 SBRl和SBR2給出)，而Luminal B具有ER+和/或PR+，還具有HER2+或高增殖指數(shù)(高 KI67或SBR!3)狀態(tài)；在第二種分類(lèi)中，Luminal A腫瘤是具有ER+和/或PR+而且HER2-狀態(tài)的乳腺癌，而Luminal B腫瘤僅具有ER+和/或PR+和HER2+。統(tǒng)計(jì)分析使用Statgraphics 3plus 軟件(Statgraphics Centurion, Herndon, VA, USA)，用 Mann-Whitney檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)檢驗(yàn)進(jìn)行RTQ-PCR的統(tǒng)計(jì)分析。置信水平大于95%的結(jié)果(P < 0. 05)視為顯著。對(duì)于每個(gè)基因，將乳腺腫瘤群分為2組一個(gè)為“低”mRNA水平 (低于所有乳腺腫瘤樣本的mRNA水平中值)，而另一個(gè)為“高”mRNA水平(高于所有乳腺腫瘤樣本的mRNA水平中值)。感興趣的事件是總存活(0 和無(wú)再發(fā)存活(REQ。從診斷之日起至死亡或在最后一次隨訪時(shí)檢查通過(guò)期間測(cè)量0S。從診斷之日至再發(fā)或在最后一次隨訪時(shí)檢查通過(guò)期間測(cè)量RFS。通過(guò)Kaplan-Meier方法估計(jì)存活率分布，并使用SPSS 軟件(Chicago, IL, USA)，通過(guò)對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn)(單變量分析)確定存活率之間的差異顯著性。因?yàn)楸狙芯繛樘剿餍苑治?，所以全部統(tǒng)計(jì)分析在0. 05顯著性水平進(jìn)行，并且未對(duì)多次測(cè)試施以校正。在多變量Cox模型中輸入單變量分析中0. 10顯著水平的RFS的候選預(yù)后因子，并使用反向選擇過(guò)程建立最終的模型。結(jié)果MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中ZNF217過(guò)量表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖建立組成型過(guò)量表達(dá)ZNF217蛋白的穩(wěn)定MDA_MB_231乳腺癌細(xì)胞(參見(jiàn)材料和方法)。選擇這些細(xì)胞是因?yàn)樗鼈兊膬?nèi)源ZNF217表達(dá)水平低。用包含ZNF217全長(zhǎng)cDNA序列的真核表達(dá)載體pcDNA6/V5-His或用作陰性對(duì)照的空載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。在殺稻瘟菌素選擇后，選擇過(guò)量表達(dá)ZNF217mRNA和蛋白的兩個(gè)細(xì)胞克隆(ZNF217-1和ZNF217-2) 以及用空pcDNA6/V5-His轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞)。ZNF217-1和ZNF217-2 細(xì)胞中的ZNF217mRNA水平分別為MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞的2. 0至3. 5倍(數(shù)據(jù)未給出)。 因此,與MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞相比，ZNF217-1和ZNF217-2細(xì)胞中ZNF217蛋白表達(dá)分別增加5. 4和5. 1倍(圖1)。因此，可觀察到在mRNA水平和蛋白水平，ZNF217的表達(dá)之間有良好的一致性。在使用BrdU標(biāo)記的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，ZNF217-1和ZNF217-2中ZNF217過(guò)量表達(dá)與細(xì)胞增殖增加(圖2A)和細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白Dl和細(xì)胞周期蛋白E2的表達(dá)增加(圖2B)相關(guān)。ZNF217促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的非貼壁依賴(lài)性生長(zhǎng)、遷移和體外浸潤(rùn)性。非貼壁依賴(lài)性增殖是惡性細(xì)胞在體內(nèi)形成腫瘤的標(biāo)志(Irshad等，2004 ；Lee等， 2004)，被認(rèn)為與高度轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞相關(guān)(Glondu等，2002 ；Muraoka-Cook等，2004)，并且能通過(guò)軟瓊脂菌落形成而測(cè)定。因此我們接著檢查了不同細(xì)胞群中ZNF217過(guò)量表達(dá)對(duì)軟瓊脂菌落形成的影響。我們發(fā)現(xiàn)與MDA-MB-231對(duì)照細(xì)胞相比，當(dāng)ZNF217過(guò)量表達(dá)時(shí)形成的 ZNF217-1和ZNF217-2菌落增加約67倍和70倍(圖3)?；啄さ钠茐幕驖B透被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的必需步驟。強(qiáng)遷移能力是腫瘤惡性的另一個(gè)標(biāo)志(Gupta和Massague，2006)。在多項(xiàng)研究中，高度轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在使用博伊登小室進(jìn)行的體外浸潤(rùn)試驗(yàn)(Chen等，2006 ；Galaup等，2006)和創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)(Hu 和Verkman，2006)中表現(xiàn)出上調(diào)的遷移性。因此我們?cè)噲D研究ZNF217過(guò)量表達(dá)是否影響腫瘤浸潤(rùn)和/或遷移。我們?cè)隗w外博伊登小室試驗(yàn)(圖4)中研究了 ZNF217-1、ZNF217-2 和對(duì)照細(xì)胞的浸潤(rùn)性，其中將細(xì)胞涂布在模擬生理基底膜的厚層Matrigel頂部。圖4顯示，隨著ZNF217的表達(dá)，浸潤(rùn)性顯著增加，在兩個(gè)克隆中有相似的變化。與對(duì)照細(xì)胞相比， 2順217-過(guò)量表達(dá)克隆中的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)高6.3和7。Matrigel浸潤(rùn)試驗(yàn)提供了支持?jǐn)?shù)據(jù)，也清楚地證明了 ZNF217-1和ZNF217-2細(xì)胞的浸潤(rùn)性質(zhì)(圖5)。MDA-MB-231細(xì)胞中ZNF217 的過(guò)量表達(dá)也導(dǎo)致遷移性增加，如創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)所證明的(圖6)。總之，這些結(jié)果表明了 ZNF217在乳腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)性以及非貼壁依賴(lài)性生長(zhǎng)中的重要作用。ZNF217誘導(dǎo)表皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)移(EMT)因?yàn)橐呀?jīng)證明EMT與癌細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)(Yilmaz和Christofori，2009)，所以我們接著檢查人類(lèi)乳腺表皮細(xì)胞MCFlOA (Soule等，1990 ；Tait等，1990)中ZNF217的影響。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCFlOA細(xì)胞中ZNF217的過(guò)量表達(dá)足以觸發(fā)EMT的一些形態(tài)學(xué)特征，包括成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，這些特征與表皮標(biāo)志物(E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、連環(huán)蛋白、遮光蛋白)的顯著降低和間充質(zhì)蛋白水平(波形蛋白和纖連蛋白)的增加有關(guān)(圖7)。因此我們提出促進(jìn)EMT的能力是潛藏于ZNF217浸潤(rùn)能力增強(qiáng)之下的另一個(gè)重要特征。ZNF217是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物為了研究ZNF217的臨床相關(guān)性，我們通過(guò)RTQ-PCR考察了在CentreI^on B6rard(法國(guó))收集的47個(gè)乳腺腫瘤樣本(CLB1群)中ZNF217mRNA水平(表1)。使用 Marm-Whitney檢驗(yàn)，我們用臨床和病理學(xué)參數(shù)比較了 ZNF217的表達(dá)(表3)；在任何一種情況下都沒(méi)有觀察到顯著的相關(guān)性。因?yàn)樗鋈河稍诨瘜W(xué)治療和/或內(nèi)分泌治療時(shí)發(fā)展轉(zhuǎn)移 (術(shù)后0. 6和4. 6年)(Met+組，η = 14)或未轉(zhuǎn)移(Met-組，η = 33)的女性組成，所以我們?cè)u(píng)價(jià)了這兩組患者的ZNF217表達(dá)水平。如表4所示，高ZNF217mRNA水平與轉(zhuǎn)移的發(fā)展顯著相關(guān)(Met+組中顯著的ZNF217mRNA過(guò)量表達(dá)，P = O. 002，Mann-Whitney檢驗(yàn))。然后我們使用單變量分析(對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn))進(jìn)一步研究ZNF217的預(yù)后值。單變量分析顯示ZNF217mRNA的高表達(dá)水平與較短的RFS顯著相關(guān)(P = 0. 003，表5和圖8A)。沒(méi)有觀察到在ZNF217mRNA水平和OS之間顯著的相關(guān)性，但存在接近顯著的趨勢(shì)(P = 0. 15， 表6和圖8B)。然后我們?cè)u(píng)價(jià)了不同地理來(lái)源的乳腺癌患者獨(dú)立群中我們的發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性。該群由Centre Rer^Huguenin (法國(guó))收集，由在內(nèi)分泌治療時(shí)發(fā)展或未發(fā)展轉(zhuǎn)移( 個(gè)Met+ 樣本和M個(gè)Met-樣本)的ER+乳腺癌患者組成。同樣地，發(fā)現(xiàn)與Met-組(中值=1. 0 ； 范圍0. 21-2. 15 ；P = 0. 0003，Mann-Whitney 檢驗(yàn))相比，在 Met+組中 ZNF217 表達(dá)顯著上升(中值=2. 4 ；范圍0. 24-14. 62)，并且ZNF217的高表達(dá)水平與更短的RFS (P = 0. 039， 對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn))顯著相關(guān)。因此我們確認(rèn)，在兩個(gè)不同的乳腺癌患者群中，第一，易發(fā)展轉(zhuǎn)移的患者的原發(fā)性乳腺腫瘤中ZNF217高表達(dá)水平的存在和，第二，ZNF217與RFS的顯著相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ZNF217能代表一種新的不良預(yù)后標(biāo)志物。ERBB2 (HER2)是乳腺癌中一種公知的不良預(yù)后標(biāo)志物。ERBB2表達(dá)水平與RFS或 OS沒(méi)有顯著相關(guān)性(表5和6)。然而，對(duì)于RFS可以觀察到接近顯著的趨勢(shì)(P = 0.09， 對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)；表5)。也沒(méi)有ESRl (ER α )表達(dá)水平和RFS或OS相關(guān)的證據(jù)(表5和6)。 以單變量分析中0. 10的顯著性水平使用RFS的候選預(yù)后因子進(jìn)行RFS的Cox多變量回歸分析(ZNF217和ERBB2)。最有趣的發(fā)現(xiàn)是在多變量分析中(P = 0. 002 ；HR = 9. 56 ；95% CI ； 1. 57至31. 59 ；表5)，只有ZNF217的預(yù)后值保持顯著?？偠灾?，這些結(jié)果證明，第一， ZNF217是易發(fā)展轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中與RFS相關(guān)的新預(yù)后標(biāo)志物，和第二，ZNF217的預(yù)后值可以提供的信息比ERBB2更多。最后，我們通過(guò)來(lái)自60個(gè)乳腺腫瘤樣本的先前研究的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)的回溯統(tǒng)計(jì)分析研究了我們的發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性，所述樣本來(lái)自在使用他莫昔芬時(shí)已發(fā)展轉(zhuǎn)移或未發(fā)展轉(zhuǎn)移的患者( 個(gè)Met+和32個(gè)Met-) (Ma等，2004)。基于這個(gè)基因表達(dá)譜研究的數(shù)據(jù)， 我們發(fā)現(xiàn)Met+樣本中ZNF217的表達(dá)水平顯著高于Met-樣本(P = 7. 5x 1 (T4，Mann-Whitney 檢驗(yàn))，而且ZNF217的高表達(dá)水平與RFS顯著相關(guān)(P = 0. 01 ；對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn))，因此驗(yàn)證了我們的發(fā)現(xiàn)。ZNF217在分類(lèi)為“具有良好預(yù)后的腫瘤”的乳腺腫瘤中具有較高的預(yù)后值使用由Centre ReneBerard收集的113個(gè)乳腺腫瘤樣本的新群(稱(chēng)為CLB2群) (表7)研究在乳腺腫瘤的特定亞類(lèi)中ZNF217的預(yù)后值是否仍存在或改進(jìn)。
使用Marm-Whitney檢驗(yàn)，我們比較了 ZNF217表達(dá)的臨床和病理學(xué)參數(shù)在任何情況下都沒(méi)有觀察到顯著相關(guān)(表8)。然而，我們確證了 ZNF217的高表達(dá)水平和更短的RFS 顯著相關(guān)(P = 0. 023，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)；表9和圖9)。在評(píng)價(jià)這個(gè)群中幾種臨床和病理學(xué)參數(shù)的預(yù)后值時(shí)，我們僅發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)狀態(tài)(> 3個(gè)浸潤(rùn)節(jié))與更短的RFS相關(guān)(P = 0.044，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表9)。使用ZNF217和節(jié)浸潤(rùn)狀態(tài)進(jìn)行RFS的Cox多變量回歸分析。令人驚訝的是，在多變量分析中只有ZNF217的預(yù)后值保持顯著(P = 0. 019 ；HR = 5. 54 ；表9)，證明 ZNF217的預(yù)后值提供的信息比淋巴結(jié)浸潤(rùn)狀態(tài)更多。由免疫組織化學(xué)檢測(cè)的乳腺癌標(biāo)志物如ER和HER2 (ERBB2)傳統(tǒng)上用于癌癥預(yù)后， 而ER-和/或HER2+的乳腺腫瘤是具有不良的預(yù)后的腫瘤。然而，只有30-40%的乳腺癌是ER-，而15-20%的乳腺癌是HER2+。因此在目前被視為“更好預(yù)后癌癥”(即具有ER+和 /或HER2-狀態(tài))的乳腺癌中急需新的預(yù)后生物標(biāo)志物。在CLB2群的ER+(n = 68)和ER+/HER2_(n = 57)亞類(lèi)中，仍然存在與RFS相關(guān)的ZNF217預(yù)后值，并且令人驚訝的是，與全部群中獲得的預(yù)后值相比得到了改進(jìn)(分別為 !^[ . ^和？二化㈨么對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表川，圖川和丨丨)。通過(guò)獨(dú)立群的回溯分析(Ma等， 2004)，我們驗(yàn)證了與全部群(P = 0.014，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表10)相比，在ER+/HER2-亞類(lèi)中的 ZNF217預(yù)后值更顯著(P = 0. 001，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表10)。在使用ER狀態(tài)、HER2狀態(tài)、SBR狀態(tài)和/或淋巴結(jié)狀態(tài)將CLB2群的113個(gè)乳腺腫瘤分級(jí)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在顯示“預(yù)后優(yōu)良”的標(biāo)志物的乳腺腫瘤亞類(lèi)，即ER+(P = 0.014)、 HER2-(P = 0. 007) ,SBR1+SBR2 (P = 0. 004)或 SBR2 亞類(lèi)(P = O-Ol)中，ZNF217 的高表達(dá)水平與更短的RFS顯著相關(guān)(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表11)。在收集自具有少量浸潤(rùn)淋巴結(jié)(< 3)的患者的腫瘤中也能觀察到接近顯著的趨勢(shì)(P = O. 052，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表11)。相反地，在顯示 “預(yù)后差”的常規(guī)標(biāo)志物，如ER-、HER2+、SBR3或淋巴結(jié)狀態(tài)(> 3)的乳腺腫瘤亞類(lèi)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ZNF217和RFS之間的顯著關(guān)聯(lián)(對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表11)。最后在組合幾種“良好預(yù)后”參數(shù)如 ER+ 和 / 或 PR+、ER+ 和 / 或 PR+ 和 SBRl+2、ER+/SBRl+2，或 ER+/HER2-/SBR1+2 的亞類(lèi)中，ZNF217的高表達(dá)水平仍然與更短的RFS顯著相關(guān)(分別為P = O. 013，P = 0. 002，P = 0.015和P = 0.031，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表11)。有趣的是，在ER+/HER2-/SBR1+2/淋巴結(jié)(彡3) 亞類(lèi)(n = 27)中幾乎達(dá)到顯著水平(P = 0. 067，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表11)。最后，僅在全部群中 ZNF217的高表達(dá)水平與OS顯著相關(guān)(P = 0. 049 ；對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表11)。有趣的是，在ER+/ HER2亞類(lèi)(n = 27)中也存在接近顯著的趨勢(shì)(P = 0. 055)(表11)。近來(lái)，已經(jīng)提出免疫組織學(xué)(ER，PR, HER2，KI67)和/或臨床(SBR)參數(shù)，將乳腺癌分為生物學(xué)上獨(dú)特而且行為方式不同的亞類(lèi)(Blows等，2010 ；Cheang等，2009 ；Hugn等， 2009 ；Millar等，2009 ；Nguyen等，2008)。不同分子亞組的預(yù)后和化學(xué)治療敏感性不同。 Luminal-樣癌癥是ER+和/或PR(黃體酮受體)-陽(yáng)性的，因此對(duì)于內(nèi)分泌治療敏感，而且即使不進(jìn)行任何治療，也可具有比HER2+和"Triple陰性亞型更有利的預(yù)后。Luminal B亞型相當(dāng)于表達(dá)HER2或具有由KI67或SBR (考慮觀察到的有絲分裂數(shù)目)給出的高增殖表型的亞型(Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Mi Ilar 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。 Luminal B乳腺癌已經(jīng)顯示比Luminal A乳腺癌更不利的長(zhǎng)期存活(Blows等，2010 ；Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。最重要的是旨在對(duì) Luminal 亞類(lèi)，特別是Luminal A亞類(lèi)再分級(jí)的標(biāo)志物。在CLB2群中，我們發(fā)現(xiàn)Luminal乳腺癌中ZNF217的高表達(dá)水平與更短的RFS顯著相關(guān)(P = 0. 013，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表12)，但是HER2+ 或Triple陰性亞型中則不是。有趣的是，在Luminal B亞類(lèi)中檢測(cè)不到ZNF217的預(yù)后值， 而在LuminalA亞類(lèi)中高ZNF217表達(dá)水平與更短的RFS相關(guān)(P = 0. 012和P = 0. 014，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，表12)?？傊@些數(shù)據(jù)證明ZNF217表達(dá)水平是乳腺癌患者中不良預(yù)后的新標(biāo)志物，特別是在具有至少一種良好預(yù)后的常規(guī)標(biāo)志物(ER+和/或PR+、HER2-、SBR1+2、淋巴結(jié)狀態(tài) (^3), Luminal Α)的乳腺腫瘤中。因此ZNF217對(duì)于目前的常規(guī)標(biāo)志物有增加的值，并允許將患有視為具有良好預(yù)后的癌癥的乳腺癌的患者再分級(jí)。因此，ZNF217狀態(tài)可以幫助臨床醫(yī)生作出治療決定。ZNF217和ER信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間存在交流(cross-talk)鑒于ER+乳腺癌中ZNF217的不良預(yù)后值起主要作用的事實(shí)，我們考察了 ZNF217和ER表達(dá)之間的關(guān)系。通過(guò)RTQ-PCR，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤樣本的兩個(gè)獨(dú)立群中ZNF217mRNA水平和ESRlmRNA水平之間顯著相關(guān)Spearman秩相關(guān)系數(shù)=+0. 47 ；P = 0. 0001 (在33個(gè)ER+和34個(gè)ER-的乳腺腫瘤群中)和Spearman秩相關(guān)系數(shù)=+0. 69 ；P = 0. 0001 (在39個(gè)ER+乳腺腫瘤群中)。之前已經(jīng)用野生型ERSl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ER-MDA-MB-231細(xì)胞系，產(chǎn)生組成型表達(dá)ERa的新細(xì)胞系(S30細(xì)胞)(Levenson等，2003)。我們通過(guò)Wfestern 印跡證明S30細(xì)胞中ER的組成型表達(dá)與對(duì)照MDA-MB-231細(xì)胞相比更高的ZNF217蛋白表達(dá)水平相關(guān)(圖12A)。相反地，在ER+MCF7乳腺癌細(xì)胞系中，所述細(xì)胞系具有高內(nèi)源水平的 ZNF217，通過(guò)siRNA策略敲除ZNF217表達(dá)與降低的ER表達(dá)相關(guān)(圖12B)。在內(nèi)分泌治療下藥物抗性和再發(fā)的發(fā)展代表ER+乳腺癌臨床治療中的真實(shí)問(wèn)題。 有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)ZNF217是僅用輔助內(nèi)分泌療法治療的下述兩個(gè)患者群中不良預(yù)后和再發(fā)的標(biāo)志物由Centre ReneHuguenin收集的群(P = 0. 039，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))，和通過(guò)回溯分析，由Ma等描述的群(P = 0. 014，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))(Ma等，2004)。通過(guò)對(duì)來(lái)自基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)的回溯統(tǒng)計(jì)分析，所述數(shù)據(jù)來(lái)自之前另一項(xiàng)對(duì)于1 個(gè)來(lái)自患者的乳腺腫瘤樣本進(jìn)行的研究，所述患者在使用他莫昔芬時(shí)發(fā)展轉(zhuǎn)移或未發(fā)展轉(zhuǎn)移(44個(gè)Met+和155個(gè)Met-) (Chanrion等，2008)，我們?cè)俅未_證了高ZNF217mRNA水平是不良預(yù)后和再發(fā)的標(biāo)志物(P = 0.01，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn))。MVLN是源自MCF7細(xì)胞的ER+、激素應(yīng)答和OH-他莫昔芬(OH-Tam)敏感的乳腺癌細(xì)胞系(Demirpence等，1993)。對(duì)MVLN使用OH-Tam六個(gè)月，允許出現(xiàn)OH-Tam抗性但是仍然依賴(lài)雌性激素的CL6. 7細(xì)胞克隆。通過(guò)可在MVLN細(xì)胞中檢測(cè)的分子的細(xì)胞抑制活性的損失和CL6. 7細(xì)胞增殖的強(qiáng)刺激發(fā)生(雌性激素-樣效應(yīng))，在用OH-Tam處理的情況下表征由CL6. 7細(xì)胞發(fā)展出的OH-Tam抗性表型((ihayad等，2010)(圖13)。在使用BrdU標(biāo)記的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，組合敲除ZNF217 (siRNA策略)和OH-Tam處理導(dǎo)致敏感MVLN細(xì)胞系中對(duì)內(nèi)分泌治療(P = 0. 001，Student檢驗(yàn))敏感性的增加和對(duì)CL6. 7細(xì)胞系中激素抗性的恢復(fù)(ΟΗ-Tam雌性激素-樣活性現(xiàn)在恢復(fù)至細(xì)胞增殖的35%抑制率，P < 10_5)(圖13)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明在ZNF217和ER表達(dá)水平之間存在交流，并且高ZNF217表達(dá)水平與對(duì)內(nèi)分泌治療的應(yīng)答降低相關(guān)。總之，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明ZNF217可代表內(nèi)分泌治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。結(jié)論
總而言之，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中證明了乳腺癌細(xì)胞中ZNF217過(guò)量表達(dá)觸發(fā)增殖性、 無(wú)貼壁依賴(lài)性生長(zhǎng)，并且與浸潤(rùn)和EMT表型相關(guān)。我們已顯示ZNF217表達(dá)代表易再發(fā)和發(fā)展轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者不良預(yù)后的新標(biāo)志物。更精確地，ZNF217表達(dá)水平是對(duì)于由目前可用的臨床標(biāo)志物/參數(shù)分類(lèi)為具有良好/更好預(yù)后的癌癥的乳腺癌(例如ER+亞類(lèi)、HER2-亞類(lèi)、Luminal亞類(lèi)(ER+和/或I3R+)、ER+/HER2-亞類(lèi)、SBRl和/或SBR2亞類(lèi)、無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)亞類(lèi)(彡3)、ER+和/或PR+和SBRl和/或SBR2亞類(lèi)、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2 亞類(lèi)、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/無(wú)/少淋巴結(jié)浸潤(rùn)(彡3)亞類(lèi)、Luminal A亞類(lèi))的有力的不良預(yù)后標(biāo)志物。因此單獨(dú)或與其它預(yù)后標(biāo)志物一起評(píng)價(jià)ZNF217表達(dá)水平可允許將這些分類(lèi)為具有良好/更好預(yù)后的癌癥再分級(jí)為兩個(gè)亞類(lèi)“良好預(yù)后”乳腺癌(低ZNF217 表達(dá)水平)或“預(yù)后差”乳腺癌(高ZNF217表達(dá)水平)，從而幫助臨床醫(yī)生作治療決定。在 Luminal乳腺癌中ZNF217的預(yù)后值可以(至少部分)由ZNF217和ER之間存在的交流解釋。此外，因?yàn)槿フ{(diào)節(jié)的ZNF217表達(dá)水平與對(duì)內(nèi)分泌治療(在3個(gè)群中發(fā)現(xiàn))或?qū)?nèi)分泌 /化學(xué)治療(在2個(gè)群中發(fā)現(xiàn))的應(yīng)答降低相關(guān)，所以ZNF217也可以代表抗癌治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物，并且特別是內(nèi)分泌治療的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。表權(quán)利要求
1.用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟a)對(duì)先前取自所述患者的樣本測(cè)試至少一種乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物，并評(píng)價(jià)所述樣本中 ZNF217基因的表達(dá)水平；b)如果樣本顯示至少一種預(yù)后標(biāo)志物，則將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后，如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則重新將乳腺癌分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的所述預(yù)后標(biāo)志物通過(guò)組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)、免疫組織化學(xué)分級(jí)系統(tǒng)和/或ERBB2擴(kuò)增的檢測(cè)而確定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標(biāo)志物選自下組ER+、PR+、HER2-、低增殖指數(shù)、無(wú)/少淋巴結(jié)侵入(^ 3) λ Luminal 禾口 Luminal A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的至少一種預(yù)后標(biāo)志物可以將乳腺癌的亞型分類(lèi)為下述亞型ER+和 / 或 ra+、HER2-、ER+/HER2-、SBRl 和 / 或 SBR2、無(wú) / 少淋巴結(jié)侵入(彡 3)、ER+ 和 / 或 PR+/ SBRl 和 / 或 SBR2、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2、ER+/HER2_/SBR1 和 / 或 SBR2、無(wú) / 少淋巴結(jié)侵入(<3)、Luminal A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥重新分類(lèi)為易復(fù)發(fā)和/或易發(fā)展浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移表型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥重新分類(lèi)為對(duì)于無(wú)再發(fā)存活具有不良的預(yù)后。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥重新分類(lèi)為對(duì)于總存活具有不良的預(yù)后。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥重新分類(lèi)為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將癌癥重新分類(lèi)為在化學(xué)治療和/或在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。
10.用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包含下述步驟a)對(duì)于至少一種乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物，測(cè)試先前取自所述患者的樣本，b)如果樣本顯示至少一種將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的標(biāo)志物，則評(píng)價(jià)ZNF217 基因的表達(dá)水平，c)如果所述樣本中ZNF217基因過(guò)量表達(dá)，則將乳腺癌分類(lèi)為具有不良的預(yù)后。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的所述預(yù)后標(biāo)志物通過(guò)組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)、免疫組織化學(xué)分級(jí)系統(tǒng)和/或ERBB2 擴(kuò)增的檢測(cè)而確定。
12.根據(jù)權(quán)利要求10-11中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標(biāo)志物選自下組ER+、PR+、HER2-、低增殖指數(shù)、無(wú)/少淋巴結(jié)侵入(<3)、Luminal 和 Luminal A。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類(lèi)為具有有利的預(yù)后的至少一種預(yù)后標(biāo)志物可以將乳腺癌的亞型分類(lèi)為下述亞型 ER+ 和 / 或 PR+、HER2-、ER+/HER2-、SBRl 和 / 或 SBR2、無(wú) / 少淋巴結(jié)侵入(<= 3)、ER+ 和 / 或 PR+/SBR1 和 / 或 SBR2、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2/ 無(wú) /少淋巴結(jié)侵入(<=3)、Luminal A。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將ZNF217 基因的表達(dá)水平與對(duì)照樣本相比較。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中對(duì)照樣本是取自患有乳腺癌的患者的樣本中ZNF217表達(dá)的中值水平。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中所述樣本是乳腺腫瘤樣本。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，所述方法包括通過(guò)定量ZNF217基因的mRNA 而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，所述方法包括通過(guò)定量由ZNF217基因編碼的多肽而測(cè)量樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定癌癥預(yù)后的方法。方法包括確定癌細(xì)胞樣本或腫瘤樣本中ZNF217基因的表達(dá)水平，其中ZNF217的過(guò)量表達(dá)與癌癥轉(zhuǎn)移的幾率和癌癥再發(fā)/復(fù)發(fā)的幾率相關(guān)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102575291SQ201080041659
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者J·文德雷爾, P·科恩, P·魯 申請(qǐng)人:克勞德伯納德里昂第一大學(xué), 利昂貝拉爾中心