專利名稱：：用二價鹽和磷酸鹽進行絮凝的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及簡單和非常有效的用于從發(fā)酵液絮凝細菌細胞，產(chǎn)生目標蛋白的方法。
背景技術：
：當需要具有非常高純度的蛋白時，例如當?shù)鞍状糜谒幬镱I域時，需要非常有效的絮凝過程。許多已知的絮凝劑是無法使用的，因為它們可能在最終醫(yī)藥產(chǎn)品中成為雜質。因此，本發(fā)明的目的是對上述問題提供簡單而有效的解決方案。
發(fā)明內容發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以以非常有效的方式從發(fā)酵液絮凝細菌細胞，產(chǎn)生目標蛋白，即，使用二價鹽和磷酸鹽的組合，因此我們要求保護一種從發(fā)酵液絮凝細菌細胞，產(chǎn)生目標蛋白的方法，包括a)用水將發(fā)酵液稀釋至1000%(w/w)；b)添加二價鹽至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；c)調整磷酸根濃度至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；d)調整發(fā)酵液的pH至范圍為6.1-10.5的pH；和e)去除細菌細胞，由此獲得具有少于100NTU的濁度的蛋白溶液。具體實施例方式本發(fā)明涉及簡單的和非常有效的從發(fā)酵液絮凝細菌細胞，產(chǎn)生目標蛋白的方法，包括添加二價鹽和磷酸鹽，在此之后去除細菌細胞并獲得具有非常低濁度的蛋白溶液。細菌細胞細菌細胞可為芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞，例如，選自下組的芽孢桿菌屬細胞嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)>短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenuformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)禾口蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；優(yōu)選為遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞；特別是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個實施方案中，所述細菌細胞可為大腸桿菌(E.coli)細胞，或假單胞菌屬菌種O^seudomonassp.)細胞，或鏈霉菌屬菌種(Sti^ptomycessp.)細胞，特別是鼠灰鏈(Streptomycesmurinus)^[fMMM^^M^MUM(Streptomycesacidiscabies)M胞。目標蛋白根據(jù)本發(fā)明，所述目標蛋白可為肽或多肽。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的肽含有5至100個氨基酸；優(yōu)選10至80個氨基酸；更優(yōu)選15至60個氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的待回收的肽為甜味蛋白(brazzein)。優(yōu)選的多肽可為任何可由細菌細胞產(chǎn)生的蛋白。所述蛋白可為胰島素、thaxomin、白蛋白或酶。在一個優(yōu)選實施方案中，目標蛋白是待用于藥物的酶。在一個優(yōu)選實施方案中，將所述方法施用于水解酶(根據(jù)EnzymeNomenclature；RecommendaionsoftheNomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistry為類型EC3)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，選自下組的酶是優(yōu)選的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、和纖維素酶蛋白酶合適的蛋白酶包括那些動物、植物(vegetable)或微生物起源。優(yōu)選微生物起源的。包括經(jīng)化學修飾或蛋白工程的突變體。所述蛋白酶可為絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選為堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)，特別是那些來源于芽孢桿菌屬的，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于TO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于W089/06270和WO94/25583的鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。其他合適的蛋白酶為可用于胰酶替代的描述于例如WO2005/11M55中的擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)蛋白酶。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的蛋白酶包括Alcalase、Savinase,Primase,Duralase、Esperase禾口Kannase(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、ProperaseT\Purafect,Purafect0xP、FN2TM和FN3(GenencorInternationalInc.)MM:合適的脂肪酶包括那些細菌或真菌來源的。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。有用的脂肪酶的實例包括假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和WO96/27002)、或威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)的脂肪酶。其他有用的脂肪酶可為芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993)，BiochemicaetBiophysicaActa，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)的脂肪酶。其他合適的脂肪酶為可用于胰酶替代的描述于例如WO2006/136159中的脂肪酶。淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括那些細菌或真菌來源的。包括化學修飾的或蛋白質工程的突變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如獲得自地衣芽孢桿菌特殊菌株，其更加詳細地描述于GB1，296,839。其他合適的淀粉酶為可用于胰酶替代的描述于例如WO2006/136161中的淀粉酶。商業(yè)上可獲得的淀粉酶為Duramyl、TermamylSC、TermamylUltra、Stainzyme,Natalase和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(來自GenencorInternationalInc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括那些細菌或真菌來源的。包括化學修飾的和蛋白質工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium)、梭孢殼屬(Thielavia)、或枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶。目標蛋白亦可為葡萄糖異構酶如Sweetzyme(NovozymesA/S)。發(fā)酵液本發(fā)明可用于任何工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵，例如，用于任何具有至少50升，優(yōu)選至少500升，更優(yōu)選至少5000升，甚至更優(yōu)選至少50000升發(fā)酵介質的發(fā)酵。產(chǎn)生目標蛋白的細菌細胞可通過本領域任何已知方法來發(fā)酵。所述發(fā)酵介質可為如描述于例如WO98/37179的基本培養(yǎng)基，或所述發(fā)酵介質可為包含復合氮源和碳源的復合培養(yǎng)基，其中所述復合氮源可如描述于W02004/003216為部分水解的。發(fā)酵可作為分批、重復分批、批次補料、重復批次補料或連續(xù)發(fā)酵過程進行。在批次補料過程中，完全不將或僅部分將包含一種或多種結構和/或催化元件的化合物在發(fā)酵起始前添加至介質，并分別將全部或剩余部分的所述包含一種或多種結構和/或催化元件的化合物在發(fā)酵過程中給料。選用于給料的化合物可一同或分別給料于發(fā)酵過程。在重復批次補料或連續(xù)發(fā)酵過程中，在發(fā)酵中加合地將完整的起始介質給料。起始介質可與結構元件給料一同給料或分別給料。在重復批次補料過程中，以規(guī)則的時間間隔去除部分包含生物質的發(fā)酵液，而在連續(xù)過程中，部分發(fā)酵液的去除連續(xù)進行。由此用對應于移除的發(fā)酵液的量的一部分新鮮介質來補充至發(fā)酵過程。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選來自批次補料發(fā)酵過程的發(fā)酵液。MM本發(fā)明的方法可適用于未經(jīng)處理的發(fā)酵液或首先經(jīng)歷，但不限于例如pH調整和/或溫度調整的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵液可用水稀釋至1000%(w/w)；優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋10-1000%(w/w)；更優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋100-900%(w/w)；更優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋200-800%(w/w)；更優(yōu)選所述發(fā)酵液可用水稀釋200-800%(w/w)；且特別是所述發(fā)酵液可用水稀釋300-700%(w/w)0根據(jù)本發(fā)明，用水稀釋意味著所述稀釋介質可為水，或可為來自目標蛋白生產(chǎn)的超濾滲透物，或可為來自目標蛋白生產(chǎn)的再循環(huán)水，或可為來自加熱器的冷凝物，或可為任何上述提及的組合，例如，水和超濾滲透物的混合物。然后將二價鹽，特別是鈣鹽和/或鎂鹽，例如氯化鈣或氯化鎂，添加至發(fā)酵液。一個優(yōu)選實施方案是鈣鹽，特別是氯化鈣。所述二價鹽應添加至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升；優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-100毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為20-90毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為30-80毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為40-70毫摩爾每升；特別是至其在發(fā)酵液中的濃度為50-70毫摩爾每升。二價鹽的給藥通常是連線(in-line)或在混合罐中，或通過本領域中任何其他已知方法進行的。然后可將發(fā)酵液中的磷酸根濃度調整至其濃度為高于10毫摩爾每升；優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-50毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-40毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-30毫摩爾每升；更優(yōu)選至其在發(fā)酵液中的濃度為10-20毫摩爾每升。磷酸根濃度通常是通過添加磷酸鹽如NaH2P04、Na2HP04或H3P04來調整的。磷酸鹽的給藥通常是連線或在混合罐中，或通過本領域中任何其他已知方法進行的。鈣和磷酸根的添加導致pH減少，通常至低于pH6.0的pH。通過將pH移至高于PH6，磷酸根和鈣沉淀為具有低溶解度的固體形式。令人驚訝的是，該沉淀非常有效地挾帶(entrap)細菌細胞。因此，在添加了鈣和磷酸根之后，即將發(fā)酵液的PH調整至高于6.0的pH，特別是至6.1至10.5的pH；優(yōu)選至6.2至10.5的pH；更優(yōu)選至6.3至10.5的pH；更優(yōu)選至6.4至10.5的pH；更優(yōu)選至6.5至10.5的pH；特別是至7.0至10.0的pH，特別是至8.0至9.0的pH。pH調整可通常通過任何本領域已知的堿例如NaOH或KOH進行。然后通過本領域已知方法如，但不限于過濾例如鼓式過濾(drumfiltration)、膜過濾、板框壓濾機終端過濾(flter-pressdeadendfiltration)、錯流過濾或離心來去除絮凝的細菌細胞。在去除細菌細胞之后，獲得了具有低于100NTU(=比濁法濁度單位)的蛋白溶液；特別是具有低于90的濁度的蛋白溶液；更優(yōu)選具有低于80的濁度的蛋白溶液；更優(yōu)選具有低于70的濁度的蛋白溶液；更優(yōu)選具有低于60的濁度的蛋白溶液；特別是具有5-50范圍的濁度的蛋白溶液。濁度是如本領域中已知并根據(jù)專利US4，198，161測量的，例如，通過來自HachLange的Hach2100P便攜式濁度計。后續(xù)的下游操作然后可以通過本領域已知方法進一步處理所得的蛋白溶液。例如，可通過常規(guī)方法，包括但不限于進一步過濾如超濾和滲濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)，沉淀或結晶，來回收蛋白。然后可將分離的蛋白進一步通過多種本領域已知方法包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排阻)，電泳方法(例如制備性等電聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)或提取來進行純化和/或修飾。本發(fā)明進一步由下述實施例來說明，其不意欲以任何方式限制要求保護的本發(fā)明的范圍。實施例1僅用鈣絮凝(地衣芽孢桿菌/淀粉酶)該實驗的目的是為了說明聚沉(coagulation)的全部作用無法通過僅添加鈣獲得(磷酸根是必需的)。來源芽孢桿菌細胞為含有嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(W02006/136161中所述的SEQIDNO1)的地衣芽孢桿菌細胞。發(fā)酵我們使用1500升的規(guī)模；使用含有蛋白源的鹽培養(yǎng)基，采用無機氮作為主要氮源和葡萄糖給藥作為碳源。因為來自發(fā)酵的剩余磷酸根濃度，磷酸根濃度并非零，而是為2.8mM(參見下表1)。鈣以CaC12(36%)添加。鈣濃度在0至69.5mM之間變化。發(fā)酵液的pH(在調整之前)為6.7。在添加了鈣和磷酸根之后，通過使用NaOH將pH調整至7.0。將絮凝溶液以3500rpm(=2493g)離心5分鐘。表1實驗條件"#1Γ^Ι稀釋(自來水)600%添加的Ρ04濃度O^M總Ρ04濃度2.8mM添加的Ca濃度WWPH調整設定點pH7.0表2:結果添加的C(Ca)淤漁濁度mM%w/wNTU0.03.6%100023.25.8%100046.39.2%63169.59.5%360用于稀釋的自來水含有2_3mM數(shù)量級的Ca。這未反映在實驗數(shù)據(jù)中。濁度讀數(shù)的最大值是1000NTU。因此，當列出濁度為1000NTU時，這實質上意味著>1000NTU。實驗1闡明了不添加磷酸根無法獲得低濁度(<100)的酶溶液。7實施例2■■舞酬隨疑(MHffi滅/浦IS)該實驗的目的是為了衡量獲得合適聚沉作用所需的磷酸根添加水平。因為磷酸根的添加降低PH，起始pH會取決于添加的磷酸根的量而變化。為了確證改善的聚沉并非僅為該差異的作用，準備了兩個系列的樣品一個為“如原樣(as-is)”，而另一個中在添加鈣和磷酸根之后pH調整至5.0。然后將兩個系列均調整至本實驗的PH設定點(10.0)。來源芽孢桿菌細胞為含有嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(W02006/136161中所述的SEQIDNO1)的地衣芽孢桿菌細胞。發(fā)酵發(fā)酵和絮凝如實施例1中所述用下述特定條件來進行表3:實驗條件權利要求1.一種從發(fā)酵液絮凝細菌細胞，產(chǎn)生目標蛋白的方法，包括a)用水將發(fā)酵液稀釋至1000%(w/w)；b)添加二價鹽至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；c)調整磷酸根濃度至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；d)調整稀釋的發(fā)酵液的pH至范圍為6.1-10.5內的pH；并e)去除細菌細胞，由此獲得具有少于100NTU的濁度的蛋白溶液。2.權利要求1的方法，其中所述細菌細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞。3.權利要求2的方法，其中所述芽孢桿菌屬細胞是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)細胞。4.權利要求1的方法，其中所述細菌細胞是大腸桿菌(E.coli)細胞。5.權利要求1的方法，其中所述目標蛋白是酶。6.權利要求5的方法，其中所述酶選自下組蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶。7.權利要求1的方法，其中所述二價鹽是鈣鹽。8.權利要求1的方法，其中所述二價鹽濃度在10-100毫摩爾每升的范圍。9.權利要求1的方法，其中所述磷酸根從NaH2P04、Na2HP04或H3P04獲得。10.權利要求1的方法，其中所述磷酸根濃度是10-50毫摩爾每升的范圍。11.權利要求1的方法，其中所述細菌細胞是通過過濾或離心去除的。12.權利要求1的方法，其中所述目標蛋白為醫(yī)藥產(chǎn)品。13.權利要求1的方法，其中將pH調整至6.5-10.5范圍內的pH。全文摘要一種從發(fā)酵液絮凝細菌細胞，產(chǎn)生目標蛋白的方法，包括a)用水將發(fā)酵液稀釋至1000％(w/w)；b)添加二價鹽至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；c)調整磷酸根濃度至其在發(fā)酵液中的濃度為高于10毫摩爾每升稀釋的發(fā)酵液；d)調整稀釋的發(fā)酵液的pH至范圍為6.1-10.5內的pH；和e)去除細菌細胞，由此獲得具有少于100NTU的濁度的蛋白溶液。文檔編號C12N1/02GK102471755SQ201080030690公開日2012年5月23日申請日期2010年6月30日優(yōu)先權日2009年7月9日發(fā)明者J.R.佩德森,P.F.平德申請人:諾維信公司