專利名稱：用于分離生物或化學(xué)靶標(biāo)的裝置和方法
用于分離生物或化學(xué)靶標(biāo)的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在取得液體樣品的基礎(chǔ)上對生物或化學(xué)靶標(biāo)進行檢測的領(lǐng)域。
更特別地，本發(fā)明的一個目的是滿足這樣的需要，即收集和/或濃縮生物或化學(xué)靶標(biāo)，從而將其用于檢測樣品(例如河水、家用和飲用水供應(yīng)網(wǎng)中冷卻塔中的流體等)中不期望成分(如病原性微生物或化學(xué)污染物)的情形中。生物或化學(xué)靶標(biāo)在樣品中可以以很少的量存在，因而僅在取得大體積(大于50ml)時才可以進行檢測。
術(shù)語“生物或化學(xué)靶標(biāo)”旨在表示微生物，即包膜或無包膜病毒、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性營養(yǎng)體細(xì)菌(vegetative bacteria)、芽孢形式的細(xì)菌、原生動物、微觀真菌和酵母、微觀浮游生物、花粉、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞；其還旨在表示化學(xué)分子(肥料、藥物、污染物化學(xué)分子如化學(xué)工業(yè)的副產(chǎn)物、植物檢疫產(chǎn)物等)或生物分子(抗原、蛋白質(zhì)、激素或內(nèi)分泌系統(tǒng)干擾化合物等)。
使用功能化磁珠(即在其表面具有能與期望靶標(biāo)結(jié)合之分子的磁珠)作為分離和 /或檢測生物或化學(xué)靶標(biāo)的捕獲系統(tǒng)是已知技術(shù)，并且已經(jīng)描述了用磁珠捕獲靶標(biāo)的多種方法；的確，使用功能化磁珠的優(yōu)勢是它們有大的捕獲表面積，以及它們可以用磁體容易地回收并且任選地在洗脫所捕獲靶標(biāo)后重新使用。
特別地，專利申請US 2003/015028描述了一種特異性不很高的微生物捕獲方法， 其使用連接有所述微生物的營養(yǎng)物(尤其是碳水化合物)的固體支持物；該固體支持物優(yōu)選為磁珠。該方法作用的發(fā)揮在于選擇用于捕獲微生物的營養(yǎng)物。
專利申請US 2006/0141450描述了捕獲存在于生理來源樣品中的細(xì)胞、細(xì)胞器或病毒的方法，其利用了磁珠的特異性不很高的順磁吸附特性。
上述方法旨在處理體積約Iml的樣品；它們不適于處理體積大于50ml的樣品。
國際申請WO 2008/1315M描述了適于用食物樣品檢測病原微生物的裝置；該裝置包含500ml的Erlenmeyer燒瓶，其放置在配置了磁場的攪拌支持物上。該裝置的使用提供了在適于目的微生物生長的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)樣品的起始步驟；然后，通過磁顆粒捕獲這些微生物，所述磁顆粒上具有與目的微生物結(jié)合的移植抗體。這種非常特異的檢測微生物的方法通過培養(yǎng)步驟解決了樣品中生物靶標(biāo)量少的問題，使得可以擴增目的微生物從而便于其檢測。盡管可適于處理體積為幾十毫升的樣品，但由于產(chǎn)生了如何使磁珠在樣品中分散良好的問題，其應(yīng)用仍在樣品體積方面受限制；最后，這樣的裝置難以自動化；它不允許依次處理幾個樣品。
專利申請US 2005/0013741中描述的用于攪拌和分離磁珠的裝置有相同的局限； 該裝置在包含磁珠的容器兩側(cè)放置的兩個永磁體；這些磁體可以垂直移動；根據(jù)對其進行的移動，它們可以攪拌珠以放置它們或?qū)⑺鼈儽３衷趹乙褐?，或者重新聚集它們以將它們從樣品中分離。該裝置用于最大體積為幾十毫升的容器。在處理大體積時遇到的問題是難以獲得磁珠的良好分散，并且之后難以將它們回收。
最后，Matrix Microscience的Pathatrix裝置通過在管狀線路的環(huán)路中循環(huán)樣品來提供250ml樣品中靶標(biāo)(如病原微生物)的捕獲，其中功能化磁捕獲珠固定在平磁體上。由于珠被固定，該裝置產(chǎn)生低捕獲得率，這尤其使得無法檢測以低濃度存在的靶標(biāo)。
因此，由上述可見現(xiàn)有技術(shù)中沒有裝置允許這樣的靈敏檢測，即通過自動化處理在大體積液體樣品中檢測少量存在的靶標(biāo)。
本發(fā)明的主題涉及用于處理體積V大于或等于IOml (優(yōu)選大于或等于50ml，更優(yōu)選大于或等于500ml)的液體樣品的自動化裝置，所述自動化裝置包含其中放置功能化磁珠的體積ν為10 μ 1至5ml的反應(yīng)室，允許捕獲生物或化學(xué)靶標(biāo)的所述珠的量使珠的捕獲表面積與反應(yīng)室體積的比值為0. 2至200m2/l，優(yōu)選0. 2至20m2/l，甚至更優(yōu)選0. 2至IOm2/ 1，所述反應(yīng)室配備有
-使所述珠能均勻分散的非侵入式攪拌系統(tǒng)；
-可以被啟動(打開位置)或關(guān)閉(關(guān)閉位置)的磁場；
-用于填入和排出反應(yīng)室內(nèi)含物的部分或全部的流體移動系統(tǒng)。


圖1是本發(fā)明裝置的示意圖，該裝置包含其中放置功能化磁珠O)的反應(yīng)室(1)、 攪拌系統(tǒng)如超聲浴(3)、可被啟動(打開位置)或關(guān)閉(關(guān)閉位置)的磁場(4)和用于填入 (51)和排出(52)部分或全部反應(yīng)室內(nèi)含物的流體移動系統(tǒng)(5)。
反應(yīng)室的體積優(yōu)選為50至500 μ 1。甚至更優(yōu)選100 μ 1。
反應(yīng)室可以是容器形式或者為管狀系統(tǒng)如毛細(xì)管。
優(yōu)選地，反應(yīng)室包被有疏水表面以防止捕獲珠粘附至其內(nèi)壁；該疏水表面選自 Teflon, ETFE (乙烯三氟乙烯)、PFA(全氟代烷氧基共聚物樹脂)和PTFE (聚四氟乙烯)。
術(shù)語“液體樣品”旨在表示從工業(yè)水(例如源自冷卻回路)、環(huán)境水(水路等)或者從供人或動物攝入的飲用水中取得的樣本，并且延伸至其中在溶液或懸液中有待檢測的生物或化學(xué)靶標(biāo)的任何樣品。該樣品本身可以獲得自樣本或能包含目的生物或化學(xué)靶標(biāo)的其他樣品(如食物產(chǎn)品、體液、空氣樣本)，它們根據(jù)可被本領(lǐng)域技術(shù)人員適用的任何方法通過物理和/或化學(xué)和/或生物方法獲得。
本發(fā)明裝置具有對極低濃度靶標(biāo)的捕獲能力，因此它尤其適于處理可僅包含極少量生物或化學(xué)靶標(biāo)的液體樣品；特別地，對于生物靶標(biāo)，本發(fā)明裝置因此能檢測以小于或等于100單位/升樣品的量(優(yōu)選小于或等于10單位/升樣品的量，更優(yōu)選等于1單位/升樣品的量)存在的生物靶標(biāo)。
為了避免任何外源污染，優(yōu)選在極清潔條件下用無菌儀器取得或制備液體樣品。
在分析空氣中微生物質(zhì)量的情況下，液體樣品可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù) (Stachowiak JC 等，Anal. Chem. 2007 ;79 (15) :5763-70)制備。
理論上對所述液體樣品的最大體積沒有限制；在實際應(yīng)用中其通常不超過101。
用于填入和排出部分或全部反應(yīng)室內(nèi)含物的流體移動系統(tǒng)使得可以將液體樣品級分填入反應(yīng)室以捕獲生物或化學(xué)靶標(biāo)，然后在捕獲步驟后排出該液體樣品的級分。該系統(tǒng)還使得可以在開始時填入功能化磁珠并且在液體樣品處理結(jié)束時排出它們。
具體而言，該流體移動系統(tǒng)優(yōu)選由壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Fluigent)或泵(53)(如活塞泵、膜式泵或蠕動泵)組成。
使珠均勻分散的攪拌系統(tǒng)是非侵入式的，即它不需要將攪拌配件引入反應(yīng)室，從而避免污染液體樣品的危險。
攪拌功能性磁珠的系統(tǒng)可以采用移動磁場的方式，它通過一個或更多個旋轉(zhuǎn)磁體實現(xiàn)；通過流體移動系統(tǒng)使反應(yīng)室內(nèi)含物來回移動以使珠運動；或者通過超聲攪拌。
攪拌系統(tǒng)優(yōu)選為超聲攪拌(其彈性波頻率為15kHz至幾百MHz)，它通過在超聲浴中以水傳遞超聲來實現(xiàn)，或直接通過超聲換能器(Borttwick等^)0 Journal of microbiological methods 60,207-216 ；Belgrader 等(1999)Analytical chemistry 71(19),4232-4236)實現(xiàn)。
超聲浴的功率為5至100W/1 (優(yōu)選40W/1)，有效功率為50至400W?？捎糜诒景l(fā)明裝置的超聲浴是Fisher Scientific公司的S-Iine超聲清洗器。
本發(fā)明裝置可任選地包含超聲攪拌系統(tǒng)和其他用于攪拌功能化磁珠的非侵入式系統(tǒng)。
磁場由永磁體或電磁體產(chǎn)生。
作為非限制性實例，可以使用大小為IXwXd = 20X13X10mm并且規(guī)格為釹-鐵-硼(NdFeB)磁化級別N38并且具有鎳/銅/鎳涂層的磁體。
電磁體的規(guī)格為例如以下電磁輸出12Vcc IOff和行程1. 8mm。
當(dāng)使用永磁體時，它必須能被置于靠近反應(yīng)室(以吸引功能化磁珠(打開位置)) 和與反應(yīng)室保持足夠的距離(以不對珠產(chǎn)生任何吸引力(關(guān)閉位置))的兩個位置；這兩個位置之間的傳送可以通過移動永磁體的多種方式實現(xiàn)。
當(dāng)使用電磁體時，其被置于貼靠或靠近反應(yīng)室的位置，并且它處于運行(開)模式以吸引功能化磁珠，或者關(guān)閉(關(guān))，則其不再對功能化磁珠產(chǎn)生任何吸引力。
可通過在反應(yīng)室中添加美國專利6 159 378中所述的泡沫金屬(優(yōu)選鎳泡沫金屬)來增強磁體或電磁體對功能化磁珠的磁吸引效力。
磁珠通常是直徑為1納米至幾微米的微球；優(yōu)選地，用于本發(fā)明裝置的功能化磁珠的直徑為0. 5至10 μ m，更優(yōu)選直徑為1 μ m。注意選擇大小大于或等于生物或化學(xué)靶標(biāo)大小的珠。
珠的磁性使得可以用磁體在容器中控制它們。不存在外界磁場時珠不具有磁特性，從而避免聚集體的形成并允許對其再利用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類型的磁珠均可用于本發(fā)明的裝置中；對此，可提及 Dynal或Chemicell公司銷售的功能化磁珠。
還可提及美國專利4 628 037中所述的用于捕獲生物靶標(biāo)的功能化磁珠。
磁珠是功能化的，即它們的外表面包被有分子，所述分子具有與一種或多種生物或化學(xué)靶標(biāo)或多或少特異地結(jié)合的特性；這些分子被稱為捕獲材料。包被有捕獲材料的珠的表面積構(gòu)成捕獲表面積。優(yōu)選地，該捕獲表面積為1\10-3至10\10_2!112。
捕獲材料和靶標(biāo)之間的多種類型的鍵可包括
-靜電相互作用根據(jù)其表面所帶電荷來捕獲靶標(biāo)。捕獲表面包含作用力或大或小的陰離子交換或陽離子交換末端基團。它們可以是羧基、砜、磷酸類、二乙基氨基-乙基 (diethylaminoethyl, DEAE)、聚賴氨酸、聚乙亞胺(PEI)，更一般地為帶電聚合物(D印onte 等· Anal. Bioanal. Chem. 2004 ；379 :419-426)；
-疏水相互作用根據(jù)表面疏水性差異捕獲靶標(biāo)。例如含水基質(zhì)中的靶標(biāo)(如蛋白質(zhì)、肽或核酸)的疏水區(qū)優(yōu)先與疏水捕獲材料(如包含1個(甲基)至18個(十八烷基) 碳原子的烴基鏈)結(jié)合；
-共價鍵移植到珠上的功能化末端基團使得可以共價鍵合靶標(biāo)配體，它們特別是胺基、羥基、巰基、聚戊二醛基團等；
-親合鍵珠包被有允許高特異性和選擇性鍵合的配體，例如抗原和抗體之間的相互作用、兩個核苷酸片段之間的雜交、生物素和鏈親和素之間的作用等(Ergin 等.Microbial Cell Factories 2007 ；6 18 ；Steingroewer 等，J. Magnetism Magnet. Material 2007 ;311 :295-299 ;Aim 等，J. of Virology 200579(1) :622-625)。
根據(jù)目的生物或化學(xué)靶標(biāo)選擇捕獲材料。
根據(jù)本發(fā)明裝置的一種變化形式，用允許捕獲兩種或更多種靶標(biāo)的兩種或更多種不同捕獲材料對磁珠進行功能化。使用包被有幾種不同捕獲材料的磁珠，或者使用幾種類型的磁珠，每種類型的磁珠包被有不同的捕獲材料。
填入反應(yīng)室的功能化磁珠的量使捕獲表面與樣品體積的比例為0.2至200m2/l，優(yōu)選0. 2至20m2/l，更優(yōu)選0. 5至10m2/l，最優(yōu)選1至5m2/l，例如2. 8m2/l。
例如，在珠直徑為1 μ m并用PEI (Chemicell)功能化的情況下，可以使用的珠的數(shù)量為 9 X IO8 至 9 X IO9，代表 2. 83 X l(T3m2 至 2. 83 X l(T2m2 的捕獲表面。
本發(fā)明裝置的優(yōu)勢是允許處理大體積(大于或等于10ml，優(yōu)選大于或等于50ml， 更優(yōu)選大于或等于500ml)的液體樣品而同時保持小體積的反應(yīng)室(最大幾毫米)，從而使得可以保留在小體積中捕獲生物或化學(xué)靶標(biāo)的優(yōu)勢，即
-由于體積小而占用較小空間并且裝置成本低；
-更容易并更快地回收磁珠；
-更便于分散和混合磁珠；
-減少所需試劑的體積和用于在捕獲后處理磁珠的時間；
-提高靶標(biāo)檢測敏感性；
-所捕獲靶標(biāo)的濃度高。
該裝置的優(yōu)勢還在于其提供捕獲表面與反應(yīng)室體積的良好比例以及根據(jù)目的生物或化學(xué)靶標(biāo)選擇的多種捕獲材料；最后，可以回收并再利用功能化磁珠。
本發(fā)明裝置對大體積液體樣品的自動化處理替代了處理該類樣品的常用技術(shù)，如過濾或超濾。
因此該裝置使得可以取得可包含生物或化學(xué)靶標(biāo)的樣品級分、捕獲所述靶標(biāo)并濃縮，從而處理它們以確認(rèn)或甚至定量它們的存在。
在這樣自動化情況下，該裝置可放置在取樣位置以取得定期樣品并進行定期分析。
本發(fā)明裝置可補充有液體樣品收集系統(tǒng)，其由取得樣品的流體系統(tǒng)(61)(如泵) 和用于反應(yīng)室上游樣品的儲存容器(62)組成(圖2)。液體樣品收集系統(tǒng)與流體移動系統(tǒng)直接連接或經(jīng)一個或更多個中間容器連接，使液體樣品級分可填入反應(yīng)室(51)。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明裝置捕獲體積V大于或等于IOml (優(yōu)選大于或等于 50ml，更優(yōu)選大于或等于500ml)的樣品中可存在的生物或化學(xué)靶標(biāo)的方法，其包括以下步驟
a)取得所述液體樣品的體積為ν的級分；
b)在磁場被關(guān)閉的情況下，將所述級分與所述裝置反應(yīng)室中的功能化磁珠相接觸；
c)通過非侵入式攪拌系統(tǒng)均勻分散珠至少5秒，優(yōu)選15秒至10分鐘，更優(yōu)選約 30秒；
d)通過開啟磁場對珠進行捕獲；
e)排出所述級分；
f)重復(fù)步驟a)至e) η次，使η為1至V/v，優(yōu)選η = V/v。
本發(fā)明方法的自動化由合適的計算機系統(tǒng)編程并控制。
功能化磁珠上捕獲的生物或化學(xué)靶標(biāo)的處理可以在本發(fā)明裝置的反應(yīng)室中進行， 或者在與流體移動系統(tǒng)連接的容器中進行以允許排出反應(yīng)室(5 的內(nèi)含物。
在生物靶標(biāo)的情況下，該處理由以下組成
-通過本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述靶標(biāo)的洗脫緩沖液來洗脫生物靶標(biāo)，然后
-對這樣洗脫的靶標(biāo)進行生物或生物化學(xué)分析。
生物或生物化學(xué)分析可以例如，包括當(dāng)洗脫的生物靶標(biāo)為微生物時在選擇培養(yǎng)基中對它們進行培養(yǎng)和表征；或者用生物靶標(biāo)的抗體進行檢測等。
根據(jù)一個優(yōu)選的變化形式，裂解所洗脫的生物靶標(biāo)以釋放它們的核酸。裂解方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的；其可以是使用包含去污劑(如十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰(LiDS)或十二烷基肌氨酸)或離液劑(如鹽酸胍(GHCl)、硫氰胍(GTC)、碘化鈉 (NaI)、高氯酸鹽等)的裂解緩沖液進行的化學(xué)裂解，使用蛋白酶K或溶菌酶等進行的酶裂解，或機械裂解(如通過將珠和超聲的作用聯(lián)合或通過熱梯度)。然后分析獲得的核酸，例如通過PCR或雜交。
根據(jù)該變化形式，還可使用包含采用核酸捕獲材料之功能化磁珠的本發(fā)明裝置進行所得核酸的第二步純化和濃縮。
在化學(xué)靶標(biāo)的情況下，處理由以下組成
-使用本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述靶標(biāo)的洗脫緩沖液來洗脫化學(xué)靶標(biāo)，然后
-用常規(guī)化學(xué)技術(shù)(如核磁共振、層析、UV或頂光譜術(shù)、電化學(xué)分析等)分析所回收靶標(biāo)。
當(dāng)靶標(biāo)具有生物化學(xué)性質(zhì)時，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的根據(jù)生物化學(xué)靶標(biāo)所選擇的技術(shù)進行檢測，例如將靶標(biāo)與放射性或熒光標(biāo)記的抗原偶聯(lián)等。
因此，本發(fā)明還涉及檢測生物或化學(xué)靶標(biāo)的方法，其包括以上捕獲方法的步驟a) 至f)，其特征在于還包括以下步驟g)洗脫所述靶標(biāo)；和h)檢測在步驟g)中洗脫的所述靶標(biāo)。
當(dāng)本發(fā)明的檢測方法用于生物靶標(biāo)時，步驟h)可包括裂解所述靶標(biāo)并且檢測在裂解中釋放的核酸。
除上述配置外，本發(fā)明還包括從以下對實施本發(fā)明的實施例和附圖的描述中可見的另一些配置，在附圖中
圖1是本發(fā)明裝置的示意圖。
圖2是本發(fā)明裝置的示意圖，其還包含液體樣品收集系統(tǒng)。
圖3顯示用于以下實施例的本發(fā)明裝置的組件，所述裝置包含并排的兩個相同組件，每個均由以下組成反應(yīng)室(1)；兩個反應(yīng)室放置在配備有磁體的超聲浴(3)中； 它們的一端經(jīng)泵(5 連接至廢料容器(7)，另一端連接至包含樣品的容器(9)，通過電磁閥(8)向反應(yīng)室填入樣品。
圖4至7顯示并比較由本發(fā)明方法鑒定的樣品基因組單元數(shù)(N)或樣品中起初存在的基因組單元數(shù)(NO)。
實施例河水樣品中細(xì)菌的捕獲
在并排通道中放置兩個相同的裝置(圖3)。
流體的循環(huán)由與PFA軟管(外徑1. 6mm,內(nèi)徑Imm)連接的Ismatec IPC-N蠕動泵提供。這些軟管作為反應(yīng)室，其中儲存磁珠。
珠由磁體控制。磁體的位置由電磁體的臂控制；在打開位置時，磁體與軟管接觸； 在關(guān)閉位置時，磁體與其分離。
軟管中作為反應(yīng)室并放置的區(qū)域被浸沒在超聲浴中，其功能是在磁場捕獲珠后分散它們形成的聚集體。
軟管的下游連接至六通閥(Upchurch V_1471_DC)，使得可以選擇進入的液體。
全部這些組件的控制是自動化的，并且通過Nation Instrument公司的LabView 軟件實施。
將體積V為20ml的完整樣品儲存在容器中。
將等價于10 μ 1體積的量(即直徑為Iym的1.8Χ108個珠)填入軟管中打開位置的磁體所處的水平上。
用泵從樣品中取得體積ν為100 μ 1的級分。
將該體積ν放置在軟管中珠所處水平上，然后將磁體放置在關(guān)閉位置；開啟超聲并使珠在體積ν的級分中分散。
然后關(guān)閉超聲；移動軟管中的樣品，其目的是重懸可能因超聲作用沉積在壁上的珠。
珠與樣品接觸45秒以捕獲靶標(biāo)。
然后將磁體放置在打開位置，珠因而被磁場捕獲并聚集在軟管的內(nèi)壁上。泵將樣品向廢料容器的方向以300 μ 1/分鐘的速度推進，并將體積ν的新樣品級分放置在反應(yīng)室中珠所在處。
重復(fù)捕獲循環(huán)50至100次。
靶標(biāo)洗脫
由于系統(tǒng)包含幾個閥，可以選擇連接至含有洗脫緩沖液(或者如果需要甚至含有裂解緩沖液)的容器的新入口。該緩沖液經(jīng)泵的作用被放置在珠儲存區(qū)域的水平上。
磁體置于關(guān)閉位置，施加超聲以分散緩沖液中的珠。然后從珠表面洗脫靶標(biāo)并任選地裂解。
然后將磁體置于打開位置；珠聚集并被保留，而包含靶標(biāo)的洗脫(和任選地裂解) 緩沖液樣品被泵回收。
詳細(xì)方案
對兩種液體樣品施用該捕獲原理，一種是20ml的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8)， 另一種是當(dāng)天取得的IOmi河水(Rhone);在這兩種樣品中摻入靶標(biāo)約 ο6基因組單元的大腸桿菌(Escherichia coll)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞(對應(yīng)于約IO6 個細(xì)菌)。
所用磁珠為包被有聚乙烯亞胺層的超順磁珠(SiMAG-PEI Chemicell)，它允許與靶標(biāo)(細(xì)菌細(xì)胞)發(fā)生靜電型相互作用；這是由于細(xì)菌具有總負(fù)電荷并且PEI是強陰離子交換劑。珠表面/樣品級分體積的比值為2. 8m2/l。
為了處理20ml的IOmM Tris-HCl(pH 8)，需要在并排安裝的兩個裝置上運行100 個100 μ 1的循環(huán)。基于相同的計算，為了處理IOml的河水需要運行50個循環(huán)。
為了評價該捕獲系統(tǒng)的效率，在所制備的100μ 1樣品中添加106個基因組單元， 對其處理一個循環(huán)以獲得參照捕獲效率。
在捕獲循環(huán)結(jié)束時，用100 μ 1 IOmM Tris-HCl回收珠。然后直接在珠上進行DNA 提取于37°C在裂解緩沖液(5M胍-HC，20mM Tris,pH 8，1 %十二烷基肌氨酸)中進行細(xì)胞裂解。孵育10分鐘后，將混合物置于37°C的超聲浴中2分鐘。用磁體將珠匯聚在一起，回收上清液并放置于4倍其體積的溶液(包含3M鹽酸胍，20mM Tris-HCl,80% (ν/ν)乙醇， pH 4)中；然后用2. 5μ 1硅烷醇功能化磁珠(SiMAG-SiIanol，Chemicell)捕獲DNA。用2mM NaCl, IOmM Tris-HCl,75% (ν/ν)乙醇溶液潤洗2次后，將純化的DNA洗脫在10 μ 1 IOmM Tris-HCKpH 8)中之前進行2分鐘的超聲浴。
還可以使用之前捕獲步驟所用儀器裝置來自動化地進行DNA提取和純化方案。
通過定量PCR測定所提取的DNA量(N)并表示為基因組單元。為此，將5μ1提取得DNA懸液與5 μ 1以下PCR試劑混合0. 3 μ M引物，2. 5U Gold Taq聚合酶，BSA (1. 4mg/ ml)，IX 緩沖液(補充有 Applied Biosystems 的 AmpliTaqGold DNA 聚合酶)，3M MgCl2, 200 μ M dNTP，0. 65mM 甜菜堿。
所用引物序列為
大腸桿菌(16S核糖體RNA基因)
ColiTQF 正向 5，-CATGCCGCGTGTATGAAGAA
Col i TQR 反向 5，-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA
探針5，-TATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAA
枯草芽孢桿菌(16S核糖體RNA基因)
BacFbis 正向 bis 5，-ACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG
BacRbis 反向 bis 5，-TAGCCGAAGCCACCTTTTATGT
探針5，-TACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGT
將5 μ 1初始液體樣品(之前進行超聲10分鐘)與5 μ 1上述PCR試劑的混合物混合，通過PCR測定樣品中起初存在的基因組單元數(shù)(NO)。
MM
-檢測TriS-HCl緩沖液樣品中的靶標(biāo)
所得結(jié)果(圖4和5)顯示觀察到的本發(fā)明裝置捕獲的DNA量(N)與相應(yīng)初始樣品中存在的DNA量(NO)之間的差異小于0.4 log 10，這表明幾乎所有起初存在的細(xì)胞都被捕獲。
-檢測河水樣品中的靶標(biāo)
同樣地，所得結(jié)果(圖6和7)顯示觀察到的本發(fā)明裝置捕獲的DNA量(N)與相應(yīng)初始樣品中存在的DNA量(NO)之間的差異小于0.2 log 10，這再次表明幾乎所有起初存在的細(xì)胞都被捕獲。
權(quán)利要求
1.用于處理體積V大于或等于IOml的液體樣品的自動化裝置，所述自動化裝置包含其中置有功能化磁珠的體積ν為10 μ 1至5ml的反應(yīng)室，允許捕獲生物或化學(xué)靶標(biāo)的所述珠的量使得珠捕獲表面積與所述反應(yīng)室體積的比值為0. 2至200m2/l，所述反應(yīng)室配備有-能使所述珠均勻分散的非侵入式攪拌系統(tǒng)； -可以被啟動或關(guān)閉的磁場；-用于填入和排出所述反應(yīng)室的部分或全部內(nèi)含物的流體移動系統(tǒng)。
2.權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述反應(yīng)室的體積優(yōu)選為50至500μ 1，優(yōu)選約 100 μ 1。
3.權(quán)利要求1或2的裝置，其特征在于所述反應(yīng)室包被有選自Teflon、ETFE,PFA和 PTFE的疏水表面。
4.前述權(quán)利要求中任一項的裝置，其特征在于所述非侵入式攪拌系統(tǒng)是超聲攪拌系統(tǒng)。
5.前述權(quán)利要求中任一項的裝置，其特征在于所述磁場由永磁體或電磁體產(chǎn)生。
6.前述權(quán)利要求中任一項的裝置，其特征在于所述功能化磁珠的直徑為0.5至10 μ m。
7.前述權(quán)利要求中任一項的裝置，其特征在于其還包含液體樣品收集系統(tǒng)，所述液體樣品收集系統(tǒng)由用于取得所述樣品的流體系統(tǒng)如泵以及所述反應(yīng)室上游的儲存容器組成。
8.用權(quán)利要求1至7中任一項的裝置捕獲體積V大于或等于IOml的液體樣品中可存在的生物或化學(xué)靶標(biāo)的方法，其包括以下步驟a)取得所述液體樣品的體積為ν的級分；b)在所述磁場被關(guān)閉的情況下，將所述級分與所述裝置的反應(yīng)室中的功能化磁珠相接觸；c)通過所述非侵入式攪拌系統(tǒng)均勻分散所述珠至少5秒；d)通過開啟的磁場捕獲所述珠；e)排出所述級分；f)將步驟a)至e)重復(fù)η次，使得η為1至V/v。
9.權(quán)利要求8的捕獲方法，其特征在于η= V/v。
10.檢測生物或化學(xué)靶標(biāo)的方法，其包括權(quán)利要求8或9的捕獲方法的步驟a)至f)， 其特征在于其還包括以下步驟g)洗脫所述靶標(biāo)和h)檢測在步驟g)中洗脫的所述靶標(biāo)。
11.權(quán)利要求10的檢測生物靶標(biāo)的方法，其特征在于步驟h)包括裂解所述靶標(biāo)和檢測在所述裂解中釋放的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于收集和濃縮生物或化學(xué)靶標(biāo)以對其進行檢測的裝置，其中所述裝置包含其中放置功能化磁珠(2)的反應(yīng)室(1)、超聲攪拌系統(tǒng)(3)、可被啟動(打開位置)或關(guān)閉(關(guān)閉位置)的磁場(4)和用于填入(51)和排出(52)反應(yīng)室內(nèi)含物的部分或全部的流體移動系統(tǒng)(5)。本發(fā)明還涉及使用所述裝置捕獲生物或化學(xué)靶標(biāo)的方法。
文檔編號C12Q1/24GK102498402SQ201080027260
公開日2012年6月13日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者多蘿泰·雅里, 紀(jì)堯姆·迪蘭, 西爾瓦伊內(nèi)·沙博, 齊里爾·德拉特 申請人:原子能與替代能源委員會