專利名稱：通過展開進(jìn)行高通量核酸測序和相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及核酸測序，以及與之相關(guān)的方法和產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
核酸序列編碼生物體發(fā)揮功能和繁殖所必需的信息，且實(shí)質(zhì)上是生命的基本信息 (blueprint)。因此確定這些序列在對生物體如何存活以及在何處存活的純理論研究中，以及在諸如藥物研發(fā)的應(yīng)用科學(xué)中，都是有用的方法。在醫(yī)學(xué)中，測序方法可用于診斷以及研發(fā)多種疾病的治療方法，包括癌癥、心臟病、自身免疫病癥、多發(fā)性硬化或肥胖癥。在工業(yè)中，測序可用于設(shè)計(jì)改良的酶促方法或合成生物體。在生物學(xué)中，這類方法可以用于研究例如生態(tài)系統(tǒng)的健康狀態(tài)，因此擁有廣泛的應(yīng)用。個體的獨(dú)特DNA序列為他們對某些疾病的敏感性提供了有用的信息。序列可以為患者提供機(jī)會來做早期檢測的篩選以及獲得預(yù)防性治療。并且，如果獲得患者的個體基本信息，臨床醫(yī)生就可以實(shí)施個性化治療來使藥物效力最大化并使藥物不良反應(yīng)最小化。同樣，確定病原生物體的基本信息能夠?yàn)閭魅拘约膊硇碌闹委煼椒ㄒ约案辛Φ牟≡w監(jiān)測。全基因組DNA測序?qū)楝F(xiàn)代醫(yī)學(xué)提供基礎(chǔ)。DNA測序是確定給定DNA多聚體化學(xué)成分的順序的方法。這些化學(xué)成分，稱為核苷酸，以四種普遍的形式存在于DNA中脫氧腺苷(A)、脫氧鳥苷(G)、脫氧胞苷(C)和脫氧胸苷(T)。二倍體人類基因組的測序需要確定大約60億個核苷酸的連續(xù)順序。目前，大多數(shù)DNA測序是使用Frederick Sanger研發(fā)的鏈終止方法來進(jìn)行的。這種技術(shù)，稱為Sanger測序，運(yùn)用DNA合成的序列特異性終止和熒光修飾的核苷酸報道底物來獲得序列信息。這種方法通過用改良的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來確定長度高達(dá)1000個堿基的靶核酸鏈的序列或讀長。在這種改良的反應(yīng)中，測序在選擇的堿基類型處(A、C、G或T)被隨機(jī)打斷，并且通過毛細(xì)管凝膠電泳確定該打斷序列的長度。然后所得的長度可以確定哪種類型的堿基位于那個長度上。產(chǎn)生了很多重疊的讀長，并且使用數(shù)據(jù)處理將其序列重疊， 從而確定最可靠的數(shù)據(jù)配合。這種產(chǎn)生序列讀長的方法是非常費(fèi)力和昂貴的，并且正在被效率更高的新方法取代。Sanger法曾用于提供人類基因組計(jì)劃的大部分序列數(shù)據(jù)，該計(jì)劃產(chǎn)生人類基因組的首次完整序列。完成這項(xiàng)計(jì)劃花費(fèi)了 10年和將近30億美元?？紤]到這些巨大的通量和成本限制，顯然，DNA測序技術(shù)需要徹底的改善來達(dá)到科學(xué)界提出的規(guī)定的目標(biāo)。為了達(dá)到這一目標(biāo)，許多二代技術(shù)，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越Sanger測序法的通量和每堿基成本的局限性，正占有越來越多的測序市場份額。然而，這些“合成測序”法仍然不能實(shí)現(xiàn)市場要求的通量、成本和質(zhì)量目標(biāo)，例如用于個性化醫(yī)療的全基因組測序。例如，妨4 Life kiences公司正在生產(chǎn)可以在7. 5個小時內(nèi)以200個核苷酸的平均讀長處理1億個堿基的儀器(例如，基因組測序儀)。他們的方法是，用改變的PCR在珠子的表面產(chǎn)生均一的靶核酸的群體(colony)，長度為數(shù)百個堿基。這一過程術(shù)語上稱為乳液PCR。然后將成千上萬的珠子排列于“鉻尖晶石平板(picotiter plate) ”上。然后準(zhǔn)備該平板用于進(jìn)一步的測序，從而使每個核酸堿基類型從該平板上依次被洗滌下來。帶有并入堿基的靶標(biāo)的珠子產(chǎn)生焦磷酸副產(chǎn)物，該副產(chǎn)物可用于催化隨后被成像系統(tǒng)檢測的光產(chǎn)生反應(yīng)。Illumina公司也有相似的方法，該方法用可逆的終止核苷酸和熒光標(biāo)記進(jìn)行核酸測序。Illumina的IG分析儀的平均讀長少于40個核苷酸。不同于用乳液PCR來擴(kuò)增序列靶標(biāo)，Illumina的方法是在陣列表面擴(kuò)增PCR群體。4M和Illumina公司的方法都用復(fù)雜化的聚合酶擴(kuò)增來增強(qiáng)信號強(qiáng)度，在有速度限制的序列延伸循環(huán)中進(jìn)行堿基檢測，并且由于并入錯誤降低了與讀長成比例的測量信噪比從而限制了讀長。Applied Biosystem公司用可逆的終止連接而不是通過合成測序來讀取DNA。像 454公司的基因組測序儀一樣，該技術(shù)用基于珠子的乳液PCR來擴(kuò)增樣品。由于大部分的珠子不承載PCR產(chǎn)物，于是研究人員接下來使用富集步驟選擇包被有DNA的珠子。將生物素包被的珠子涂布并固定于覆蓋有鏈霉抗生物素的載玻片陣列上。然后使固定的珠子經(jīng)過 Smer (單元單體)探針雜交(每個用4種不同的熒光染料標(biāo)記)、連接和剪切(在第5和第 6個堿基之間剪切從而產(chǎn)生用于下一輪連接的位點(diǎn))的過程。每個探針在第4和第5個堿基位置用雙堿基編碼系統(tǒng)檢測兩個堿基，可由成像系統(tǒng)記錄。與Illumina公司的方法相似，Applied Biosystem公司的SOLID平臺的平均讀長也少于40個核苷酸。通過直接檢測DNA單個分子來消除聚合酶擴(kuò)增步驟的時間和費(fèi)用的其他方法正在研發(fā)之中。因熒光標(biāo)記的堿基通過將第二種熒光團(tuán)加入到改造的DNA聚合酶中并用lister共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)來鑒定核苷酸而得以確定它們的序列，Visigen Biotechnologies公司正在檢測帶熒光標(biāo)記的堿基。這種技術(shù)面臨分辨堿基信號的難題，將這些堿基信號經(jīng)由低于1納米以及經(jīng)由聚合酶并入作用分辨出來，這會帶來很大的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差。LingVitae正在研發(fā)的一種方法可以確定插入到固定的質(zhì)粒載體中的cDNA的序列。該方法使用IIS類限制酶切割靶核酸并將寡聚體連接到靶標(biāo)上。通常，由限制酶產(chǎn)生的5’或3’末端突出端中的一個或兩個核苷酸決定了在連接混合物中哪種寡聚體文庫會被加到靶標(biāo)的粘性切割末端。每個寡聚體含有“信號”序列，該序列特異性識別它所取代的核苷酸。然后重復(fù)切割和連接過程。接下來用各種寡聚體的特異性標(biāo)簽，對新的分子進(jìn)行測序。該方法的產(chǎn)物被稱為“設(shè)計(jì)多聚體”，并且總是由比其所取代核酸更長的核酸組成(例如，一個二核苷酸靶序列被一個“放大”的多達(dá)100個堿基對的多核苷酸序列所取代)。該方法的優(yōu)勢在于，如果需要，可以擴(kuò)增雙鏈產(chǎn)物鏈。缺點(diǎn)在于該方法必須是循環(huán)的，并且如果同時發(fā)生多個限制性切割，那么模板的連續(xù)性將會丟失。Kless的美國專利第7，060, 440號描述了一種測序方法，該方法包括用聚合酶的聚合作用來并入寡聚體。改良的Sanger方法，以末端終止的寡聚體為底物，用于通過凝膠電泳或毛細(xì)管層析法建立測序序列梯。雖然用末端連接使寡聚體偶聯(lián)是眾所周知的，但是在模板指導(dǎo)過程中用聚合酶偶聯(lián)寡聚體以新的優(yōu)勢被應(yīng)用。期望聚合反應(yīng)技術(shù)能大力發(fā)展，因?yàn)楦牧嫉木酆厦?和連接酶)可以通過基因工程和生物勘探獲得，并且通過聚合酶修飾去除外切核酸酶活性的方法也是已知的。例如， Williams的已公開的美國專利申請2007/0048748描述了使用突變的聚合酶來并入染料標(biāo)記的和其他修飾的核苷酸。這些聚合酶的底物也包括Y-磷酸鹽標(biāo)記的核苷酸。發(fā)現(xiàn)用嵌合的和突變的聚合酶可以提高并入速度并降低錯誤率。此外，學(xué)術(shù)和工業(yè)團(tuán)隊(duì)都做了很大的努力來利用非合成方法確定天然DNA的序列。例如，Agilent Technologies公司與大學(xué)合作者正研發(fā)一種單分子檢測方法，該方法使DNA通過一個納米孔，以便通過它穿過納米孔時進(jìn)行檢測。跟Visigen和LingVitae — 樣，這種方法必須克服有效地和準(zhǔn)確地從由亞納米尺寸所分離的單個核堿基獲得清晰信號的問題，以及研發(fā)相似大小的可再生孔徑的問題。就這點(diǎn)而言，在高通量過程中，還仍然必須實(shí)現(xiàn)通過檢測DNA的組成部分對其直接測序，這是因?yàn)殒溨泻塑账岬男〕叽?中心與中心大約4埃)以及其中相應(yīng)的信噪比和信號分辨率的限制造成的。DNA的固有的二級結(jié)構(gòu)使直接檢測更加復(fù)雜，它并不輕易地延伸成完美的線性多聚體。克服了高通量DNA測序空間分辨率問題的方法，記載于已經(jīng)公開的PCT申請WO 2008/157696和WO 2009/055617中。WO 2008/157696描述了通過展開進(jìn)行測序的方法。通過模板指導(dǎo)合成，產(chǎn)生包含核苷酸間連接臂、報道基團(tuán)以及可切割的核苷酸間鍵的子鏈。隨后切割核苷酸間鍵，從而產(chǎn)生長度大于靶核酸長度的寡聚體。較長的寡聚體能產(chǎn)生比較短的靶核酸更好的檢測分辨率。在相關(guān)方法中，WO 2009/055617公開了這樣一種方法，在該方法中，通過模板指導(dǎo)合成，產(chǎn)生包含報道基團(tuán)的子鏈，該報道基團(tuán)編碼小于靶核酸的全部基因組序列。報道子含量的減少，導(dǎo)致比用更高的報道子含量的方法所獲得的分辨率更好的分辨率。雖然DNA測序領(lǐng)域已取得重大進(jìn)步，但是該領(lǐng)域仍然需要新的改進(jìn)的DAN測序方法和DNA寡聚體的相關(guān)檢測和呈遞方法。本發(fā)明滿足了這些需要并提供了其他相關(guān)優(yōu)勢。發(fā)明概述總的來說，本發(fā)明公開了克服了現(xiàn)有高通量核酸測序技術(shù)表現(xiàn)出的空間分辨率、 呈遞、檢測和相關(guān)難題的方法和相應(yīng)的設(shè)備、產(chǎn)物及試劑盒。在一實(shí)施方案中，這是通過在第一替代多聚體(在本文稱為“Xpandomer”)上編碼靶核酸的所有堿基序列信息或僅在第二替代多聚體(在本文中稱為"S-Xpandomer")上編碼靶核酸的堿基序列信息的子集來實(shí)現(xiàn)的。替代多聚體(分別為X子鏈和S-X子鏈)具有使得它們易于檢測的延伸的長度。通過DNA靶標(biāo)的模板依賴性復(fù)制，形成Xpandomer和S-Xpandome，在所述Xpandomer和 S-Xpandome中，順序連接多個亞基(在本文中分別稱為Xmer和S-Xmer)。這種合成保留了靶核酸的原始遺傳信息，同時也提高了序列數(shù)據(jù)個體元件的線性分離。在一實(shí)施方案中，公開了一種用于靶核酸測序的方法，包括a)提供通過模板指導(dǎo)合成所產(chǎn)生的X子鏈，該子鏈包含偶聯(lián)于序列中的多個亞基，該序列對應(yīng)于全部或部分靶核酸的連續(xù)核苷酸序列，其中個體亞基包含連接臂(tether)、至少一個探針或核堿基(nucleobase)殘基以及至少一個可選擇性切割的鍵b)切割至少一個可選擇性切割的鍵，產(chǎn)生長度比子鏈的多個亞基更長的Xpandomer，該Xpandomer包含連接臂和報道元件 (reporter element)，該報道元件用于解析序列中的遺傳信息，該序列對應(yīng)于全部或部分靶核酸的連續(xù)核苷酸序列；c)檢測該Xpandomer的報道元件。制備和使用Xpandomer的具體實(shí)施方案和方法的實(shí)例較詳細(xì)地披露于公開的PCT W02008/157696 中。在另一實(shí)施方案中，提供了用于靶核酸測序的方法，包括a)提供通過模板指導(dǎo)合成所產(chǎn)生的S-X子鏈，該子鏈包含偶聯(lián)于序列中的多個亞基，該序列對應(yīng)于全部或部分靶核酸的連續(xù)核苷酸序列，其中個體亞基包含連接臂、至少一個探針和至少一個可選擇性切割的鍵，該至少一個探針包含X個核堿基殘基(X是大于1的正整數(shù))和至少一個報道構(gòu)建體，該報道構(gòu)建體編碼該探針的Y個核堿基殘基的遺傳信息 (Y是小于X的正整數(shù))；b)切割至少一個可選擇性切割的鍵，產(chǎn)生長度比S-X子鏈的多個亞基長的 S-Xpandomer,該S-Xpandomer包含連接臂和用于確定每X個核堿基中的Y個核堿基的報道元件；以及c)檢測至少一個報道構(gòu)建體，以使子鏈的每X個核堿基中的Y個核堿基的遺傳信
息解碼。因?yàn)閅小于X，因此僅檢測靶核酸的一部分核苷酸堿基。例如，且僅用于舉例，當(dāng)X 是4且Y是1時，檢測報道構(gòu)建體，以確定子鏈的每4個核堿基中的1個核堿基。因?yàn)樽渔湴悸?lián)于序列中的多個亞基，該序列對應(yīng)于全部或部分靶核酸的連續(xù)核苷酸序列，因此確定了靶核酸的每4個核堿基中的1個核堿基。在許多情況下，靶核酸的“每X個核堿基中的Y個核堿基”(例如，每4個核堿基(every 4 nucleobase)或每4個核堿基(every 4th nucleobase)中的1個核堿基)的檢測，對于測序目的而言，是足夠的。可選地且如果需要， 可以使用利用多個探針構(gòu)建體(或探針構(gòu)建體庫)的靶核酸的模板依賴性復(fù)制，產(chǎn)生用于檢測的其他S-Xpandomer，從而以相似的方式鑒定剩余的交錯靶核堿基。在上述方法的另一實(shí)施方案中，通過模板指導(dǎo)滾環(huán)聚合方法，產(chǎn)生靶核酸。在其他實(shí)施方案中，模板指導(dǎo)合成包括連接反應(yīng)。例如，連接反應(yīng)可以包括酶促連接反應(yīng)。仍然在其他實(shí)施方案中，至少一個報道構(gòu)建體與以下相連S-Xpandomer 的連接臂；至少一可選擇性切割的鍵切割前的S-X子鏈；或至少一可選擇性切割的鍵切割后的S-Xpandomer。在其他實(shí)施方案中，至少一個報道構(gòu)建體在S-X子鏈模板指導(dǎo)合成后連接于所述 S-X子鏈。在其他實(shí)施方案中，連接臂在S-X子鏈模板指導(dǎo)合成后連接于所述S-X子鏈。在其他實(shí)施方案中，S-Xpandomer還包含至少一個探針的全部或部分。例如，在一實(shí)施方案中，至少一個報道構(gòu)建體與至少一個探針相連。S-Xpandomer包含偶聯(lián)于序列的多個亞基，該序列對應(yīng)于全部或部分靶核酸的連續(xù)核苷酸序列。因此，在另一實(shí)施方案中，S-Xpandomer包含以下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.用于靶核酸測序的方法，包括a)提供通過模板指導(dǎo)合成所產(chǎn)生的S-X子鏈，所述子鏈包含偶聯(lián)于序列中的多個亞基，所述序列對應(yīng)于全部或部分所述靶核酸的連續(xù)核苷酸序列，其中個體亞基包含連接臂、 至少一個探針以及至少一個可選擇性切割的鍵，所述至少一個探針包含X個核堿基殘基(X 是大于1的正整數(shù))和編碼所述探針的Y個核堿基殘基的遺傳信息的至少一個報道構(gòu)建體 (Y是小于X的正整數(shù))；b)切割所述至少一個可選擇性切割的鍵，以產(chǎn)生長度比所述S-X子鏈的多個亞基長的 S-Xpandomer,所述S-Xpandomer包含所述連接臂和用于確定每X個核堿基中的Y個核堿基的報道元件；以及c)檢測所述至少一個報道構(gòu)建體，以使所述子鏈的每X個核堿基中的Y個核堿基的遺傳信息解碼。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸通過模板指導(dǎo)滾環(huán)聚合方法產(chǎn)生。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述模板指導(dǎo)合成包括連接反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述連接反應(yīng)是酶促連接反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個報道構(gòu)建體與以下相連 所述S-Xpandomer的連接臂；在所述至少一個可選擇性切割的鍵切割前的S-X子鏈；或在所述至少一個可選擇性切割的鍵切割后的S-Xpandomer。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個報道構(gòu)建體在所述S-X子鏈模板指導(dǎo)合成后，連接于所述S-X子鏈。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述連接臂在所述S-X子鏈模板指導(dǎo)合成后，連接于所述S-X子鏈。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述S-Xpandomer還包含所述至少一個探針的全部或部分。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述至少一個報道構(gòu)建體是所述至少一個探針或與所述至少一個探針相連。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個可選擇性切割的鍵是 共價鍵；連接臂內(nèi)的鍵；所述S-X子鏈的探針或核堿基殘基之間或之內(nèi)的鍵；或所述S-X子鏈的探針或核堿基殘基和靶模板之間的鍵。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述S-Xpandomer包含下述結(jié)構(gòu)Γ T , TI mm|32ημμIC其中τ表示所述連接臂； P1表示第一探針部分；P2表示第二探針部分；κ表示m個亞基的鏈中的第κ個亞基，其中m是大于3的整數(shù)；以及 α表示選自亞基基序文庫的亞基基序的種類，其中每個所述種類都包含部分所述靶核酸的連續(xù)核苷酸序列的序列信息；
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述S-X子鏈由多個具有下述結(jié)構(gòu)的寡聚體底物構(gòu)建體形成
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中R1和R2選自羥基、磷酸鹽和三磷酸鹽。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸通過滾環(huán)聚合方法產(chǎn)生。
15.用于靶核酸測序的方法，包括a)提供通過雙向模板指導(dǎo)合成所產(chǎn)生的末端配對子鏈，所述末端配對子鏈包含分別與引物區(qū)的第一和第二末端連接的第一和第二序列區(qū)，每個序列區(qū)獨(dú)立地包含偶聯(lián)于序列中
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙向模板指導(dǎo)合成包括連接反應(yīng)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述連接反應(yīng)是酶促連接反應(yīng)。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙向模板指導(dǎo)合成包括從所述引物區(qū)的3’末端開始的聚合酶反應(yīng)。
19.用于靶核酸測序的方法，包括a)提供通過雙向模板指導(dǎo)合成所產(chǎn)生的末端配對替代多聚體子鏈，所述末端配對替代多聚體子鏈具有分別與引物區(qū)的第一和第二末端連接的第一和第二探針區(qū)，所述第一和第二探針區(qū)包含偶聯(lián)于序列中的多個替代多聚體底物，所述序列對應(yīng)于全部或部分所述靶核酸的連續(xù)核苷酸序列，其中，個體替代多聚體底物包含連接臂、至少一個探針以及至少一個可選擇性切割的鍵，個體探針包含X個核堿基殘基(X是大于1的正整數(shù))和編碼Y個核堿基殘基(Y是至少為1且最大高達(dá)X的正整數(shù))的至少一個報道元件；b)切割所述至少一個可選擇性切割的鍵，以產(chǎn)生長度比所述子鏈的多個替代多聚體底物長的末端配對替代多聚體，所述末端配對替代多聚體包含所述連接臂和用于確定每X個核堿基中的Y個核堿基的報道元件；以及C)檢測所述報道元件，以確定所述末端配對子鏈的每X個核堿基中的Y個核堿基。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述雙向模板指導(dǎo)合成包括連接反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述連接反應(yīng)是酶促連接反應(yīng)。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述雙向模板指導(dǎo)合成包括從所述引物區(qū)的3’末端開始的聚合酶反應(yīng)。
23.用于產(chǎn)生末端配對核酸的方法，所述末端配對核酸包含分別與引物區(qū)的第一和第二末端連接的第一和第二區(qū)，其中所述第一和第二區(qū)獨(dú)立地包含至少4個寡核苷酸，所述方法包括a)提供引物適配子，其中所述引物適配子包含與引物互補(bǔ)或幾乎互補(bǔ)的區(qū)域；b)提供所述引物，其中所述引物包含5’磷酸鹽末端和3’羥基末端；c)使所述引物與所述引物適配子雙鏈體化；以及d)從所述5’末端和3’末端兩端延伸所述引物，其中延伸包括將至少4個寡核苷酸連接于所述引物的5’末端。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述末端配對核酸是末端配對替代多聚體子鏈， 且所述核苷酸或寡核苷酸包含Xprobe或S-Xprobe。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述引物適配子使靶核酸環(huán)化。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述引物適配子還包含連接臂，其中所述連接臂任選地連接于固相基質(zhì)。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中連接包括酶促連接反應(yīng)。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，還包括從所述引物的3’末端開始的連接。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，還包括從所述引物的3’末端延伸的聚合酶反應(yīng)。
30.末端配對替代多聚體，包含第一探針區(qū)和第二探針區(qū)，所述第一和第二探針區(qū)分別與引物區(qū)的第一和第二末端連接，所述第一和第二探針區(qū)包含偶聯(lián)于序列中的多個亞基， 所述序列對應(yīng)于全部或部分靶核酸的連續(xù)核苷酸序列。
31.如權(quán)利要求30所述的末端配對替代多聚體，其中所述末端配對替代多聚體通過權(quán)利要求23所述的方法產(chǎn)生。
32.如權(quán)利要求30所述的末端配對核酸，其中所述第一和第二探針區(qū)獨(dú)立地包含4個或更多個探針。
33.試劑盒，包含多個構(gòu)建體(即具有合適的R1/R2末端基團(tuán)的Xmer或S-Xmer)，用于通過模板指導(dǎo)合成形成替代多聚體子鏈，其中所述試劑盒任選地包含利用所述試劑盒形成替代多聚體子鏈的適當(dāng)?shù)恼f明書。
34.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述試劑盒包含10至65000個獨(dú)特的成員。
35.讀取替代多聚體的個體報道元件的方法，包括a)提供替代多聚體，其中所述替代多聚體包含一個或多個個體報道元件；b)提供檢測器構(gòu)造體；b)向所述檢測器構(gòu)造體呈遞所述替代多聚體；c)順序讀取所述個體報道元件，以確定所述報道元件的順序；以及d)利用因此確定的報道順序使所述替代多聚體的遺傳信息解碼。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述檢測器構(gòu)造體包含第一和第二貯存器，所述第一和第二貯存器分別包含第一和第二電極，其中所述第一和第二貯存器通過位于所述第一和第二貯存器之間的納米孔基質(zhì)而分離，所述納米孔基質(zhì)包含至少一個納米孔通道，且讀取所述個體報道元件包括，使所述替代多聚體從所述第一貯存器通過所述至少一個納米孔通道轉(zhuǎn)移到所述第二貯存器。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中讀取所述個體報道元件還包括，當(dāng)所述替代多聚體通過所述納米孔通道轉(zhuǎn)移時，檢測所述納米孔通道中的電阻變化。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述個體報道元件包含至少一種FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)供體或受體熒光團(tuán)，且所述納米孔通道包含至少一種FRET供體或受體熒光團(tuán)， 只要當(dāng)所述個體報道元件包含F(xiàn)RET供體時，所述納米孔通道包含F(xiàn)RET受體，且當(dāng)所述個體報道元件包含F(xiàn)RET受體時，所述納米孔通道包含F(xiàn)RET供體，且讀取所述個體報道元件還包括a)當(dāng)所述替代多聚體通過所述納米孔通道轉(zhuǎn)移時，用光源激發(fā)所述供體熒光團(tuán)；以及b)檢測所述受體熒光團(tuán)發(fā)射的熒光信號。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述供體熒光團(tuán)包含1-4個激發(fā)波長。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述檢測器構(gòu)造體包括納米梳檢測器陣列，所述納米梳檢測器陣列在納米梳槽中或末端具有至少一個檢測器元件，且讀取所述個體報道元件包括使所述替代多聚體穿過所述納米梳槽的末端。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述納米梳檢測器陣列還包括第一和第二電極， 且使所述替代多聚體在所述第一和第二電極間穿過。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中當(dāng)所述替代多聚體在所述第一和第二電極間穿過時，所述個體報道元件誘發(fā)電解液電流變化。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中當(dāng)所述替代多聚體在所述第一和第二電極間穿過時，所述個體報道元件在所述第一和第二電極間形成電流通路。
44.如權(quán)利要求35所述的方法，其中將所述替代多聚體作為線性化陣列呈遞于所述檢測器構(gòu)造體，其中所述線性化陣列包含基質(zhì)。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中讀取所述個體報道元件包括電子束顯微鏡檢術(shù)， 其中所述電子束形成線。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述個體報道元件包含硼或納米金。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述基質(zhì)包含用于改善信噪比的反差包被。
48.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述檢測器構(gòu)造體包括至少一個刀刃式電極，所述個體報道元件包含導(dǎo)電聚合絲，且讀取所述個體報道元件包括a)在所述至少一個刀刃式電極和所述基質(zhì)間施加電勢；以及b)當(dāng)所述替代多聚體在所述至少一個刀刃式電極下穿過時，檢測電流。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述基質(zhì)包含導(dǎo)電膜。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述導(dǎo)電聚合絲包含選自聚乙炔、聚苯胺或聚吡咯的多聚體。
51.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述個體報道元件包含至少一種熒光團(tuán)，其中所述至少一種熒光團(tuán)包含至少一種光譜類型，且讀取所述個體報道元件包括a)提供激發(fā)能量，定位所述激發(fā)能量，以便激發(fā)所述個體報道元件的至少一種熒光團(tuán)；以及b)檢測所述至少一種熒光團(tuán)所發(fā)射的熒光信號。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述激發(fā)能量來自近場源，所述近場源自切口出現(xiàn)，且讀取所述個體報道元件還包括a)平行于所述替代多聚體移動所述切口；以及b)檢測所述個體報道元件的至少一種熒光團(tuán)的熒光信號。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中在遠(yuǎn)場中檢測所述熒光信號。
54.檢測分析物的方法，包括a)提供至少一種分析物；b)提供至少一種指示劑部分，其中所述指示劑部分不與所述分析物相連；c)提供檢測器構(gòu)造體，其中所述檢測器構(gòu)造體包含第一和第二貯存器，所述第一和第二貯存器分別包含第一和第二電極，其中所述第一和第二貯存器通過位于所述第一和第二貯存器之間的納米孔基質(zhì)而分離；d)向所述第一和第二電極提供電勢，其中所述電勢足以使所述至少一種分析物和所述至少一種指示劑部分通過所述至少一個納米孔通道轉(zhuǎn)移；以及c)當(dāng)所述至少一種分析物通過所述至少一個納米孔通道轉(zhuǎn)移時，在所述至少一個納米孔通道處或附近，檢測所述至少一種指示劑部分所發(fā)射的光信號的變化。
55.如權(quán)利要求M所述的方法，還包括提供激發(fā)波長，其中所述激發(fā)波長足以從所述至少一種指示劑部分誘發(fā)熒光信號。
56.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述至少一種分析物是核酸。
57.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述至少一種分析物是替代多聚體。
58.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述至少一種指示劑部分是熒光團(tuán)，所述第一貯存器相對于所述第二貯存器包含高濃度的所述熒光團(tuán)，且檢測光信號的變化還包括，當(dāng)所述熒光團(tuán)通過所述至少一個納米孔通道轉(zhuǎn)移時，檢測熒光信號的變化。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中落射熒光顯微鏡檢術(shù)用于檢測所述熒光信號的變化。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其中錐光法用于檢測所述熒光信號的變化。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述納米孔基質(zhì)包含封阻膜。
62.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述熒光團(tuán)是熒光素。
63.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述第二貯存器包括熒光淬滅劑，且檢測光信號的變化還包括，當(dāng)所述熒光團(tuán)或淬滅劑通過所述至少一個納米孔通道轉(zhuǎn)移時，檢測熒光信號的變化。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述淬滅劑選自QSY7、QSY9和自由基。
65.如權(quán)利要求M所述的方法，還包括提供兩種指示劑部分，其中第一指示劑部分選自指示劑離子，第二指示劑部分選自熒光指示劑，所述第一貯存器包含指示劑離子，所述第二貯存器包含熒光指示劑，且檢測光信號的變化還包括，檢測當(dāng)所述指示劑離子或指示劑部分穿過所述至少一個納米孔通道時所發(fā)射的熒光信號的變化。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述第二貯存器還包含不發(fā)熒光的吸收劑。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，其中掩蔽所述納米孔通道以產(chǎn)生直徑為約1μ m的圓形開口，其中所述開口與所述納米孔通道同軸。
68.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述指示劑離子選自鈣離子、單線態(tài)氫離子、單線態(tài)氧離子、鉀離子、鋅離子、鎂離子、氯離子以及鈉離子。
69.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述熒光指示劑選自Fura-3、Fluo_3、Indo-I以及 Fura RecL
70.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述熒光指示劑是熒光淬滅劑。
71.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述第一貯存器包含碘化物離子，且所述第二貯存器包含熒光素。
72.如權(quán)利要求M所述的方法，還包括提供兩種指示劑部分，其中所述第一貯存器包含第一指示劑部分，而所述第二貯存器包含第二指示劑部分，其中所述第一和第二指示劑部分能結(jié)合以形成激發(fā)態(tài)的第三指示劑部分，且檢測光信號的變化還包括，當(dāng)所述第三指示劑部分松弛回到基態(tài)時，檢測發(fā)射的光子。
73.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述至少一個納米孔包括納米孔陣列，且所述納米孔陣列共享所述第一和第二貯存器。
74.呈遞至少一個替代多聚體用于檢測的方法，包括a)提供檢測器構(gòu)造體，其中所述檢測器構(gòu)造體包括至少一個檢測器元件；b)提供所述至少一個替代多聚體，其中所述至少一個替代多聚體包含一個或多個個體報道元件；以及c)處理所述至少一個替代多聚體，以獲得所述一個或多個個體報道元件的統(tǒng)一的空間和時間間隔。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述檢測器構(gòu)造體包括至少一個納米孔通道。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述檢測器構(gòu)造體包括規(guī)則的納米孔通道陣列。
77.如權(quán)利要求74所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，將所述至少一個替代多聚體的末端與具有至少一個結(jié)合位點(diǎn)的固相基質(zhì)連接。
78.如權(quán)利要求74所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，使所述至少一個替代多聚體對齊排列在基質(zhì)表面上。
79.如權(quán)利要求75所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，將低分子量的帶電荷的線性多聚體連接于所述至少一個替代多聚體的末端。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述帶電荷的線性多聚體選自聚谷氨酸和聚磷酸鹽。
81.如權(quán)利要求75所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，向所述至少一個納米孔通道施加電壓，其中所述電壓高于期望的檢測電壓，且當(dāng)在所述納米孔通道中檢測到替代多聚體時，將所述電壓降低至所述期望的檢測電壓。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中操作所述電壓，使得一次僅有一個替代多聚體可以占據(jù)所述至少一個納米孔通道。
83.如權(quán)利要求75所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，將障礙物連接于所述至少一個替代多聚體的末端，并在所述至少一個納米孔通道中預(yù)裝填所述至少一個替代多聚體，其中所述障礙物防止所述至少一個替代多聚體穿過所述至少一個納米孔通道，并防止多個替代多聚體占據(jù)同一納米孔通道。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述障礙物選自大體積樹枝狀大分子和珠子。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述珠子是磁珠。
86.如權(quán)利要求75所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，將線性鐵氧體多聚體連接于所述至少一個替代多聚體的末端，并操作磁場和電場，以獲得所述一個或多個個體報道元件的統(tǒng)一的空間和時間間隔。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中操作所述磁場和所述電場，使得一次僅有一個替代多聚體可以占據(jù)所述至少一個納米孔通道。
88.如權(quán)利要求74所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，控制所述至少一個替代多聚體向所述檢測器構(gòu)造體的流動。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所述控制所述至少一個替代多聚體的流動包括， 將所述至少一個替代多聚體連接于基質(zhì)，其中所述連接包括可尋址的、可切割的連接；并選擇性切割所述連接，以便每單位時間從所述基質(zhì)釋放一個替代多聚體。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其中選擇性切割所述可切割的連接包括，控制切割速率，使得一次僅有一個替代多聚體可以占據(jù)所述至少一個檢測器元件。
91.如權(quán)利要求89所述的方法，其中所述連接選自光裂解連接、熱裂解連接和電化學(xué)裂解連接。
92.如權(quán)利要求88所述的方法，其中控制所述至少一個替代多聚體的流動包括a)提供至少一個門控構(gòu)造體，其中所述至少一個門控構(gòu)造體包括第一、第二和第三電極；以及b)操作獨(dú)立施加于所述第一、第二、以及第三電極的電場，以獲得所述一個或多個個體報道元件的統(tǒng)一的空間和時間間隔。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中操作所述電場，使得一次僅有一個替代多聚體可以占據(jù)所述至少一個檢測器元件。
94.如權(quán)利要求88所述的方法，其中控制所述至少一個替代多聚體的流動包括a)提供至少一個門控構(gòu)造體，其中所述至少一個門控構(gòu)造體包括第一和第二多孔電極和門控元件，其中將所述第一和第二多孔電極分別固定于所述門控元件的第一和第二側(cè)；b)向所述第一和第二電極施加電場；以及c)通過所述門向所述至少一個檢測器元件轉(zhuǎn)運(yùn)所述至少一個替代多聚體。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其中所述門控元件選自多孔膜和納米孔。
96.如權(quán)利要求94所述的方法，其中操作所述電場，以獲得所述一個或多個個體報道元件的統(tǒng)一的空間和時間間隔。
97.如權(quán)利要求94所述的方法，其中操作所述電場，使得一次僅有一個替代多聚體可以占據(jù)所述至少一個檢測器元件。
98.如權(quán)利要求95所述的方法，其中所述門控元件是多孔膜。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述多孔膜包含直徑為約20nm到約IOOnm的孔。
100.如權(quán)利要求98所述的方法，其中所述多孔膜選自氧化鋁和形成多聚體軌道的膜。
101.如權(quán)利要求94所述的方法，其中提供多元門控構(gòu)造體(即提供多于一個門控構(gòu)造體)。
102.如權(quán)利要求88所述的方法，其中控制所述至少一個替代多聚體的流動包括，提供至少一個選自親和凝膠或通道的門控構(gòu)造體，并且處理所述至少一個替代多聚體包括a)將親和拖拉標(biāo)簽連接于所述替代多聚體的末端；以及b)施加足以通過所述門控構(gòu)造體向所述至少一個檢測器元件轉(zhuǎn)移所述替代多聚體的電場。
103.如權(quán)利要求102所述的方法，其中操作所述電場，以獲得所述一個或多個個體報道元件的統(tǒng)一的空間和時間間隔。
104.如權(quán)利要求102所述的方法，其中操作所述電場，使得一次僅有一個替代多聚體可以占據(jù)所述至少一個檢測器元件。
105.如權(quán)利要求102所述的方法，其中所述門控構(gòu)造體是親和凝膠。
106.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述固相基質(zhì)具有均勻間隔的結(jié)合位點(diǎn)。
107.如權(quán)利要求106所述的方法，其中所述結(jié)合位點(diǎn)是大小為約1μ m的斑點(diǎn)。
108.如權(quán)利要求106所述的方法，其中最多為一個替代多聚體與每個個體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)I=I O
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述替代多聚體還包含連接于所述替代多聚體末端的樹枝狀大分子，其中所述樹枝狀大分子在空間上阻止另一個替代多聚體與同一位點(diǎn)的結(jié)合。
110.如權(quán)利要求106所述的方法，其中所述固相基質(zhì)選自韌性聚對苯二甲酸乙二酯 (PET)膜、浮法玻璃、硅晶片以及不銹鋼。
111.如權(quán)利要求106所述的方法，其中所述至少一個結(jié)合位點(diǎn)包括所述固相基質(zhì)上的行列。
112.如權(quán)利要求111所述的方法，其中所述行列的寬度小于與其結(jié)合的替代多聚體之間的距離。
113.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述基質(zhì)具有至少一個與其結(jié)合的替代多聚體， 使所述基質(zhì)從法線旋轉(zhuǎn)180度，到達(dá)施加的電場，所述電場使所述至少一個替代多聚體以順直且伸展的方向平放在所述基質(zhì)的表面上。
114.如權(quán)利要求113所述的方法，其中還將所述至少一個替代多聚體以平放、順直且伸展的方向連接于所述基質(zhì)表面。
115.如權(quán)利要求114所述的方法，其中通過所述基質(zhì)表面的紫外線或化學(xué)激活，將所述至少一個替代多聚體連接于所述基質(zhì)表面。
116.如權(quán)利要求113所述的方法，其中所述固相基質(zhì)是韌性聚對苯二甲酸乙二酯 (PET)膜。
117.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述基質(zhì)具有至少一個與其結(jié)合的替代多聚體， 使所述基質(zhì)穿過梳狀構(gòu)造體，其中所述梳狀構(gòu)造體包括在輸入側(cè)的拉伸電場、在輸出側(cè)的固定電場，以及在所述輸入側(cè)和輸出側(cè)之間的梳狀元件，且處理所述至少一個替代多聚體還包括，使所述基質(zhì)在所述梳狀物下穿過所述拉伸電場，并穿過所述固定電場，使得所述至少一個替代多聚體以順直且伸展的方向平放于所述基質(zhì)表面上。
118.如權(quán)利要求117所述的方法，其中還將所述至少一個替代多聚體以平放、順直且伸展的方向連接于所述基質(zhì)表面。
119.如權(quán)利要求118所述的方法，其中通過施加電場或通過所述基質(zhì)表面的紫外線或化學(xué)激活，將所述至少一個替代多聚體連接于所述基質(zhì)表面。
120.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述基質(zhì)具有至少一個與其結(jié)合的替代多聚體， 使所述基質(zhì)在刷狀構(gòu)造體下穿過，其中所述刷狀構(gòu)造體包括絲，所述絲使所述至少一個替代多聚體以順直且伸展的方向平放于所述基質(zhì)表面上。
121.如權(quán)利要求120所述的方法，其中還將所述至少一個替代多聚體以平放、順直且伸展的方向連接于所述基質(zhì)表面。
122.如權(quán)利要求121所述的方法，其中通過施加電場或通過所述基質(zhì)表面的紫外線或化學(xué)激活，將所述至少一個替代多聚體連接于所述基質(zhì)表面。
123.如權(quán)利要求120所述的方法，其中所述絲的直徑為約lOnm。
124.如權(quán)利要求120所述的方法，其中所述絲包含多聚體。
125.如權(quán)利要求IM所述的方法，其中所述絲選自紫外線固化或熱固化的多聚體。
126.如權(quán)利要求77所述的方法，其中所述基質(zhì)包含閉環(huán)韌性膜，且處理所述至少一個替代多聚體還包括連續(xù)過程，所述過程包括a)使所述基質(zhì)旋轉(zhuǎn)通過所述檢測器構(gòu)造體；b)在穿過所述檢測器元件后，從所述基質(zhì)表面除去所述至少一個替代多聚體；c)再將另一個替代多聚體連接于所述基質(zhì)表面；d)以及重復(fù)步驟a和b，直到所有替代多聚體都得到分析。
127.如權(quán)利要求1 所述的方法，其中所述基質(zhì)是韌性聚對苯二甲酸乙二酯(PET)膜。
128.如權(quán)利要求74所述的方法，其中處理所述至少一個替代多聚體包括，將所述至少一個替代多聚體固定于包含納米孔通道的固相基質(zhì)上，其中將所述至少一個替代多聚體固定于所述固相基質(zhì)上包括，將障礙物連接于所述至少一個替代多聚體的末端，并在所述至少一個納米孔通道中預(yù)裝填所述至少一個替代多聚體，其中所述障礙物防止所述至少一個替代多聚體穿過所述至少一個納米孔通道并防止多個替代多聚體占據(jù)同一納米孔通道。
129.如權(quán)利要求1 所述的方法，其中所述障礙物選自大體積樹枝狀大分子和珠子。
130.如權(quán)利要求1 所述的方法，其中所述珠子是磁珠。
全文摘要
公開了核酸測序的方法及相關(guān)產(chǎn)物和檢測并呈遞相關(guān)產(chǎn)物的方法。用于進(jìn)行靶核酸測序的方法包括提供模板指導(dǎo)合成所產(chǎn)生的子鏈，該子鏈包含偶聯(lián)于序列中的多個亞基，該序列對應(yīng)于全部或部分靶序列的連續(xù)核苷酸序列。
文檔編號C12P19/34GK102365367SQ201080014202
公開日2012年2月29日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月29日
發(fā)明者羅伯特·N·麥克盧爾, 馬克·斯達(dá)馬蒂奧斯·可可里斯 申請人:斯特拉托斯基因公司