專利名稱：單鏈dna的不依賴模板的連接的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于使用熱穩(wěn)定的RNA連接酶對單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA) 分子進(jìn)行不依賴模板的分子內(nèi)連接(例如，環(huán)化)、特別是用于在序列和/或大小未知的 ssDNA分子群體中的ssDNA分子的環(huán)化的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和方法，以及由此的試劑盒，和試劑盒的使用方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一直以來在本領(lǐng)域中知悉感染大腸桿菌的噬菌體T4RNA連接酶I (toll)具有不依賴模板的分子內(nèi)連接活性(Gumport和Uhlenbeck，在Gene Amplification and Analysis(基因擴(kuò)增與分析)，第 II 卷中Analysis of Nucleic Acid Structure by Enzymatic Methods (通過酶方法分析核酸結(jié)構(gòu))，Chirikjian和 Papas，編 Elsevier North Holland, Inc. ，1980 ；McCoy 禾口 Gumport，Biochemistry 19 :635-642,1980 ；Sugino，A 等人， J Biol Chem 252 1732-1738，1977)，但是這種活性太低并且對于從線性ssDNA分子中產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA分子的實際使用是無效的。不受理論束縛，這至少部分上可通過以下事實解釋盡管T4RNA連接酶可使用ssDNA分子的5’ -磷酸化末端作為“連接供體”(或“供體”) 大致與ssRNA分子的5’ -磷酸化末端一樣好，但ssDNA分子的3’ -羥基末端用作“連接受體”(或“受體”)遠(yuǎn)不如RNA的3’ -羥基末端有效。美國專利第7,303,901 號和 Blondal 等人(Nucleic Acids Res 33:135-142， 2005) ( 二者均通過引用并入本文)公開了源自棲熱菌屬噬菌體TS2U6的熱穩(wěn)定的RNA 連接酶，該酶感染嗜熱細(xì)菌水管致黑棲熱菌(Tgermus scotoductus) 0這種酶在本文也稱為“噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶”或“噬菌體TS2U6RNA連接酶”或更簡單地稱為 "TS2126RNA連接酶”，對具有5’磷酰基和3’羥基的線性ssDNA以及ssRNA底物具有良好的不依賴模板的分子內(nèi)連接活性。噬菌體TS2U6RNA連接酶的熱穩(wěn)定性顯著高于嗜溫RNA連接酶如T4RNA連接酶，在高達(dá)大約70°C是穩(wěn)定的。TS2126RNA連接酶活性的溫度范圍可以大于約40°C，例如，從大約50°C到大約75°C。噬菌體TS2U6RNA連接酶增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性允許其在對其他酶禁止的溫度條件下使用。例如，由于TS2U6RNA連接酶的熱穩(wěn)定性，它可以在減少不期望的ssDNA或ssRNA 二級結(jié)構(gòu)的較高溫度下使用。這種酶已在THERM0PHAGE RNA 連接酶II或THERM0PHAGE ssDNA連接酶的商標(biāo)名之下從Prokaria公司(Reyjkavik， Iceland)市售六年(到本專利申請的遞交日期為止)，并且自2008年12月中旬在來自 Matis (www. mat is. is ；Reyjkavik, Iceland)的 Prokaria 品牌 THERM0PHAGE ssDNA 連接酶的商標(biāo)名下出售。此外，雇傭本發(fā)明申請人的在美國威斯康辛州麥迪遜的公司EPICENTRE Biotechnologies自2004年在商標(biāo)名CIRCLIGASE ssDNA連接酶之下出售噬菌體連接酶， 并且已投入相當(dāng)大的努力來研究其特性、反應(yīng)條件和使用。iTorchia, C 等人(Nucleic Acids Res 36 :6218-6227,2008)公開從嗜熱古細(xì)菌獲得的RNA連接酶(例如，嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌RNA連接酶1或“Mthfoil”)在環(huán)化線性ssDNA 分子上具有不依賴模板的連接酶活性。使用不依賴模板的連接酶用于ssDNA分子的分子內(nèi)不依賴模板的連接(即環(huán)化)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，美國專利申請第20060240451號公開了使用噬菌體 TS2126RNA連接酶連接由mRNA的5’端片段制備的線性第一鏈cDNA分子并隨后通過滾環(huán)復(fù)制(RCR)或滾環(huán)轉(zhuǎn)錄(RCT)擴(kuò)增環(huán)狀第一鏈cDNA分子的方法。美國專利申請第20040197802號公開了包含5，端部分和3，端部分的正義啟動子引物，其中該5’端部分顯示正義RNA聚合酶啟動子序列并且該3’端部分顯示與生物樣品中的靶核酸序列互補(bǔ)的序列。他們還公開了一種方法，包括通過使用噬菌體TS2U6RNA連接酶的不依賴模板的分子內(nèi)連接使包含線性正義啟動子的第一鏈cDNA環(huán)化。在一些實施方案中，該方法還包括產(chǎn)生環(huán)狀轉(zhuǎn)錄底物并轉(zhuǎn)錄該環(huán)狀轉(zhuǎn)錄底物。這種方法可用于擴(kuò)增生物樣品中的mRNA分子。Polidoros 等人(BioiTechniques 41 :35-39,2006)描述了使用不依賴模板的 T S2126RNA連接酶(CIRCLIGASE ssDNA連接酶(EPICENTRE Biotechnologies,Madison,WI, USA)作為在擴(kuò)增cDNA末端用于隨機(jī)擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法中的步驟。Gunderson KL和Meemers，F(xiàn)的美國專利申請第20080242560號公開了在包括如下步驟的方法中CIRCLIGASETMssDNA連接酶(EPICENTRE)的使用制備數(shù)字DNA球(例如， 在美國專利申請第20080M2560號中的圖8)；和/或DNA諸如基因組DNA的基因座特異性切割和擴(kuò)增，對于擴(kuò)增包括通過多重置換擴(kuò)增或全基因組擴(kuò)增(例如，該專利申請中的圖 17)或通過超分支RCA(例如，該專利申請中的

圖18)以用于產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸陣列(例如， ILLUMINA BeadArrays ；ILLUMINA, San Diego CA, USA)。Drmanac 等人的美國專利申請第 20090011943 號；20090005252 號；20080318796 號；20080234136 號；20080213771 號；20070099208 號；和 20070072208 號公開了使用 CIRCLIGASE ssDNA連接酶(EPICENTRE)產(chǎn)生用于大規(guī)模平行的DNA測序的環(huán)狀ssDNA 模板；例如，美國專利申請第20090011943號公開了連接反應(yīng)混合物用于不依賴模板的連接(即環(huán)化)的用途，該連接反應(yīng)混合物包含的終濃度如下每微升10單位CIRCLIGASE ssDNA連接酶，50mM M0PS，pH 7. 5, IOmM KCl, 5mMMgCl2, ImM DTT,25yM ATP, 1. 25mM MnCl2, 10% PEG4000以及每微升0. 5-10皮摩爾ssDNA。Nunez, AN 等人(Nunez, AN, Kavlick, MF, Robertson, JM,禾口 Budowle， B, " Application of Circular Ligase to Provide Template for Rolling Circle Amplification of Low Amounts of Fragmented DNA(應(yīng)用環(huán)狀連接酶提供模板以用于少量斷裂DNA的滾環(huán)擴(kuò)增)〃，第19屆人類鑒識國際會議(19th International Symposium on Human Identification)，2008 年 10 月 13-16 日 Hollywood，California)還描述了使用在 http://www. promega. com/geneticidproc/ussympl9proc/oralpresentations/Nunez, pdf中的CIRCLIGASE ssDNA連接酶(EPICENTRE)產(chǎn)生的ssDNA分子的另一用途。聯(lián)邦調(diào)查局的這些研究者公開了包括如下步驟的方法使降解的DNA樣品變性以獲得ssDNA片段； 用CIRCLIGASEssDNA連接酶連接該線性ssDNA片段以獲得環(huán)狀ssDNA片段；并隨后使用簡并引物和phi29DNA聚合酶通過RCA擴(kuò)增該環(huán)狀ssDNA片段。這種方法具有通過RCA機(jī)制對降解的DNA樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA)的潛力，可為受損的生物證據(jù)的法醫(yī)分析或其他應(yīng)用提供顯著益處。研究人員發(fā)展了他們認(rèn)為使線性ssDNA分子環(huán)化最適的條件并且為之前不能分型的降解的DNA樣品的分型打下基礎(chǔ)。然而，即使對于他們認(rèn)為最適的反應(yīng)條件，他們注意到連接的產(chǎn)物的量是可變的并且似乎依賴于序列，因為他們觀察到具有連接的5’ G和3’ T的寡核苷酸在相同連接條件下顯著好于其具有5’ A和3’ C的互補(bǔ)寡核苷酸。因此，盡管噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶(由Prokaria，Matis和Prokazyme， Reyjkavik, Iceland 在 THERMOPHAGE RNA 連接酶 II 或 THERMOPHAGE ssDNA 連接酶的商標(biāo)名下銷售，以及由 EPICENTRE Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA 在商標(biāo)名 CIRCLIGASE ssDNA連接酶下銷售)是已知用于ssDNA分子的不依賴模板的分子內(nèi)連接的最有效的連接酶(基于本文討論的引證和本申請人及其同事的個人觀察)，在若干年中一個持久的直到現(xiàn)在都難以解決的問題是該酶對具有不同序列和大小的線性ssDNA分子的分子內(nèi)連接效率不同。因此，本發(fā)明申請人及其在EPICENTRE的同事以及其他研究人員像以上討論的Nimez等人觀察到具有線性ssDNA底物的寡脫氧核糖核苷酸的十分不同的分子內(nèi)連接水平，所述線性ssDNA底物的大小相同或非常相似，但具有甚至較小的核苷酸序列差異，或具有不同的大小，大小范圍在小于100個堿基到數(shù)千堿基的多核苷酸。例如， 在一些情況中，即使寡脫氧核糖核苷酸序列的單個核苷酸差異也能導(dǎo)致分子內(nèi)連接效率的大的差別。如果更高比例的不同線性ssDNA分子可以被分子內(nèi)連接并且它們可被連接到相同的相對程度，那么將獲得更好的實驗結(jié)果并且可以作出更好的結(jié)論。因此，自從發(fā)現(xiàn)噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶，本領(lǐng)域非常需要的是允許更高水平的線性ssDNA 分子被分子內(nèi)連接并且允全部的線性ssDNA分子在相同的相對程度上被分子內(nèi)連接而不考慮其對應(yīng)的核苷酸序列或大小的新的改進(jìn)的連接方法、連接反應(yīng)混合物和試劑盒。如果可以發(fā)現(xiàn)這種改進(jìn)的連接方法、連接反應(yīng)混合物和試劑盒，進(jìn)一步需要的是利用改進(jìn)的連接方法、連接反應(yīng)混合物和試劑盒作出如下改進(jìn)方法的新方法通過定量終點PCR或?qū)崟rPCR來擴(kuò)增用于基因表達(dá)分析的核酸分子方法，或通過與陣列或微陣列雜交或通過使用大規(guī)模DNA測序(即，所謂的“下一代” DNA測序)進(jìn)行相對基因表達(dá)分析的方法， 或由Polidoros等人(以上討論的)所述的RACE的方法，或通過Nunez等人(以上討論的)所述的RCA-WGA進(jìn)行的基因組DNA擴(kuò)增方法，或由Gunderson KL和Meemers，F(xiàn)以及由Drmanac等人(均在以上討論)所述的基因組DNA擴(kuò)增(包括基因座特異性擴(kuò)增) 和/或測序的方法，或利用ssDNA或得到的環(huán)狀ssDNA分子的分子內(nèi)連接的任何其他應(yīng)用的方法。例如，其中利用CIRCLIGASEtmssDNA連接酶的一些其他應(yīng)用和方法由Shroff， H 等人(Nano Letters 5 1509，2005 ；和 Biophysical Journal 94 :2179,2008) ；Lin, C 等人(Angewandte Chemie 118 :7699,2006) ；Korlach, J 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :1176,2008) ；McArthur，M 和 Bibb，MJ (Proc. Natl. Acad. ki. USA 105 :1020,2008)；禾口 Kuhn，H 和 Frank-Kamenetskii，MD (Nucleic Acids Res 36:e40，2008)提供。允許更高效的分子內(nèi)連接并且允許所有的ssDNA分子被分子內(nèi)連接至相同的相對程度的新的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物、改進(jìn)的連接反應(yīng)條件和方法被需要并且將對所有這些方法有益。簡而言之，需要的是允許使用熱穩(wěn)定的RNA連接酶諸如噬菌體TS2U6RNA連接酶對不同序列和大小的ssDNA分子的高水平和一致水平的分子內(nèi)連接的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和方法。本申請公開了解決這一長期存在的問題的新的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和方法，以及利用這些新的改進(jìn)的不依賴模板的分子內(nèi)連接反應(yīng)混合物和方法的新工藝。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方案是用于線性ssDNA分子的不依賴模板的分子內(nèi)連接的連接反應(yīng)混合物，該連接反應(yīng)混合物包括(a)具有5，-磷酰基和3，-羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子；(b)熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物，其中高比例的所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的并且其中在所述連接反應(yīng)混合物中腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的濃度等于或超過所述ssDNA分子的摩爾濃度；(c)將最終的pH保持在大約pH 6. 5至大約pH 8. 0之間的緩沖液；知(d)處于對熱穩(wěn)定的RNA連接酶最適的濃度的錳鹽，其中在所述連接反應(yīng)混合物中的Mn2+陽離子的終濃度在0. 5mM至大約IOmM ；其中，ATP在所述反應(yīng)緩沖液中不存在，或者以比所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶的非腺苷酸化形式的濃度小的摩爾濃度存在。在一些優(yōu)選的實施方案中，沒有向所述連接反應(yīng)混合物添加ATP。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述連接反應(yīng)混合物另外包括終濃度在0. 25M到2M的甜菜堿(兩性離子的三甲基甘氨酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述連接反應(yīng)混合物中的甜菜堿的濃度為大約1M。在一些優(yōu)選的實施方案中，沒有向所述連接反應(yīng)混合物添加Mg2+陽離子。本發(fā)明還包括使用所述改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物用于線性ssDNA分子的不依賴模板的分子內(nèi)連接來使用熱穩(wěn)定的RNA連接酶合成環(huán)狀ssDNA分子的方法。例如，一種方法包括1.制備連接反應(yīng)混合物，所述連接反應(yīng)混合物包括(a)具有5’-磷?；?’-羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子；(b)熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物，其中高比例的所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的并且其中在所述連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的濃度等于或超過所述ssDNA分子的摩爾濃度；(c)將最終的pH保持在大約pH 6. 5至大約pH 8. 0之間的緩沖液；和(d)處于對熱穩(wěn)定的RNA連接酶最適的濃度的錳鹽，其中在所述連接反應(yīng)混合物中的Mn2+陽離子的終濃度在0. 5mM至IOmM ；其中，ATP 在所述反應(yīng)緩沖液中不存在，或者以比所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶的非腺苷酸化形式的濃度小的摩爾濃度存在；和2.在大約40°C至大約70°C的反應(yīng)溫度孵育所述連接反應(yīng)混合物中的線性ssDNA 分子持續(xù)足夠的時間，其中合成了環(huán)狀ssDNA分子。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，沒有向所述連接反應(yīng)混合物添加ATP。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，所述連接反應(yīng)混合物另外包括終濃度在 0.25M到2M的甜菜堿(兩性離子的三甲基甘氨酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述連接反應(yīng)混合物中的甜菜堿的濃度為大約1M。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，沒有向所述連接反應(yīng)混合物添加Mg2+陽
1 子。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，所述不依賴模板的熱穩(wěn)定的RNA連接酶選自由以下組成的組棲熱菌屬(Thermus)噬菌體RNA連接酶；噬菌體TS2U6RNA連接酶；古細(xì)菌RNA連接酶；嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautorophicum)RNA連接酶1。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括1.制備連接反應(yīng)混合物，該連接反應(yīng)混合物包括(a)具有5，-磷?；?，-羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子；(b)噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶的組合物，其中彡60%的所述熱穩(wěn)定的 RNA連接酶分子為腺苷酸化的并且以如下的量存在其中在所述連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的RNA連接酶分子的摩爾濃度等于或超過所述線性ssDNA分子的摩爾濃度(例如，所述腺苷酸化的RNA連接酶分子大約IyM的濃度，所述線性ssDNA分子大約0. 5μΜ的濃度)； 加(c)緩沖劑(例如，在該連接反應(yīng)混合物中最終ρΗ為大約ρΗ7. 8的TRIS醋酸鹽)；(d)提供大約0. 5mM至IOmM終濃度的Mn2+陽離子的錳鹽(例如，終濃度大約2. 5mM 的Mn2+陽離子)；和2.在大約40°C到大約70°C的溫度(例如，大約55°C到大約65°C ；例如大約60°C ) 孵育該連接反應(yīng)混合物持續(xù)足夠的時間，其中從該線性ssDNA分子產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA分子。在該方法的一些優(yōu)選的實施方案中，所述連接反應(yīng)混合物另外包含終濃度在0. 25M到2M的甜菜堿(兩性離子的三甲基甘氨酸)。在任何上述方法的一些實施方案中，用于分子內(nèi)連接的具有5 ’ -磷?；? ’ -羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子包括線性ssDNA分子的群體，或由線性ssDNA分子的群體組成，其中5’端或3’端的核苷酸序列是未知的和/或其中該線性ssDNA分子大小不同。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，分子內(nèi)連接方法中使用的具有5’ -磷?；?，-羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子包括線性第一鏈cDNA分子的群體或由線性第一鏈cDNA 分子的群體組成，所述線性第一鏈cDNA分子是通過使用DNA聚合酶延伸與由生物樣品中的一個或多個靶核酸分子展示的互補(bǔ)序列退火的一個或多個第一鏈cDNA合成引物而產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實施方案中，通過延伸一個或多個第一鏈cDNA合成引物產(chǎn)生的所述線性第一鏈cDNA分子通過如下方式進(jìn)一步純化通過使用特異性消化所述靶核酸分子但不消化所述線性第一鏈cDNA分子的核酸酶除去所述靶核酸分子，或者通過將親和標(biāo)簽摻入所述線性第一鏈cDNA分子中并使用與所述親和標(biāo)簽形成特異性結(jié)合對的親和性結(jié)合物質(zhì)將所述線性第一鏈cDNA分子拉出，來從所述靶核酸分子中選擇性純化所述線性第一鏈cDNA分子，所述親和性結(jié)合物質(zhì)與表面相連。例如，在其中從生物樣品中的RNA分子產(chǎn)生用于該方法的線性第一鏈cDNA分子的方法的一些實施方案中，特異性消化所述靶核酸分子但不消化所述線性第一鏈cDNA分子的核酸酶選自RNA酶H以及RNA酶I和RNA酶III 二者的組合。在其中從生物樣品中的 DNA分子產(chǎn)生用于該方法的線性第一鏈cDNA分子的一些實施方案中，特異性消化所述靶核酸分子但不消化所述線性第一鏈cDNA分子的核酸酶是例如只特異性消化DNA靶核酸分子的單鏈特異性DNA酶。在包括將親和標(biāo)簽摻入線性第一鏈cDNA分子并且使用親和性結(jié)合物質(zhì)將引物延伸產(chǎn)物拉出的方法的一些實施方案中，該親和標(biāo)簽包括生物素部分(例如，與該第一鏈 cDNA分子中的一個或多個核苷酸連接的生物素部分)并且該親和性結(jié)合物質(zhì)包括與表面連接的鏈霉抗生物素蛋白。
在其中通過延伸一個或多個第一鏈cDNA合成引物制備用于分子內(nèi)連接的線性 ssDNA分子的方法的一些優(yōu)選的實施方案中，所述一個或多個第一鏈cDNA合成引物中的每一個包含包含如下標(biāo)簽或由如下標(biāo)簽組成的5’ -端部分，所述標(biāo)簽顯示基本上不與靶核酸分子中的序列互補(bǔ)的序列；和顯示與來自生物樣品的至少一個靶核酸分子所顯示的序列互補(bǔ)的序列的3’ -端部分；并且合成加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA分子。通過陳述“顯示與來自生物樣品的至少一個靶核酸分子所顯示的序列互補(bǔ)的序列的3’ -端部分”，我們在此表示該 3’_端與該靶核酸分子本身所顯示的序列或與連接至該生物樣品的靶核酸分子的3’-端的序列互補(bǔ)(例如使用體外核酸修飾反應(yīng)例如使用聚腺苷酸聚合酶添加到靶核酸分子的聚腺苷酸或其他同聚尾)。例如，在一些實施方案中，從生物樣品中的目標(biāo)核酸分子制備用于該方法的分子內(nèi)連接的線性ssDNA分子，其中所述目標(biāo)核酸分子已被修飾(例如，通過用聚核苷酸聚合酶對RNA的聚核苷酸加尾，或用末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶對DNA的加尾，或銜接子寡核苷酸與目標(biāo)DNA或RNA分子3’ -端的連接，或使用通過引用并入本文的美國專利申請第20050153333號或第20090227009號中公開的末端加標(biāo)簽方法添加3，-端序列到目標(biāo) DNA或RNA分子)。因此，該方法還包括在該方法中使用從已被修飾的生物樣品核酸制備的線性ssDNA分子。在其中所述一個或多個第一鏈cDNA合成引物包括5’ -端部分中的標(biāo)簽或由 5’ -端部分中的標(biāo)簽組成的一些優(yōu)選的實施方案中，該標(biāo)簽包括一個或多個標(biāo)簽域或者由一個或多個標(biāo)簽域組成，所述標(biāo)簽域選自由以下組成的組顯示正義啟動子序列的RNA聚合酶啟動子標(biāo)簽域；切割位點標(biāo)簽域；測序儀特異性測序標(biāo)簽域；捕獲標(biāo)簽域；擴(kuò)增標(biāo)簽域；檢測標(biāo)簽域；和地址標(biāo)簽域。第一鏈cDNA合成引物的5’ -端部分中的標(biāo)簽可包含任何期望的標(biāo)簽域并且可用于任何期望目的顯示任何期望的序列。例如，在一些實施方案中，該5’部分包含如下標(biāo)簽 所述標(biāo)簽包含顯示Roche 4FLX 54A和454B測序標(biāo)簽的序列的一個至多個測序標(biāo)簽域，并且在分離處于期望大小范圍內(nèi)的片段后，所述測序標(biāo)簽域用作利用Roche妨4基因組測序儀FLX系統(tǒng)的下一代的模板。類似地，在其他的實施方案中，5’和3’加標(biāo)簽的DNA片段， 在分離處于期望大小范圍內(nèi)的那些片段后，被用作使用另一測序平臺的下一代的模板(例如，使用 ROCHE 妨4 測序平臺、ILLUMINA SOLEXA 測序平臺、LIFE TECHNOLOGIES/APPLIED BI0SYSTEMS 的 SOLID 測序平臺、PACIFIC BIOSCIENCES 的 SMRT 測序平臺、P0LL0NAT0R Polony 測序平臺、COMPLETE GENOMICS 測序平臺、INTELLIGENT BI0SYSTEMS 的測序平臺、或 HELIC0S測序平臺)。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用這種方法從包括細(xì)胞或生物的全基因組的靶DNA中產(chǎn)生5，和3，加標(biāo)簽的DNA片段。在一些實施方案中，在5’端用親和性結(jié)合分子(例如，生物素)或用可檢測的分子(例如，熒光染料)對測序標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，所述親和性結(jié)合分子或可檢測的分子允許用該親和性結(jié)合分子或該可檢測的分子對具有標(biāo)簽的5’和3’加標(biāo)簽的DNA片段進(jìn)行捕獲(例如，使用鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的表面捕獲生物素化的分子)或檢測。在其中該第一鏈cDNA合成引物的5’端部分包括含不同標(biāo)簽域的標(biāo)簽或者由含不同標(biāo)簽域的標(biāo)簽組成的方法的一些優(yōu)選的實施方案中，一個或多個第一鏈cDNA合成引物各自包含在所述標(biāo)簽域之間的切割位點，并且該方法還包括如下步驟使該環(huán)狀第一鏈 cDNA分子在切割位點處線性化以獲得各自在5’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的3’端部分的序列和在3’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的5’端部分的序列的線性第一鏈cDNA 分子。例如，在一些實施方案中，切割位點包括一個或多個2'-脫氧尿苷一磷酸(dUMP) 部分或8-氧鳥嘌呤-2'-脫氧核糖基-一磷酸(8-氧-dGMP)部分或者由一個或多個 2'-脫氧尿苷一磷酸(dUMP)部分或8-氧鳥嘌呤-2'-脫氧核糖基-一磷酸(8-氧-dGMP) 部分組成，并且使環(huán)狀第一鏈cDNA分子在該切割位點處線性化以產(chǎn)生各自在5’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的3’端部分的序列和在3’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的5’ 端部分的序列的線性第一鏈cDNA分子的步驟包括使該環(huán)狀第一鏈cDNA分子分別與尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG ；EPICENTRE)或8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(Fpg ；EPICENTRE)接觸，產(chǎn)生包含一個或多個無堿基位點的環(huán)狀第一鏈cDNA分子，并隨后孵育該包含一個或多個無堿基位點的環(huán)狀第一鏈cDNA分子，所述孵育是在其中環(huán)狀第一鏈cDNA分子在該無堿基化位點處或在該無堿基化位點附近被線性化的條件下諸如通過在堿性溶液或在包含內(nèi)切核酸酶如內(nèi)切核酸酶IV的溶液中孵育而進(jìn)行。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，第一鏈cDNA合成引物包括在5’端部分中的標(biāo)簽或由在5’端部分中的標(biāo)簽組成，所述標(biāo)簽包括兩個測序儀特異性測序標(biāo)簽域或由兩個測序儀特異性測序標(biāo)簽域組成，并且使環(huán)狀第一鏈cDNA分子在該切割位點處線性化以產(chǎn)生各自在5’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的3’端部分的序列和在3’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的5’端部分的序列的線性第一鏈cDNA分子的步驟產(chǎn)生在5’端和3’ 端各具有一個測序標(biāo)簽域的線性ssDNA測序模板(例如，加雙標(biāo)簽的測序模板)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述在5’端和3’端各具有一個測序標(biāo)簽域的線性ssDNA測序模板用作針對所述測序標(biāo)簽域的下一代測序儀上測序的模板。在包括使環(huán)狀第一鏈cDNA分子在切割位點線性化的方法的一些優(yōu)選的實施方案中，所述第一鏈cDNA合成引物的5’端部分包括如下標(biāo)簽或由如下標(biāo)簽組成所述標(biāo)簽包含顯示正義啟動子序列的RNA聚合酶啟動子標(biāo)簽域和位于該正義啟動子序列3’的切割位點， 并且在使該環(huán)狀第一鏈cDNA分子在該切割位點線性化的步驟后，該方法還包括如下子步驟(i)使顯示反義啟動子序列的寡脫氧核糖核苷酸與從所述線性化產(chǎn)生的每個線性第一鏈cDNA分子3’端的正義啟動子序列退火以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄底物；并隨后(ii)使用結(jié)合雙鏈RNA 聚合酶啟動子并由此啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄該轉(zhuǎn)錄底物。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，在轉(zhuǎn)錄該轉(zhuǎn)錄底物的子步驟之前，所述方法還包括通過使用DNA聚合酶延伸顯示反義啟動子序列的所述寡脫氧核糖核苷酸產(chǎn)生雙鏈cDNA的子步驟。附圖簡述下面的圖形成本說明書的一部分并且被包括來進(jìn)一步展示本發(fā)明的某些方面。通過結(jié)合本文提供的具體實施方案的詳述參考這些圖中的一個或多個，可以更好地理解本發(fā)明。圖1顯示從噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶(也稱為CIRCLIGASE ssDNA連接酶，EPICENTRE)的新克隆獲得的純化蛋白的SDS-PAGE凝膠，相比于從舊克隆獲得的 TS2U6RNA連接酶的純化制備物中的腺苷酸化的酶的水平(估計約30% )，該新克隆顯示預(yù)想不到的高水平的TS2U6RNA連接酶的腺苷酸化形式(估計約70% )。蛋白樣品被變性、還原并且被10% SDS-PAGE分辨。蛋白通過銀染色顯影。泳道1顯示分子量標(biāo)準(zhǔn)品(97、66、45、30、20. 1、14. 4kDa)。泳道2顯示CIRCLIGASE?？招娜侵甘鞠佘账峄拿?。實心三角指示非腺苷酸化的酶。圖2顯示使用所比較的新克隆獲得的高腺苷酸化的TS2U6RNA連接酶(也稱為 CIRCLIGASE ssDNA連接酶)和使用舊克隆獲得的低腺苷酸化的酶的分子內(nèi)連接活性的 PAGE分析。預(yù)想不到地，高腺苷酸化的酶在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中的線性ssDNA的分子內(nèi)連接上的活性比低腺苷酸化的酶小得多。1 μ g的每種CIRCLIGASE酶用于在如下標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件下連接與CIRCLIGASE ssDNA連接酶(EPICENTRE) —起供應(yīng)的10皮摩爾55-核苷酸的對照寡核苷酸(50mM MOPS pH 7. 5, IOmM KCl,5mM MgCl2，ImM DTT,2. 5mM MnCl2, 禾口 50 μ M ATP在60°C持續(xù)1小時)。通過添加終止/上樣緩沖液(95%甲酰胺，IOmM EDTA, 0. 01%二甲苯藍(lán)，0.01%溴酚藍(lán))并且在70°C加熱5min終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝膠中分辨并且通過SYBR 金染色來顯影。泳道1，LMW DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品(核苷酸)(97、77、50、40、35、30、25、20、15)；泳道 2，無 CIRCLIGASE 陰性對照；泳道 3，來自舊克隆的CIRCLIGASE ；泳道4，來自新克隆的CIRCLIGASE (第1批次)；泳道5，來自新克隆的CIRCLIGASE (第2批次)；以及泳道6，LMW DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖3顯示在連接反應(yīng)混合物中存在和不存在ATP的情況下高腺苷酸化的 TS2126RNA連接酶(CIRCLIGASE )的分子內(nèi)連接活性的PAGE分析。出人意料地，當(dāng)ATP沒有用在連接反應(yīng)混合物中時高腺苷酸化的酶的活性大得多。外切核酸酶I (Exo I)消化線性ssDNA但不消化環(huán)狀ssDNA。在60°C孵育1小時后，終止反應(yīng)，并且根據(jù)指示，將反應(yīng)與 20U的外切核酸酶I在37°C孵育15min。通過添加終止/上樣緩沖液并且在70°C加熱5min 終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在含8M尿素的20% PAGE凝膠中分辨并且用SYBR 金染色。泳道1， LMW DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品(97、77、50、40、35、30、25、20、15個核苷酸)；泳道2_3，無酶對照；泳道 4-5，具有50 μ M ATP的高腺苷酸化的CIRCLIGASEssDNA連接酶；泳道6_7，沒有ATP的高腺苷酸化的CIRCLIGASEssDNA連接酶；泳道8，LMW DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖4是顯示來自新克隆的高腺苷酸化的TS2U6RNA連接酶(CIRCLIGASE )在連接反應(yīng)混合物中存在和不存在ATP的情況下對多種線性ssDNA底物的分子內(nèi)連接活性相比于來自舊克隆的低腺苷酸化的酶在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中對相同線性ssDNA底物的分子內(nèi)連接活性的PAGE分析結(jié)果的表。這些結(jié)果顯示，在連接反應(yīng)混合物中不存在ATP的情況下，高腺苷酸化的TS2U6RNA連接酶有效地環(huán)化許多不被標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中的低腺苷酸化的酶連接或被其低效連接的線性ssDNA底物。用高腺苷酸化的酶產(chǎn)生的這些改進(jìn)的分子內(nèi)連接結(jié)果顯示之前分子內(nèi)連接較差或根本不能連接的某些底物可被連接，這鼓勵申請人繼續(xù)測試另外的連接反應(yīng)條件以便更進(jìn)一步改進(jìn)結(jié)果。圖5顯示在連接反應(yīng)混合物中使用Mn2+陽離子改進(jìn)高腺苷酸化的TS2U6RNA連接酶(CIRCLIGASE )在不存在ATP的情況下對非常難以連接的線性ssDNA底物的分子內(nèi)連接活性。注意，當(dāng)添加Mn2+陽離子時，用于標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中的Mg2+陽離子沒有添加到連接反應(yīng)混合物中。1 μ g的高腺苷酸化的CIRCLIGASETMssDNA連接酶與10皮摩爾線性 pYRTP. 5ssDNA 底物在 33mM Tris 醋酸鹽 pH 7. 6、66mM K0Ac、0. 5mMDTT 和 0、1、2、5 或 IOmM 皿11(12或1%((^(3)2中在60°C下孵育1小時。然后，用18U的外切核酸酶I和20U的外切核酸酶III處理一部分連接反應(yīng)混合物以降解未連接的線性底物。環(huán)狀ssDNA連接產(chǎn)物在含 8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝膠中分辨并且通過SYBR 金染色來顯影。通過目視檢查估計耐外切核酸酶的環(huán)狀ssDNA連接產(chǎn)物的量。圖6顯示在將IM兩性離子的三甲基甘氨酸(甜菜堿)加入至包含Mn2+陽離子 (為2. 5mM MnCl2)但沒有ATP和添加的Mg2+陽離子的連接反應(yīng)混合物時，高腺苷酸化的 TS2U6RNA連接酶(CIRCLIGASE )在環(huán)化非常難以連接的線性ssDNA底物上的分子內(nèi)連接活性的PAGE分析。出人意料且預(yù)想不到的是，甜菜堿添加至連接反應(yīng)混合物導(dǎo)致這種非常難以連接的線性ssDNA底物的近似100%的環(huán)化，相比之下，在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中的低腺苷酸化的酶對這種底物產(chǎn)生彡5%的環(huán)化。1 μ g的高腺苷酸化的CIRCLIGASETMssDNA連接酶與10皮摩爾線性pYRTP. 5ssDNA底物在33mM Tris醋酸鹽pH 7. 6、66mM KOAc,0. 5mM DTT和2. 5mMMnC12中在有或沒有IM甜菜堿的情況下在60°C下孵育16小時。然后，用18U 的外切核酸酶I和20U的外切核酸酶III處理一部分連接反應(yīng)混合物以降解未連接的線性底物(泳道1和泳道4)。環(huán)狀ssDNA連接產(chǎn)物在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝膠中分辨并且通過SYBR 金染色來顯影。通過目視檢查估計耐外切核酸酶的環(huán)狀ssDNA連接產(chǎn)物的量。泳道1-2，無酶陰性對照；泳道3-4，加IM甜菜堿；泳道5，LMW DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品。圖7顯示在含有IM甜菜堿的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中，高腺苷酸化的TS2U6RNA 連接酶(CIRCLIGASE )在環(huán)化Alu I消化的小牛胸腺ssDNA片段上的分子內(nèi)連接活性的 PAGE分析。該結(jié)果指示，對于高達(dá)約6000個核苷酸的線性ssDNA片段，似乎不存在基于大小或序列組成的總底物偏倚。200ng變性Alu I消化的小牛胸腺DNA在由33mM Tris醋酸鹽 pH 7. 6、66mM K0Ac、0. 5mM DTT、2. 5mM MnC12、IM 甜菜堿和 1 μ g、2 μ g 或 4 μ g 的高腺苷酸化的CIRCLIGASETMssDNA連接酶組成的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中在60°C下16小時并且用18U的外切核酸酶I和20U的外切核酸酶III處理以降解線性ssDNA底物。反應(yīng)產(chǎn)物在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝膠中分辨并且通過SYBR 金染色來顯影。泳道1，LMWDNA 大小標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2-3，無CIRCLIGASE陰性對照；泳道4-5,1 μ gCIRCLIGASE ；泳道6-7,2 μ g CIRCLIGASE ；泳道8_9，4 μ g CIRCLIGASE ；泳道10，Kb階梯DNA大小標(biāo)準(zhǔn)。外切核酸酶被添加至泳道3、5、7和9。應(yīng)注意，CIRCLIGASE預(yù)期在不存在ATP的情況下以化學(xué)計算的方式起作用；因此，200ng輸入量的變性斷裂的ssDNA中只有10%被環(huán)化并不奇怪。定義除非在本文別處具體限定或不同地描述，否則以下與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語和描述應(yīng)按照下面給出的來理解。當(dāng)本文使用術(shù)語“例如”、“如”、“諸如”、“包括”、“包含”或其變體時，這些術(shù)語將不被認(rèn)為是限制性術(shù)語，而將被解釋為表示“但不限于”或“不限于”。除非本文另外指明或根據(jù)上下文明顯矛盾，否則術(shù)語“一個”和“一種”以及“該” 和類似指稱物在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在權(quán)利要求的上下文中)使用應(yīng)被解釋成涵
蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。本文的“親和性結(jié)合物質(zhì)”或“親和性結(jié)合分子”或“親和性分子”或“親和標(biāo)簽” 表示對于彼此具有親和力并且在稱為“結(jié)合條件”的某些條件下彼此“結(jié)合”形成“特異性結(jié)合對”的分子。例如，生物素和鏈霉抗生物素蛋白，生物素和抗生物素蛋白，或者洋地黃毒苷和結(jié)合洋地黃毒苷的特異性抗體是“特異性結(jié)合對”的實例，其中每個特異性結(jié)合對的成員包括“親和性結(jié)合分子”或“親和性結(jié)合物質(zhì)”或“親和性分子”。可使用本領(lǐng)域已知的方法將親和性結(jié)合分子(例如，生物素和/或鏈霉抗生物素蛋白)與其他分子(例如，與RNA或DNA)或與固體表面共價地連接或軛合，或非共價地結(jié)合(例如，使用D. Savage等人，Pierce Chemical Company, 1992 的 Avidin-Biotin Chemistry A Handbook(抗生物素蛋白-生物素化學(xué)手冊)和在 R. P. Hoagland，Molecular Probes, Inc.的 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (熒光探針和研究產(chǎn)物手冊)，第九版，以及在 Academic Press, Inc.，San Diego, CA, 1996 出版的 Greg Τ. Hermanson 的 BIOCONJUGATE Techniques (生物軛合技術(shù))中所述的試劑和方法)。與DNA或RNA軛合的親和性分子也可以使用寡核苷酸合成儀使用本領(lǐng)域中已知的試劑和方法來合成。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“結(jié)合”表示由于非共價鍵造成的親和性分子和親和性結(jié)合物質(zhì)之間的相互作用，所述非共價鍵諸如但不限于氫鍵、疏水相互作用、范德華鍵和離子鍵。 不希望受理論限制，在本領(lǐng)域中相信這些種類的非共價鍵導(dǎo)致結(jié)合，部分上是由于特異性結(jié)合對中包含的分子的互補(bǔ)形狀或結(jié)構(gòu)?；凇敖Y(jié)合”的定義和種類繁多的親和性結(jié)合分子或特異性結(jié)合對，很顯然結(jié)合條件對于不同的特異性結(jié)合對是不同的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地發(fā)現(xiàn)或確定樣品中在親和性結(jié)合分子之間發(fā)生結(jié)合所憑借的條件。具體而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定可使本領(lǐng)域中被認(rèn)為是“特異性結(jié)合”的親和性結(jié)合分子之間的結(jié)合發(fā)生所憑借的條件。如本領(lǐng)域中所了解的，這種特異性通常是由于在親和性結(jié)合分子之間的親和性比對樣品中的其他物質(zhì)和組分(例如，容器壁、固體支持體)的親和性高。 在某些情況下，特異性還可能包括或可能由于，親和性結(jié)合分子的締合比與樣品中的其他物質(zhì)或組分的締合顯著更快。本文的術(shù)語“擴(kuò)增核酸”表示增加核酸序列或其互補(bǔ)序列的拷貝數(shù)。擴(kuò)增的核酸可以是包含DNA或RNA或DNA和RNA的混合物、由DNA或RNA或DNA和RNA的混合物組成的、或者衍生自DNA或RNA或DNA和RNA的混合物的DNA，包括修飾的DNA和/或RNA。從一種或多種核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物(即“擴(kuò)增產(chǎn)物”)可以是DNA或RNA，DNA和RNA核苷或核苷酸的混合物，而不論起始核酸是DNA、RNA或是DNA和RNA 二者，或者這些產(chǎn)物可以包括修飾的DNA或RNA核苷或核苷酸?！翱截悺辈灰欢ū硎緦Π行蛄械耐昝佬蛄谢パa(bǔ)性或同一性。例如，拷貝可包括核苷酸類似物諸如脫氧肌苷或脫氧尿苷，有意的序列變更(諸如通過包含可與靶序列雜交但不互補(bǔ)的序列的引物和/或擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的序列錯誤引入的序列變更。如本文所用，在提到核酸或核酸反應(yīng)時使用的術(shù)語“擴(kuò)增，，或“擴(kuò)增的”、“擴(kuò)增了，， 是指制備特定核酸諸如靶核酸或例如按照本發(fā)明的實施方案產(chǎn)生的加標(biāo)簽的核酸的拷貝的體外方法。擴(kuò)增核酸的許多方法是本領(lǐng)域已知的，并且擴(kuò)增反應(yīng)包括聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法諸如NASBA(例如，美國專利第5，409，818號)、環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法(例如，使用成環(huán)序列的“LAMP”擴(kuò)增，例如，在美國專利第6，410，278號中所述)。術(shù)語“使退火”或“使雜交”以及“退火”或“雜交”是指具有經(jīng)由沃森-克里克堿基配對形成復(fù)合物的充分互補(bǔ)性的核苷酸序列之間形成復(fù)合物。就本發(fā)明來說，彼此之間 “對其互補(bǔ)”或“與之互補(bǔ)”或與其“雜交”或“退火”的核酸序列應(yīng)該能形成或形成服務(wù)于預(yù)定目的的足夠穩(wěn)定的“雜交體”或“復(fù)合物”。雜交或退火以及雜交強(qiáng)度(即，核酸鏈之間的締合強(qiáng)度)受本領(lǐng)域中公知的許多因素影響，包括在核酸之間的互補(bǔ)性程度，受諸如鹽濃度影響的所涉及的條件的嚴(yán)格度，形成的雜交體的Tm (解鏈溫度)，其他組分的存在(例如，存在或不存在聚乙二醇或甜菜堿)，雜交鏈的摩爾濃度以及核酸鏈的G:C含量。在一些實施方案中，“cDNA”或“cDNA分子”是指使用感興趣的RNA分子的至少一部分作為模板通過RNA依賴性DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶催化的與該感興趣的一種或多種RNA 分子退火的引物的延伸而合成的“互補(bǔ)的DNA”’(該過程也稱為“反轉(zhuǎn)錄”)。在所述方法的一些優(yōu)選的實施方案中，通過使用反轉(zhuǎn)錄酶和從生物樣品獲得作為模板的感興趣的RNA分子諸如信使RNA(mRNA)分子的反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA分子，并且該第一鏈cDNA分子與該 mRNA互補(bǔ)。在一些實施方案中，“第一鏈cDNA分子”是指通過任何感興趣的RNA分子的反轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA分子，即使該感興趣的RNA分子不是mRNA。在一些實施方案中，使用術(shù)語“第一鏈cDNA合成引物”和“第一鏈cDNA分子”，即使沒有使用第二鏈cDNA合成引物并且沒有合成第二鏈cDNA分子；因此即使在所述方法導(dǎo)致只合成與所述感興趣的RNA分子互補(bǔ)的單鏈cDNA時也使用術(shù)語“第一鏈cDNA”或“第一鏈cDNA分子”。更進(jìn)一步，在一些實施方案中，本文的術(shù)語“cDNA”是指使用感興趣的DNA分子的至少一部分作為模板通過DNA 聚合酶催化的與一種或多種該感興趣的DNA分子退火的引物的延伸而合成的互補(bǔ)DNA。所合成的cDNA分子與該模板的至少一部分“同源”或“堿基配對”或“形成復(fù)合物”。如本文所用，“DNA聚合酶”是指催化脫氧核糖核苷酸聚合成DNA鏈的酶?！耙蕾?DNA的DNA聚合酶”是通過延伸與DNA模板退火的引物來合成互補(bǔ)的DNA( “cDNA”)拷貝的酶。一些依賴DNA的DNA聚合酶還可以從RNA模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝，這一過程也稱為 “反轉(zhuǎn)錄”?？煞崔D(zhuǎn)錄的DNA聚合酶也可以稱為“反轉(zhuǎn)錄酶”。除了合成DNA聚合物外，DNA聚合酶可包括其他特征或活性。例如，DNA聚合酶可具有或缺乏5’到3’外切核酸酶活性(也稱為5’外切核酸酶或5’核酸酶活性)，3’到5’ 外切核酸酶活性，鏈置換活性，并且可以就它們持續(xù)(processive)的程度對其進(jìn)行表征。 在一些實施方案中，使用缺乏5’到3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。例如，在一些實施方案中，缺乏5’到3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶組合物用于DNA測序。例如，在一些其他實施方案中，缺乏5’到3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶組合物用于全基因組擴(kuò)增。一些DNA聚合酶能夠?qū)⑴c模板鏈互補(bǔ)的鏈置換為由該聚合酶合成的新DNA鏈。這一過程稱為“鏈置換”并且具有這種活性的DNA聚合酶在本文稱為“鏈置換DNA聚合酶”。 用于鏈置換DNA合成的模板可以是線性或環(huán)狀的單鏈DNA(ssDNA)或雙鏈DNA(dsDNA)。如果DNA模板是單鏈環(huán)，那么引發(fā)的DNA合成繞該環(huán)一圈又一圈進(jìn)行，鏈的連續(xù)置換早于復(fù)制鏈，這一過程稱為“滾環(huán)復(fù)制”。滾環(huán)復(fù)制導(dǎo)致環(huán)狀模板的串聯(lián)拷貝的合成。一般來說， 優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的方法的DNA模板特異性DNA聚合酶有效率地合成具有適合長度的 DNA用于預(yù)定目的而不從模板上“脫落”(或終止DNA的合成)，這稱為酶的持續(xù)合成能力 (processivity)。DNA聚合酶的鏈置換能力可使用該聚合酶在由Fire和Xu(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4641-4645,1995)所述的滾換復(fù)制測定中容易地確定。鏈置換和DNA聚合酶持續(xù)合成能力還可以使用Kong等人(J. Biol. Chem. 268 1965-1975，1993)描述的方法來測定?？墒褂玫逆溨脫QDNA聚合酶的實例包括但不限于R印1 iPHI phi29DNA聚合酶、 DisplaceAce DNA 聚合酶、rGka DNA 聚合酶、kquiThermTMDNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、 Tfl DNA 聚合酶、和 MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(全部可從 EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA獲得)。在一些實施方案中，缺乏3’到5’外切核酸酶校正活性的DNA聚合酶與具有這種活性的DNA聚合酶諸如FAILSAFE DNA聚合酶的摻合物用作鏈置換DNA聚合酶。酶摻合物在一些實施方案中是有用的，因為它在DNA合成過程中顯示改善的保真度(S卩，它合成具有較少的不與模板互補(bǔ)的核苷酸的DNA)。許多DNA聚合酶在特定條件下的保真度和/或錯誤率是已知的，測量保真度的方法(例如，通過測序)也是已知的?！銇碚f，在本發(fā)明的鏈置換擴(kuò)增方法中期望該方法中使用的鏈置換DNA聚合酶的量盡可能高但不抑制或不利地影響反應(yīng)。例如，REPLIPHI phi29DNA聚合酶(EPICENTRE) 在20微升反應(yīng)中能夠以大約一微克蛋白使用，并且DISPLACE DNA聚合酶(EPICENTRE)在 50微升反應(yīng)中能夠以大約50單位到大約300單位使用。因為單位的定義對于不同的DNA 聚合酶以及甚至對于不同賣家或來源的相似DNA聚合酶來說都是不同的，并且還因為每種酶的活性在不同的溫度以及在不同的反應(yīng)條件下是不同的，所以期望針對使用的每種DNA 模板和引物優(yōu)化鏈置換DNA聚合酶的量以及反應(yīng)條件。“核酸”或“多核苷酸”表示包含一系列也稱為“核苷”的“單核苷”的聚合物分子， 其中一個核苷的戊糖的3’位置通過核苷間連接諸如但不限于磷酸二酯鍵與下一個核苷的戊糖的5’位置相連接。與磷酸基團(tuán)相連接的核苷稱為“核苷酸”。與該系列中的下一個核苷酸的5’位置連接的核苷酸稱為“5’的”或“5’核苷酸”，而與該5’核苷酸的3’位置連接的核苷酸稱為“3’的”或“3’核苷酸”。如本文所用，術(shù)語“5’ -”和“3’ -”是指在核酸單鏈內(nèi)特定的化學(xué)基團(tuán)、核苷酸、核苷酸的序列或遺傳元件(例如，RNA聚合酶啟動子序列)相對于另一個化學(xué)基團(tuán)、核苷酸、核苷酸的序列或遺傳元件的位置或方向。如果在一條鏈上第一核酸序列在第二序列的3’ _，那么在互補(bǔ)鏈上該第一序列的互補(bǔ)序列將在該第二序列的互補(bǔ)序列的5’。本發(fā)明的描述將根據(jù)特定的核酸鏈內(nèi)序列或遺傳元件的相對5’或3’位置和方向來理解。稱線性核酸分子具有“5’ -末端”(5’ -端)和“3’ -末端”(3’ -端)，因為核酸的磷酸二酯連接在取代的單核苷酸的糖部分的5’碳和3’碳處出現(xiàn)。將與5’碳連接的新連接之處的多核苷酸的末端是其5’末端核苷酸。將與3’碳連接的新連接之處的多核苷酸的末端是其3’末端核苷酸。如本文所用的末端核苷酸是在3’末端或5’末端的端位置的核苷酸。核酸的戊糖可以是核糖，在這種情況下，核酸或多核苷酸被稱為“RNA”，或者核酸的戊糖可以是2'-脫氧核糖，在這種情況下，核酸或多核苷酸被稱為“DNA”。可選地，特別是如果核酸以化學(xué)方式合成，那么核酸可由DNA單核苷酸和RNA單核苷酸組成。在RNA和 DNA中，每種戊糖被共價地連接至四種常見的或“規(guī)范的”核酸堿基(每種也稱為“堿基”) 之一。與糖連接的主要的天然存在的堿基中的三種(腺嘌呤、胞苷和鳥嘌呤)對于DNA和 RNA是共同的，而一種堿基是不同的；DNA具有額外的堿基胸腺嘧啶，而RNA具有額外的堿基尿苷。在一些情況下，尿苷可作為DNA中的堿基存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常將小的多核苷酸看作“寡核苷酸”。將如本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”定義為包含兩個或更多個脫氧核糖核苷酸(在這種情況下，可將其稱為“寡脫氧核糖核苷酸”)或核糖核苷酸、優(yōu)選大約6到 100個核苷酸的分子，但是對寡核苷酸的長度沒有確定的限制。確切大小取決于許多因素， 而這些因素又取決于寡核苷酸的最終功能或用途。同樣，出于多種原因，本發(fā)明的核酸或多核苷酸可包括一種或多種修飾的核酸堿基、糖部分或核苷間連接。作為例子，使用包含修飾的堿基、糖部分或核苷間連接的核酸或多核苷酸的一些原因包括=(I)Tm的改變；( 改變多核苷酸對一種或多種核酸酶的敏感性；(3)提供切割位點，諸如被尿嘧啶-N-糖基化酶加堿性條件或內(nèi)切核酸酶例如內(nèi)切核酸酶IV切割的dUMP殘基，或諸如被8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(也稱為fapy-DNA糖基化酶或Fpg)加堿性條件或內(nèi)切核酸酶例如內(nèi)切核酸酶IV切割的8-氧-dGMP殘基；(4)提供用于連接標(biāo)記或親和標(biāo)簽的部分；(5)提供標(biāo)記或標(biāo)記猝滅劑；或(6)提供諸如生物素的部分作為用于連接溶液中或結(jié)合于表面的另一種分子的標(biāo)簽。就本發(fā)明的核酸或多核苷酸來說，糖部分中的一個或多個可包括2'-脫氧核糖， 或者可選地，糖部分中的一個或多個可以是某種其他糖部分，諸如但不限于提供對一些核酸酶的抵抗力的核糖或2'-氟代-2'-脫氧核糖或2' -0-甲基-核糖，或可通過與可見的、熒光的、紅外熒光的或其他可檢測的染料或具有親電子的、光反應(yīng)性的、炔基或其他反應(yīng)性化學(xué)部分的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)而標(biāo)記的2'-氨基2'-脫氧核糖或2'-疊氮基-2'-脫氧核糖。本發(fā)明的核酸或多核苷酸的核苷間連接可以是磷酸二酯鍵連接，或者可選地，核苷間連接中的一種或多種可包括修飾的連接，諸如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、或二硒代磷酸酯(phosphorodiselenate)連接，它們對一些核酸酶具有抵抗力。當(dāng)提及顯示“隨機(jī)序列”的寡核苷酸或寡核苷酸的部分時，我們表示，對于該隨機(jī)序列部分內(nèi)的每個核苷酸位置而言，使用等量的所有四種規(guī)范的核苷酸堿基(A、G、C以及T 或U)合成(例如，使用寡核苷酸合成儀)該寡核苷酸或其部分。這種方法導(dǎo)致包含0的 η次方)+1種不同寡核苷酸的寡核苷酸混合物的合成，其中“η”等于隨機(jī)序列部分內(nèi)的核苷酸位置的數(shù)目。因此，在這些實施方案中，寡核苷酸包括代表隨機(jī)序列部分的所有可能序列的許多不同寡核苷酸的混合物。當(dāng)提及顯示“半隨機(jī)序列”的寡核苷酸或寡核苷酸的部分時，我們表示合成半隨機(jī)寡核苷酸或部分(例如，使用寡核苷酸合成儀)，其中使用等量的所有四種規(guī)范的核苷酸堿基(A、G、C以及T或U)合成一些核苷酸位置(即那些位置如以上所述是“隨機(jī)的”)，但是只使用規(guī)范的堿基核苷酸(即Α、C、G以及T或U)中的一種、 兩種或三種而不是所有四種來合成半隨機(jī)部分內(nèi)的一個或多個其他位置。在一些實施方案中，寡核苷酸包括具有“簡并堿基”的一個或多個核苷酸，用“簡并堿基”我們表示能夠與除根據(jù)A與T或U配對和G與C配對的標(biāo)準(zhǔn)堿基配對法則之外的一種或多種核酸堿基進(jìn)行堿基配對的核酸堿基，并且“簡并核苷酸”是包含簡并堿基的核苷酸。本文可互換使用的多核苷酸或寡核苷酸(包括引物)的“部分”或“區(qū)域”是2個堿基或更多個堿基的連續(xù)序列。 在其他實施方案中，區(qū)域或部分為至少約1個、2個、3個、5個、10個、15個、20個、25個、50 個、75個或甚至更多連續(xù)的核苷酸中的任何一種。如果隨機(jī)或半隨機(jī)序列包括寡核苷酸中的所有核苷酸，它可以分別被稱為“隨機(jī)寡核苷酸”或“半隨機(jī)寡核苷酸”?！耙铩笔强梢员缓怂峋酆厦秆由斓囊话憔哂杏坞x的3’ -OH基團(tuán)的寡核苷酸 (“oligo”)。對于依賴模板的聚合酶而言，一般至少引物寡核苷酸的3’部分與模板核酸的部分互補(bǔ)，該寡核苷酸通過氫鍵合和其他分子力與模板“結(jié)合”(或“復(fù)合”、“退火”或“雜交”)以給出引物/模板復(fù)合物用于啟動DNA聚合酶進(jìn)行的合成，并且通過添加與DNA合成過程中的模板互補(bǔ)的在3’端連接的共價鍵合的堿基延伸引物(即，“引物延伸的”)。結(jié)果是引物延伸產(chǎn)物。依賴模板的DNA聚合酶(包括反轉(zhuǎn)錄酶)一般需要寡核苷酸引物與單鏈模板的復(fù)合以啟動DNA合成(“引發(fā)”)，但對于與DNA模板互補(bǔ)的RNA的合成(轉(zhuǎn)錄)，RNA 聚合酶一般不需要引物。本文的“熱穩(wěn)定的RNA連接酶”表示多肽，其中所述多肽的腺苷酸化形式在大約 40°C至大約70°C的反應(yīng)溫度在反應(yīng)混合物中催化具有5’ -磷酰基和3’ -羥基基團(tuán)的線性 ssDNA分子不依賴模板地環(huán)化成環(huán)狀ssDNA分子，所述反應(yīng)混合物包括將pH保持在大約pH 6. 5到pH 8之間的pH的緩沖液，濃度在大約0. 5mM到IOmM的Mn2+陽離子，并且其中ATP在反應(yīng)緩沖液中不存在或者以小于所述多肽的非腺苷酸化形式濃度的摩爾濃度存在。本發(fā)明優(yōu)選的熱穩(wěn)定的RNA連接酶是由通過引用并入的美國專利第7，303，901號的權(quán)利要求所描述和涵蓋的噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶。然而，熱穩(wěn)定的RNA連接酶可包括在連接反應(yīng)混合物中并且在本文所述的反應(yīng)條件下從線性ssDNA分子合成環(huán)狀ssDNA分子中有活性的任何RNA連接酶。熱穩(wěn)定的RNA連接酶可來自天然蛋白或重組蛋白。術(shù)語“天然蛋白”在本文用來指從天然存在(即，非重組)的來源分離的蛋白。如本文所用的術(shù)語“重組蛋白”或“重組多肽”是指從重組DNA分子表達(dá)的蛋白分子。分子生物學(xué)技術(shù)可用于產(chǎn)生具有與蛋白的天然形式相同或相似特性的蛋白的重組形式。還可以制備天然序列的變體以例如改進(jìn)多肽的表達(dá)、純化或其他期望的特性。為重組蛋白的熱穩(wěn)定的RNA連接酶可以是融合蛋白。如本文所用，術(shù)語“融合蛋白”是指包含與外源蛋白片段(例如，包含非TS2U6RNA連接酶蛋白的融合配偶體)連接的目標(biāo)蛋白(例如，TS2U6RNA連接酶或其片段)的嵌合蛋白。融合配偶體可增強(qiáng)表達(dá)在宿主細(xì)胞中的熱穩(wěn)定的RNA連接酶蛋白的可溶性，可提供允許重組融合蛋白從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)上清液純化的親和標(biāo)簽，或二者皆可。如果期望，可通過本領(lǐng)域已知的各種酶促或化學(xué)手段將融合蛋白從目標(biāo)蛋白(例如，TS2126RNA連接酶或其片段)中除去。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，熱穩(wěn)定的RNA連接酶組合物包含純化的蛋白。如本文所用，術(shù)語“純化的”或“以純化”表示從目標(biāo)組分如蛋白除去某種污染物的任何過程的結(jié)果。例如，通過除去其他污染的不期望蛋白、核酸、糖類、脂質(zhì)和/或小生化分子來純化特定的期望蛋白(例如，TS2126RNA連接酶)。污染物的去除導(dǎo)致期望蛋白占組合物的百分比提高。例如，在優(yōu)選的實施方案中，純化熱穩(wěn)定的RNA連接酶組合物以使其不含污染的核酸和對核酸具有活性的酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，通過在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)?；蚱渌d體中表達(dá)熱穩(wěn)定的RNA連接酶基因(和/或其功能變體及同源物)來獲得熱穩(wěn)定的RNA連接酶，因為從這種重組來源獲得的熱穩(wěn)定的RNA連接酶具有較高純度、不含污染的酶的活性， 并且一般比從非重組來源獲得的酶濃度更高。如本文所用的術(shù)語“基因”是指包含對于生成編碼多肽或蛋白前體(例如，TS2U6RNA連接酶)必要的控制序列和編碼序列的DNA序列。多肽可以由全長編碼序列或由該編碼序列的任何部分編碼，只要保留期望的蛋白活性。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，稱熱穩(wěn)定的RNA連接酶是“穩(wěn)定的”，我們表示該熱穩(wěn)定的RNA連接酶是足夠純的蛋白酶并且不含有助于降解和酶活性的喪失的其他污染物， 并且被提供在-20°C儲存至少6個月沒有顯著的活性喪失的酶儲存緩沖液的制品中。用于提供穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的RNA連接酶(例如，TS2U6RNA連接酶)的一種適宜的酶儲存緩沖液包括含 50mM Tris-HCKpH 7. 5) UOOmM NaClUOOmM EDTAUmM DTTiPO. 的非離子去污劑Triton X-100的50%甘油溶液。除非另外指明，否則如本文所用的術(shù)語“熱穩(wěn)定的RNA 連接酶”可以指蛋白或基因的變體。此外，熱穩(wěn)定的RNA連接酶的變體形式也被考慮為等同于本文詳細(xì)列出的那些肽和DNA分子。例如，預(yù)期獨立地用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、 用絲氨酸取代蘇氨酸、或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸類似地取代氨基酸(即，保守突變)將不會對得到的分子的生物活性具有重大影響。據(jù)此，本發(fā)明的一些實施方案提供包含保守取代的熱穩(wěn)定的RNA連接酶(例如，TS2U6RNA連接酶)的變體。保守取代是發(fā)生在與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的取代。基因編碼的氨基酸可被分成四個家族(1)酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；( 堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；C3)非極性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不帶電的極性氨基酸 (甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時被聯(lián)合地歸為芳香族氨基酸。以類似方式，所有氨基酸可被分組為(1)酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；( 堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；C3)脂肪族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)，其中絲氨酸和蘇氨酸任選被分別歸為脂肪族-羥基氨基酸；(4)芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；( 酰胺氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如，Stryer編， Biochemistry, pg. 17-21，第 2 版，WH Freeman and Co.，1981)。通過評估變體多肽以與野生型蛋白類似的方式起作用的能力可容易地確定肽的氨基酸序列改變是否產(chǎn)生功能多肽。 具有多于一個取代的肽可以相同方式容易地測試。更罕見地，變體包括“非保守”改變(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。類似的微小變化還可包括氨基酸缺失或插入，或二者兼有?？墒褂糜嬎銠C(jī)程序(例如，LASERGENE軟件，DNASTAR Inc.，Madison, WI)發(fā)現(xiàn)在確定哪些氨基酸殘基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性上的指導(dǎo)?？赏ㄟ^諸如定向進(jìn)化的方法或其他用于產(chǎn)生變體以及截短突變體的組合文庫的技術(shù)來產(chǎn)生變體。在一些實施方案中，從簡并寡核苷酸序列產(chǎn)生同源物和變體，所述簡并寡核苷酸序列例如通過在自動DNA合成儀中化學(xué)合成簡并基因序列而制備并隨后連接組裝用于表達(dá)的適當(dāng)基因。在一些實施方案中，通過隨機(jī)誘變進(jìn)行人工進(jìn)化(例如，通過利用易錯PCR將隨機(jī)突變引入給定的編碼序列中)。在連續(xù)輪次的誘變和選擇過程中，在誘變后，根據(jù)預(yù)期活性篩選得到的克隆(例如，篩選熱穩(wěn)定的RNA連接酶活性)，然后有用的突變被轉(zhuǎn)至下一輪誘變。在本發(fā)明的其他實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸用于基因改組或有性 PCR(sexual PCR)程序(例如，Smith，Nature, 370 :324,1994 ；美國專利第 5837458 號；5830721號；5811238號；5733731)。多個循環(huán)的選擇和改組導(dǎo)致幾種酶的功能增強(qiáng) (Stemmer, Nature, 370 398,1994 ；Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :10747,1994 ； Crameri 等人，Nat. Biotech. ，14 315,1996 ；Zhang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 4504，1997 ；和Crameri等人，Nat. Biotech.，15 :436，1997)。還可以使用本發(fā)明的核酸和蛋白的片段，只要這些片段編碼或擁有期望的酶活性。“單鏈特異性DNA酶”表示特異性消化單鏈DNA但不消化單鏈RNA或與互補(bǔ)的RNA 或DNA退火或復(fù)合的RNA或DNA的DNA酶，不論所述互補(bǔ)的RNA或DNA是另外的核酸分子的一部分(例如，通過分子間堿基配對)還是相同核酸分子的一部分(例如，通過分子內(nèi)堿基配對)。單鏈特異性DNA酶可以是內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶，只要它具有將單鏈DNA特異性消化為單體或短的寡脫氧核糖核苷酸的活性。在一些優(yōu)選的實施方案中，將包括引物在內(nèi)的寡脫氧核糖核苷酸在利用它們的方法的步驟之后通過用單鏈特異性DNA酶消化而從反應(yīng)混合物中移除。外切核酸酶I、外切核酸酶VII和RecJ外切核酸酶是示例性單鏈特異性DNA酶。本文的“T7型RNA聚合酶”(RNAP)表示T7RNA聚合酶(例如，參見由Goeddel， DV, Academic Press，1990 編輯的 Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)，第 185 卷中的 Studier, Fff等人，第60-89頁)或從“T7型”噬菌體獲得的RNAP，T7型噬菌體表示具有與噬菌體T7的遺傳結(jié)構(gòu)相似的遺傳結(jié)構(gòu)的噬菌體。在一些實施方案中，RNA聚合酶啟動子可以是單鏈的，諸如假啟動子(例如，Ohmichi等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 =54-59, 2002)或MvRNAP啟動子，在這種情況下，利用包含MvRNAP (稱為“小vRNAP”，EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA)的轉(zhuǎn)錄活性的1，106-氨基酸結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)于氨基酸 998-2103)的截短的蛋白(Kazmierczak, K. Μ.，等人，EMB0J. ,21 :5815-5823,2002)。如本文所用，“DNA片段”表示從較長DNA分子上切割或釋放或斷裂以致不再與母體分子相連的較長DNA分子的部分或碎片(piece)或區(qū)段，或為僅該較長DNA分子的部分的互補(bǔ)拷貝的ssDNA分子，在后一種情況下，通過使用DNA聚合酶延伸與該較長DNA分子退火并使用該較長DNA分子作模板的引物來合成該互補(bǔ)拷貝。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述方法用于產(chǎn)生包含加標(biāo)簽的DNA片段的集合或群體的“DNA片段文庫”?！澳０濉笔潜缓怂峋酆厦钢T如DNA聚合酶拷貝的核酸分子。不論該核酸分子包含兩條鏈(即，為“雙鏈的”)還是只包含一條鏈(即，為“單鏈的”)，用于指定由合成的核酸所顯示的核苷酸序列的所述核酸分子的鏈?zhǔn)恰澳０濉被颉澳０彐湣?。由該核酸聚合酶合成的核酸與該模板互補(bǔ)。RNA和DNA總是以5’到3’方向合成，開始于模板鏈的3’端，并且核酸雙鏈體的兩條鏈總是對齊，使得這兩條鏈的5’端處于該雙鏈體的相對端(并且，必然地，3’ 端也是如此)。RNA和DNA模板需要引物來啟動DNA聚合酶的合成，但是啟動通過依賴DNA 的RNA聚合酶的合成不需要引物，所述依賴DNA的RNA聚合酶通常被簡稱為“RNA聚合酶”。如本文所用，“標(biāo)簽(tag) ”是指提供與它連接的核酸片段的尋址手段的非靶核酸組分，一般為DNA。例如，在優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)簽包括允許與標(biāo)簽相連的DNA的鑒定、 識別和/或分子操作或生物化學(xué)操作的核苷酸序列(例如，通過提供用于使寡核苷酸退火的位點，所述寡核苷酸諸如用于DNA聚合酶延伸的引物或者捕獲反應(yīng)或連接反應(yīng)的寡核苷酸)。將標(biāo)簽與DNA分子連接的過程有時在本文稱為“加標(biāo)簽”并且經(jīng)歷加標(biāo)簽或含標(biāo)簽的 DNA稱為“加標(biāo)簽的”(例如，“加標(biāo)簽的DNA”)。標(biāo)簽可具有一個或多個標(biāo)簽部分或標(biāo)簽域。如本文所用，“標(biāo)簽部分”或“標(biāo)簽域”表示顯示用于期望的預(yù)定目的或應(yīng)用的序列的標(biāo)簽的部分或結(jié)構(gòu)域。在其中第一鏈cDNA合成引物在其5’端部分中顯示不與靶核酸序列互補(bǔ)的一種或多種核苷酸序列的一些實施方案中，標(biāo)簽在所述5’部分中也具有一種或多種“標(biāo)簽域”，標(biāo)簽域中的每一種為任何期望的目的而提供。例如，在一些實施方案中， 標(biāo)簽包括一個或多個標(biāo)簽域或者由一個或多個標(biāo)簽域組成，所述標(biāo)簽域選自切割位點標(biāo)簽域、RNA聚合酶啟動子標(biāo)簽域、測序標(biāo)簽域、捕獲標(biāo)簽域、擴(kuò)增標(biāo)簽域、檢測標(biāo)簽域、地址標(biāo)簽域和轉(zhuǎn)座子末端域。如本文所用，“切割位點域”表示顯示用于使切割容易的目的的序列的標(biāo)簽域。在一些實施方案中，切割位點域用于從加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA分子產(chǎn)生加雙標(biāo)簽的線性ssDNA分子。在一些實施方案中，在標(biāo)簽中的切割位點域包括以下部分或由以下部分組成一個或多個2'-脫氧尿苷單磷酸(dUMP)部分或者一個或多個8-氧鳥嘌呤-2'-脫氧核苷基單磷酸(8-氧-dGMP)部分，并且該方法的步驟(c)包括使加標(biāo)簽的環(huán)狀第一鏈cDNA分子分別與尿苷-N-糖基化酶(UNG ；EPICENTRE)或8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(Fpg ；EPICENTRE) 接觸，以產(chǎn)生包含一個或多個無堿基位點的加標(biāo)簽的環(huán)狀第一鏈cDNA分子，并隨后孵育該包含一個或多個無堿基位點的加標(biāo)簽的環(huán)狀第一鏈cDNA分子，所述孵育是在其中環(huán)狀第一鏈cDNA分子在該無堿基化位點處或在該無堿基化位點附近被線性化產(chǎn)生加雙標(biāo)簽的線性ssDNA分子的條件下諸如通過在堿性溶液或在包含內(nèi)切核酸酶如內(nèi)切核酸酶IV的溶液中孵育而進(jìn)行。在一些實施方案中，在標(biāo)簽中的切割位點域顯示限制性位點的序列。在一些實施方案中，限制性位點在靶DNA中如果有也只很少出現(xiàn)(例如，稀有切割的限制性內(nèi)切核酸酶諸如NotI或AscI的限制性位點)。在一些實施方案中，在切割位點域中的限制性位點用于II型限制性內(nèi)切核酸酶，諸如i^okl限制性內(nèi)切核酸酶。在一些實施方案中，所述方法還包括使與加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段的單鏈限制性位點互補(bǔ)的寡脫氧核糖核苷酸退火，然后使用識別該限制性位點的限制性內(nèi)切核酸酶在該限制性位點切割該加標(biāo)簽的環(huán)狀 ssDNA片段。因此，在一些實施方案中，所述方法包括使加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段線性化以產(chǎn)生加雙標(biāo)簽的線性ssDNA片段。在一些其他實施方案中，第一鏈cDNA合成引物具有包含雙鏈發(fā)夾或由雙鏈發(fā)夾組成的5’ -端部分，該雙鏈發(fā)夾包含限制性位點，并且所述方法還包括使用識別該限制性位點的限制性內(nèi)切核酸酶在該限制性位點切割加標(biāo)簽的線性ssDNA 片段的步驟。在包括以下的一些優(yōu)選的實施方案中(i)通過與單鏈限制性位點互補(bǔ)的寡脫氧核糖核苷酸的退火或通過使用包含雙鏈發(fā)夾的轉(zhuǎn)移鏈，產(chǎn)生雙鏈的限制性位點，并且 ( )然后使用識別該雙鏈的限制性位點的限制性內(nèi)切核酸酶切割該限制性位點，該方法還包括將限制性內(nèi)切核酸酶切割的加標(biāo)簽的線性ssDNA片段與具有相容的3’端的另一種DNA 分子相連接的步驟。 如本文所用，“RNA聚合酶啟動子域”或“啟動子域”表示顯示用于RNA聚合酶啟動子的正義啟動子序列或反義啟動子序列的序列的標(biāo)簽域。如本文所用，“正義啟動子序列” 或“正義RNA聚合酶啟動子序列”表示與充當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的模板的DNA鏈連接的RNA 聚合酶啟動子的序列，所述RNA聚合酶結(jié)合RNA聚合酶啟動子并且在適于轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件下從RNA聚合酶啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。如本文所用，“反義啟動子序列”或“反義RNA聚合酶啟動子序列”表示與正義啟動子序列互補(bǔ)的RNA聚合酶啟動子的序列。在一些實施方案中， 由RNA聚合酶啟動子域顯示的正義啟動子序列用于結(jié)合單鏈RNA聚合酶啟動子并由此啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，在這些實施方案中，正義啟動子序列足以作為RNA聚合酶啟動子發(fā)揮功能(例如，用于噬菌體N4RNA聚合酶)。在一些實施方案中，正義啟動子序列用于結(jié)合雙鏈 RNA聚合酶啟動子并由此啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，在這些實施方案中，該方法包括在使用結(jié)合雙鏈RNA聚合酶啟動子并由此啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄之前，使RNA聚合酶啟動子變?yōu)殡p鏈的(例如，通過正義啟動子序列與顯示與正義啟動子序列互補(bǔ)的反義啟動子序列的寡脫氧核糖核苷酸退火，或者通過使用加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段或加雙標(biāo)簽的線性 ssDNA片段作為模板來合成包含正義啟動子序列或由正義啟動子序列組成的dsDNA)。在一些實施方案中，正義啟動子序列是用于T7型RNA聚合酶(例如，選自T7RNA聚合酶、T3RNA 聚合酶和SP6RNA聚合酶)的。顯示正義啟動子序列的RNA聚合酶啟動子域使得使用該方法合成與連接于該正義啟動子序列的單鏈DNA互補(bǔ)的RNA成為可能。如本文所用，“測序標(biāo)簽域”或“測序標(biāo)簽”表示顯示用于如下目的的序列的標(biāo)簽域使利用合成加標(biāo)簽的環(huán)狀SSDNA片段的方法對該標(biāo)簽連接的SSDNA片段的測序容易(例如，提供引發(fā)位點用于通過合成測序，或提供退火位點用于通過連接測序，或提供退火位點用于通過雜交測序)。例如，在一些實施方案中，測序標(biāo)簽域提供了用于引發(fā)所述 ssDNA片段或所述ssDNA片段的互補(bǔ)序列的DNA合成的位點。如本文所用，“捕獲標(biāo)簽域”或“捕獲標(biāo)簽”表示如下標(biāo)簽域顯示用于使該標(biāo)簽域連接的SSDNA片段的捕獲容易的目的的序列(例如，提供退火位點或親和標(biāo)簽用于將加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段或加雙標(biāo)簽的線性ssDNA片段捕獲在珠子或其他表面上，例如，其中該標(biāo)簽域序列的退火位點允許通過與表面上的特異性序列諸如在珠子或在微芯片或微陣列或在測序珠子上的探針退火來捕獲)。在該方法的一些實施方案中，在加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA 片段或加雙標(biāo)簽的線性ssDNA片段通過與表面上的互補(bǔ)探針退火而被捕獲后，捕獲標(biāo)簽域提供用于使用所述加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段或所述加雙標(biāo)簽的線性ssDNA片段(或所述加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段或加雙標(biāo)簽的線性ssDNA片段的互補(bǔ)序列)作為模板引發(fā)DNA合成的位點。在一些其他的實施方案中，捕獲標(biāo)簽域包括與化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分連接的轉(zhuǎn)移鏈的5’部分，所述化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)部分包括親和性結(jié)合分子或由其構(gòu)成(例如，其中轉(zhuǎn)移鏈的5’部分與第一親和性結(jié)合分子諸如生物素、鏈霉抗生物素蛋白、抗原或結(jié)合該抗原的抗體連接，所述第一親和性結(jié)合分子允許在第二親和性結(jié)合分子連接的表面上捕獲環(huán)狀加標(biāo)簽的ssDNA片段或加雙標(biāo)簽的線性ssDNA片段，所述第二親和性結(jié)合分子與所述第一親和性結(jié)合分子形成特異性結(jié)合對)。如本文所用，“擴(kuò)增標(biāo)簽域”表示顯示用于如下目的的序列的標(biāo)簽域使所述標(biāo)簽附加的核酸的擴(kuò)增容易。例如，在一些實施方案中，擴(kuò)增標(biāo)簽域提供用于使用DNA聚合酶的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR擴(kuò)增反應(yīng)或鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)或滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng))的引發(fā)位點，或用于在核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如，連接鏈反應(yīng))中使用依賴模板的連接酶連接探針的連接模板。如本文所用，“檢測標(biāo)簽域”或“檢測標(biāo)簽”表示顯示用于如下目的的序列或可檢測的化學(xué)部分或生物化學(xué)部分的標(biāo)簽域使加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段或加雙標(biāo)簽的線性 ssDNA片段的檢測容易(例如，其中所述序列或化學(xué)部分包括可檢測的分子或與可檢測的分子連接；所述可檢測的分子諸如選自以下的可檢測分子可見的、熒光的、化學(xué)發(fā)光的或其他可檢測的染料；在存在底物的情況下可檢測的酶，例如堿性磷酸酶與NBT加BCIP或過氧化物酶與適合的底物)；可檢測的蛋白，例如，綠色熒光蛋白；以及與可檢測的部分結(jié)合或者可與另一種可檢測的親和性結(jié)合分子形成親和性結(jié)合對或特異性結(jié)合對的親和性結(jié)合分子；或本領(lǐng)域已知的許多其他可檢測分子或系統(tǒng)中的任何一種)。如本文所用，“地址標(biāo)簽域”或“地址標(biāo)簽”表示顯示允許特定樣品的鑒定的序列的標(biāo)簽域(例如，其中第一鏈cDNA合成引物的5’-端部分具有對每種樣品顯示不同序列的不同地址標(biāo)簽域)。“轉(zhuǎn)座子末端域”是顯示轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座子末端序列的標(biāo)簽部分或標(biāo)簽域。一般說來， 使用來自 EPICENTRE Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA 的 Nextera 樣品制備試劑盒產(chǎn)生具有含轉(zhuǎn)座子末端域的標(biāo)簽的線性ssDNA分子，從該公司信息是可用的。不同的標(biāo)簽域的名稱和描述是為了便利，這樣使得理解和討論不同實施方案中的標(biāo)簽的不同部分或域的預(yù)定目的和應(yīng)用更容易。然而，這些名稱和描述不旨在以任何方式限制標(biāo)簽或其任何一種標(biāo)簽域的使用或應(yīng)用。因此，任何具體的標(biāo)簽或標(biāo)簽域可用于除了預(yù)定的或主要的目的或應(yīng)用以外任何目的，或者代替預(yù)定的或主要的目的或應(yīng)用的任何目的。同樣，一種標(biāo)簽域可包括兩種或更多種其他標(biāo)簽域(例如，測序標(biāo)簽域可包括捕獲標(biāo)簽域和擴(kuò)增標(biāo)簽域)，或一種標(biāo)簽域可提供兩種或更多種不同的標(biāo)簽域的功能或目的或應(yīng)用 (例如，捕獲標(biāo)簽域還可提供特定應(yīng)用的測序標(biāo)簽域和/或擴(kuò)增標(biāo)簽域的功能或目的)。更進(jìn)一步，不必按照一種或多種不同的域描述標(biāo)簽以便用于任何特定的目的或應(yīng)用或功能。發(fā)明的一般描述通過使用依賴模板的(或同源連接酶)或不依賴模板的(或非同源)連接酶連接線性單鏈DNA(ssDNA)分子可制備環(huán)狀ssDNA分子。如本文所用，“依賴模板的連接酶”或“同源連接酶”表示在以下情況下催化該線性ssDNA分子的分子內(nèi)連接(即環(huán)化)的DNA連接酶當(dāng)與互補(bǔ)多核苷酸退火時，要連接的線性ssDNA分子兩端彼此相鄰。與要連接的ssDNA分子的兩個末端鄰近地退火的多核苷酸在本文被稱為“連接模板”并且這種連接被稱為“依賴模板的連接”或“同源連接”。連接模板可以是生物樣品的基因組或其他DNA中的互補(bǔ)DNA序列，或者連接模板可以是被合成并提供用于連接特定的或具體的線性ssDNA分子的“橋接寡脫氧核糖核苷酸”或“連接夾板(ligation splint)寡脫氧核糖核苷酸”(或“連接夾板”)。每個橋接的寡脫氧核糖核苷酸被設(shè)計顯示與期望連接的線性ssDNA分子末端互補(bǔ)的核苷酸序列，以使得該線性 ssDNA分子的末端在與該橋接的寡脫氧核糖核苷酸退火時相鄰。依賴模板的DNA連接酶的實例包括NAD型DNA連接酶，諸如大腸桿菌DNA連接酶、Tth DNA連接酶、Tfl DNA連接酶和AMPLIGASE DNA 連接酶(EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI, USA)，它們只有在存在連接模板的情況下催化ssDNA分子的分子內(nèi)連接；以及ATP型DNA連接酶，諸如 iMDNA連接酶或FASTLINK DNA連接酶(EPICENTRE Biotechnologies)，盡管對于平端連接 ATP型DNA連接酶不需要連接模板，但比起不依賴模板的連接，它們更有效地催化依賴模板的連接。線性ssDNA分子的依賴模板的分子內(nèi)連接在存在由生物樣品中的靶序列或橋接的寡脫氧核糖核苷酸組成的互補(bǔ)連接模板的情況下是有效的和特異性的，并且是本領(lǐng)域已知的用于檢測生物樣品中靶核酸序列的存在或?qū)ζ涠康脑S多方法的基礎(chǔ)。然而，如果目標(biāo)是環(huán)化大群體的不同ssDNA分子，諸如通過寡聚(dT)引發(fā)的對樣品中所有mRNA分子的反轉(zhuǎn)錄而合成的所有的第一鏈cDNA分子，那么依賴模板的連接是極其不實際的，因為對于所有要連接的ssDNA分子設(shè)計適合的互補(bǔ)的橋接寡脫氧核糖核苷酸是非常困難的。具體而言，如果ssDNA分子的末端序列是未知的，那么設(shè)計或提供互補(bǔ)的橋接寡脫氧核糖核苷酸以環(huán)化在大小和核苷酸序列不同的大群體ssDNA分子中高百分比的所有ssDNA分子是極其困難的或是不可能的。例如，在本申請人嘗試使用橋接寡脫氧核糖核苷酸與不同的依賴模板的連接酶和連接反應(yīng)條件環(huán)化顯示未知或隨機(jī)的5’和/或3’端序列的線性ssDNA分子的實驗室的許多實驗中，不超過百分之幾的線性ssDNA分子可被連接，即使該橋接寡脫氧核糖核苷酸顯示不同長度的隨機(jī)核苷酸序列，或者其中該橋接寡脫氧核糖核苷酸的一部分顯示與在我們期望連接的線性ssDNA底物的一端的已知序列互補(bǔ)的序列，并且其序列的另一相鄰部分由不同長度的隨機(jī)序列或不同長度的包含通用堿基諸如肌苷的序列組成。不受理論束縛，申請人相信橋接寡脫氧核糖核苷酸的已知序列正確地與在要連接的線性ssDNA 分子一端的互補(bǔ)序列退火，但在該橋接寡脫氧核糖核苷酸另一端的隨機(jī)序列通常不與該線性ssDNA分子的另一端互補(bǔ)(并因此阻斷連接)。因而，使用依賴模板的連接酶的方法對于許多應(yīng)用(例如，用于從樣品中的所有mRNA分子制備的所有第一鏈cDNA分子產(chǎn)生環(huán)狀 ssDNA分子，(例如，用于基因表達(dá)分析)，或者用于從變性基因組DNA片段產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA 分子(例如，用于CNV分析))來說是不實際的。本領(lǐng)域所需的是不需要連接模板諸如互補(bǔ)的靶核酸或橋接寡脫氧核糖核苷酸來從線性SSDNA分子產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA分子的分子內(nèi)連接方法。所需的是采用“不依賴模板的” 或“非同源的”連接酶的分子內(nèi)連接方法，提及“不依賴模板的”或“非同源的”連接酶我們在此表示在不存在連接模板的情況下導(dǎo)致線性ssDNA的分子內(nèi)連接以產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA的連接酶，所述連接模板例如與期望連接的線性ssDNA末端退火以使其末端相鄰的靶核酸或橋接寡脫氧核糖核苷酸。如上文在以上所討論的，已嘗試和本領(lǐng)域已知用于線性ssDNA分子不依賴模板的分子內(nèi)連接成環(huán)狀ssDNA分子的方法和連接反應(yīng)混合物產(chǎn)生不令人滿意的可變結(jié)果，這取決于線性ssDNA分子的序列和長度。因而，即使對于產(chǎn)生最好的不依賴分子內(nèi)模板的連接結(jié)果的熱穩(wěn)定的RNA連接酶如噬菌體TS2U6RNA連接酶來說，在本領(lǐng)域?qū)τ诟倪M(jìn)不依賴分子內(nèi)模板的連接方法以及對于改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和試劑盒存在迫切的未滿足的需求。 本領(lǐng)域已知的最好的可用連接反應(yīng)混合物和連接條件已使用，如本文所用，“標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物”，其在本文表示包含具有5’ -磷?；?’ -羥基基團(tuán)的0. 5 μ M線性ssDNA底物分子、1 μ M熱穩(wěn)定的RNA連接酶(例如，每微升5單位CIRCLIG ASE ssDNA連接酶)、50mM MOPS 緩沖液(pH 7. 5) UOmM KClUmM DTT、5mM MgCl2,2. 5mM MnCl2 禾口 50 μ M ATP 的連接反應(yīng)混合物，并且“標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件”表示線性ssDNA底物分子在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中在 60°C孵育一小時。以上標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物和標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件與本領(lǐng)域中常用于使用噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶進(jìn)行線性ssDNA的分子內(nèi)連接的標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物和標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件相同或相似。EPICENTRE Biotechnologies (Madison, WI, USA)推薦這些使用CIRCLIGASE ssDNA連接酶(例如，見產(chǎn)品手冊〃 Lit. #222)進(jìn)行ssDNA的分子內(nèi)連接的標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件，并且ft^karia及其合作伙伴Matis和ftOkazyme推薦該標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件，除外的是他們另外推薦在該標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中添加牛血清白蛋白(BSA) 至每微升25ng BSA的終濃度(例如，見日期為2004年4月洸日的THERM0PHAGE ssDNA 連接酶(產(chǎn)品號IUig 122)的產(chǎn)品說明4.2版中對"ssDNA連接(環(huán)化)的指示，該 thermophage s sDna連接酶到本專利申請的申請日為止可從thermophage ssDna連接酶的經(jīng)銷商 Prokaria、Matis 或 Prokazyme 獲得。在使用以上標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件分子內(nèi)連接線性ssDNA分子后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)在變性條件下分析反應(yīng)產(chǎn)物。樣品可以在凝膠上電泳之前用外切核酸酶(外切核酸酶I或外切核酸酶III，或優(yōu)選兩種酶的混合物)處理，所述外切核酸酶消化未連接的ssDNA分子并且?guī)椭b定環(huán)狀ssDNA分子內(nèi)連接產(chǎn)物。在申請人和申請人的雇主EPICENTRE Biotechnologies的其他雇員研究和銷售 CIRCLIGASE ssDNA連接酶的大約五年中，EPICENTRE科學(xué)家觀察到，使用所述標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物和條件，某些ssDNA寡核苷酸比具有不同序列或長度的其他ssDNA寡核苷酸更容易被環(huán)化。使用該酶從較大線性ssDNA分子合成顯著產(chǎn)率的環(huán)狀ssDNA分子也是非常困難的，所述較大線性ssDNA分子諸如通過對來自生物樣品的mRNA反轉(zhuǎn)錄而制備的第一鏈 CDNA0優(yōu)選讓所有ssDNA分子以相同高效率分子內(nèi)連接，這樣達(dá)到各種應(yīng)用中的最好表現(xiàn)。EPICENTRE Biotechnologies已提供了用于改進(jìn)抗拒連接或難以連接的底物的連接產(chǎn)率的指南。這些建議包括改變MnCl2濃度或比標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物添加更多的 CIRCLIGASE 酶。然而，對于某些底物來說，產(chǎn)率仍比用更易連接或容易連接的ssDNA底物能達(dá)到的產(chǎn)率小。在研究CIRCLIGASE ssDNA連接酶的幾年中，申請人還觀察到這種酶不同的制備物對某些線性ssDNA底物產(chǎn)生產(chǎn)率可變的環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物。在2008年，EPICENTRE Biotechnologies的科學(xué)家構(gòu)建了噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的 RNA連接酶基因的新的重組質(zhì)?？寺∫员惬@得比我們用先前克隆能獲得的該蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中的更好的表達(dá)和產(chǎn)率。新的重組克隆包含噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶基因的核苷酸序列但沒有六組氨酸標(biāo)簽，如在美國專利第7，303，901號中公開的。CIRCLIGASE 酶以良好的產(chǎn)率從這個新克隆中表達(dá)并且當(dāng)被純化時具有預(yù)期的43，876道爾頓分子量， 并且通過在包含SDS的10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分析純化的酶制備物。然而，申請人出乎意料地發(fā)現(xiàn)從這個新克隆制備的CIRCLIGASE 酶主要由腺苷酸化形式的TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶組成(估計大約70%腺苷酸化)(圖1)。相反，從先前克隆制備的酶的類似 SDS-PAGE分析顯示該酶主要由非腺苷酸化形式的TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶組成(估計只有大約30%腺苷酸化)。當(dāng)來自新克隆和舊克隆的酶制備物在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件(上述)下使用時，使用來自新克隆的酶制備物獲得環(huán)狀ssDNA連接產(chǎn)物的產(chǎn)率比使用來自舊克隆的酶制備物獲得的產(chǎn)率低。這個結(jié)果有點出人意料并且引導(dǎo)申請人系統(tǒng)地比較從新克隆和舊克隆制備的CIRCLIGASE 酶的分子內(nèi)連接活性，使用不同的線性ssDNA底物，不同的連接反應(yīng)混合物，包括具有不同的ATP、MgCl2, MnCl2水平和不同的從新克隆和舊克隆制備的CIRCLIGASE 酶水平的連接反應(yīng)混合物，以及用不同的連接反應(yīng)條件，包括不同的反應(yīng)時間，以及在連接反應(yīng)混合物中的某些全新組分，諸如兩性離子化合物三甲基甘氨酸(甜菜堿)。出人意料地且預(yù)想不到地，申請人觀察到，當(dāng)在不存在ATP且腺苷酸化形式的 CIRCLIGASE ssDNA連接酶(TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶)比線性ssDNA底物摩爾過剩條件下進(jìn)行連接反應(yīng)時，尤其是來自新克隆的高腺苷酸化的酶對具有不同核苷酸序列和大小的各種不同的線性ssDNA底物產(chǎn)生近似定量的分子內(nèi)連接(尤其是在申請人發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步改良連接反應(yīng)的方法以制備改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和改進(jìn)的連接反應(yīng)條件之后)。獲得的結(jié)果(見實施例)使得申請人開發(fā)了允許對具有不同核苷酸序列和/或大小的線性ssDNA底物更加有效和一致的分子內(nèi)連接的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和使用所述改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的改進(jìn)的分子內(nèi)連接方法。因而，本發(fā)明的一個實施方案是用于線性ssDNA分子的分子內(nèi)連接成為環(huán)狀 ssDNA分子的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物?！案倪M(jìn)的連接反應(yīng)混合物”在本文表示包含以下成分的連接反應(yīng)混合物(a)線性 ssDNA 分子；(b)熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物，其中高比例的所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的并且其中所述腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的濃度至少等于所述 ssDNA分子的摩爾濃度；(c)保持pH的緩沖液；和(d) Mn2+陽離子；其中，ATP在所述反應(yīng)緩沖液中不存在，或者以比所述非腺苷酸化形式的熱穩(wěn)定的 RNA連接酶的濃度小的摩爾濃度存在。在優(yōu)選的實施方案中，沒有向所述連接反應(yīng)混合物添加 ATP。提及語句“高比例的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的”，我們表示在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中所有熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的至少約60%為腺苷酸化的。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，所有熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的大于約70%為腺苷酸化的。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，所有熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的大于約 80 %為腺苷酸化的。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些優(yōu)選的實施方案中，所有熱穩(wěn)定的RNA 連接酶分子的大于約90%為腺苷酸化的。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些優(yōu)選的實施方案中，所有熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的大于約95 %為腺苷酸化的。在一些優(yōu)選的實施方案中， 熱穩(wěn)定的RNA連接酶被腺苷酸化來制備如下組合物其中通過在純化過程之中或之后將熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子與ATP孵育將高比例的該酶腺苷酸化。例如，可用于使熱穩(wěn)定的RNA 連接酶腺苷酸化的一個方案是在50°C下在包含50mMTris-HCl，pH 8. 0、2mM MgCl2UOOmM NaCl以及0. 5mM ATP的溶液中孵育該酶15分鐘；然后通過添加EDTA至5mM的終濃度終止反應(yīng)；然后通過透析或凝膠過濾除去反應(yīng)組分。腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶的百分比可通過在實施例中描述的SDS-PAGE分析來估計。在一些優(yōu)選的實施方案中，其中高比例熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子被腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶為噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，緩沖液將PH保持在pH 6.5和？!1 8.0 之間。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些優(yōu)選的實施方案中，緩沖液將PH保持在pH 7.0和 PH 8.0之間。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些優(yōu)選的實施方案中，將pH保持在pH 7.0和 PH 8.0之間的緩沖液是Tris緩沖液。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，Mn2+陽離子的濃度在0. 5mM和IOmM之間。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，Mn2+陽離子的濃度在ImM和IOmM之間。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，Mn2+陽離子的濃度在ImM和5mM之間。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些優(yōu)選的實施方案中，Mn2+陽離子的濃度為2. 5mM。在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些優(yōu)選的實施方案中，Mn2+陽離子作為MnCl2 而提供。在一些實施方案中，在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的濃度為ssDNA分子摩爾濃度的至少兩倍。在一些實施方案中，在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子濃度為ssDNA分子摩爾濃度的至少五倍。 在一些實施方案中，在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子濃度為ssDNA分子摩爾濃度的至少十倍。在一些優(yōu)選的實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括鹽，諸如氯化鉀或醋酸鉀(例如，濃度在大約50mM到大約IOOmM)。在一些優(yōu)選的實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括還原劑，諸如二硫蘇糖醇(DTT)(例如，濃度在大約0. 5mM或ImM)。在一些實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括濃度在0. 25M 到5. 2M之間的兩性離子的三甲基甘氨酸(甜菜堿)。在一些實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括濃度在0. 5M到2M之間的兩性離子的三甲基甘氨酸(甜菜堿)。在一些實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括大約IM濃度的兩性離子的三甲基甘氨酸(甜菜堿)。在一些優(yōu)選的實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物包括(a)具有5，-磷酰基和3，-羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子(例如，0. 5 μ M)；(b)熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物，其中> 70%的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的并且其中在該改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的濃度至少等于ssDNA分子的濃度(例如，約1 μ M的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶對應(yīng)0. 5 μ M的線性ssDNA分子)；(c)最終pH為大約pH 7. 8的33mM TRIS醋酸鹽；禾口
(d)終濃度大約2. 5mM的Mn2+陽離子；其中，ATP在所述反應(yīng)緩沖液中不存在，或者以比所述非腺苷酸化形式的熱穩(wěn)定 RNA連接酶的濃度小的摩爾濃度存在。在優(yōu)選的實施方案中，沒有向所述連接反應(yīng)混合物添加 ATP。在一些優(yōu)選的實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括66mM醋酸鉀和0. 5mM DTT0在一些優(yōu)選的實施方案中，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物另外包括IM甜菜堿。本發(fā)明的另一實施方案是用于線性ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接來合成環(huán)狀 ssDNA分子的方法，其中該方法包括將該線性ssDNA分子在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中在大約40°C到大約70°C的反應(yīng)溫度下孵育足夠的時間，其中合成環(huán)狀ssDNA分子。在用于線性 ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接來合成環(huán)狀ssDNA分子的方法的一些實施方案中，該方法包括將該線性ssDNA分子在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中在55°C到70°C的反應(yīng)溫度下孵育足夠的時間，其中合成環(huán)狀ssDNA分子。在用于線性ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接來合成環(huán)狀 ssDNA分子的方法的一些優(yōu)選的實施方案中，該方法包括將該線性ssDNA分子在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中在55°C到65°C的反應(yīng)溫度下孵育足夠的時間，其中合成環(huán)狀ssDNA分子。 在用于線性ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接來合成環(huán)狀ssDNA分子的方法的一些優(yōu)選的實施方案中，該方法包括將該線性ssDNA分子在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物中在60°C的反應(yīng)溫度下孵育足夠的時間，其中合成環(huán)狀ssDNA分子。在其中線性ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接的方法用于合成環(huán)狀ssDNA分子的一些實施方案中，合成的環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率比使用本文所定義的標(biāo)準(zhǔn)連接條件從相同量的線性ssDNA分子合成的環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率高至少兩倍。在其中線性ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接的方法用于合成環(huán)狀ssDNA分子的一些實施方案中，合成的環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率比使用本文所定義的標(biāo)準(zhǔn)連接條件從相同量的線性ssDNA分子合成的環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率高至少五倍。在其中線性ssDNA分子改進(jìn)的分子內(nèi)連接的方法用于合成環(huán)狀ssDNA分子的一些實施方案中，合成的環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率比使用本文所定義的標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件從相同量的線性ssDNA分子合成的環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率高至少十倍。上述預(yù)想不到的發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)申請人思考該改進(jìn)的連接反應(yīng)條件的基礎(chǔ)，希望對所涉及的機(jī)制的更好的理解將使我們能夠?qū)⑽覀兊陌l(fā)現(xiàn)應(yīng)用并擴(kuò)展到其他情況、應(yīng)用和方法。 我們希望我們的發(fā)現(xiàn)和更好的理解將產(chǎn)生更有效的且一致的線性ssDNA分子的分子內(nèi)連接和在用于可使用環(huán)狀ssDNA分子的任何應(yīng)用的環(huán)狀ssDNA分子的合成中的產(chǎn)率最大化。 不受理論或推測束縛，關(guān)于在此描述的本發(fā)明的基礎(chǔ)和潛在益處，申請人在以下提供了他們的想法和意見。為了解決使用噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶對具有不同序列和大小的ssDNA 分子進(jìn)行的可變的分子內(nèi)連接效力的問題，申請人仔細(xì)考慮在這種酶的連接機(jī)制中涉及的各種催化步驟，這些催化步驟實際上對所有依賴ATP的DNA和RNA連接酶而言是常見的。噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶(例如，CIRCLIGASE 或THERM0PHAGE )連接反應(yīng)步驟可書寫如下反應(yīng)1.連接酶+ATP —腺苷酸化的連接酶+PPi反應(yīng)2.腺苷酸化的連接酶+線性5，-pDNA — AppDNA+連接酶反應(yīng)3.連接酶+AppDNA —環(huán)狀DNA+AMP+連接酶因而，第一反應(yīng)步驟包括TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶活性位點賴氨酸的ε氨基基團(tuán)被ATP腺苷酸化形成腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶。然后，在第二反應(yīng)步驟中，將 AMP部分從該腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶轉(zhuǎn)移至該線性ssDNA的5’磷?；鶊F(tuán)來合成 5，腺苷酸化的ssDNA。最后，非腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶促進(jìn)該ssDNA的3，-羥基基團(tuán)(在連接反應(yīng)中稱“受體”)對5’ -腺苷酸化末端(在連接反應(yīng)中稱為“供體”)的攻擊，從而使該ssDNA的3’ -端與5’ -端連接來合成環(huán)狀ssDNA并釋放非腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶和AMP?；跓岱€(wěn)定的RNA連接酶的以上3步驟的連接反應(yīng)機(jī)制，相比于本領(lǐng)域中使用的標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件，可以設(shè)想幾種改進(jìn)分子內(nèi)連接效率和環(huán)狀ssDNA分子的產(chǎn)率的策略。例如，可用于本領(lǐng)域的一種策略是試著調(diào)整ATP濃度以找到給出更有效率或更高水平的分子內(nèi)連接的濃度。這種策略有時對于優(yōu)化使用熱穩(wěn)定的RNA連接酶容易連接的單ssDNA底物的分子內(nèi)連接而言是有效的。提及“容易連接”，我們表示如下ssDNA底物 所述ssDNA底物顯示允許其被熱穩(wěn)定的RNA連接酶有效地分子內(nèi)連接并以高水平形成環(huán)狀ssDNA分子的序列和大小。提及“高水平”，我們表示至少50%的線性ssDNA分子在存在熱穩(wěn)定的RNA連接酶的情況下在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件下孵育一小時后被分子內(nèi)連接。然而， 如在“背景”部分中所討論的，本申請人和本領(lǐng)域其他技術(shù)人員諸如Nimez等人(在以上討論)在研究這一問題的幾年時間內(nèi)觀察到在不同ssDNA分子的分子內(nèi)連接效率上的巨大差異。盡管我們努力這樣做，但我們不能制定規(guī)則來可靠地預(yù)測哪種ssDNA底物會容易連接以及哪種ssDNA底物很難或甚至不可能有效地連接。因而，在其中希望達(dá)到單種難以連接的ssDNA分子的有效或高水平的分子內(nèi)連接或其中希望達(dá)到在序列、大小或連接效率不同的ssDNA分子群體中所有ssDNA分子的有效或高水平的分子內(nèi)連接的情況下，試著尋找用于分子內(nèi)連接反應(yīng)的更好的ATP濃度的策略還沒有成功。我們首先問自己“我們及其他人沒有成功通過調(diào)整ATP濃度來實現(xiàn)這種情況下更有效或高水平的分子內(nèi)連接的原因是什么？”為試圖回答這個問題，我們考慮了試著達(dá)到在序列、大小或連接效率不同的ssDNA分子群體中的所有ssDNA分子的有效或高水平的分子內(nèi)連接的常見的情況(諸如，將遇到試著分子內(nèi)連接通過將生物樣品中的所有mRNA分子反轉(zhuǎn)錄而制備的所有第一鏈cDNA分子或通過使斷裂的dsDNA諸如變性的斷裂的基因組 DNA或線粒體DNA變性而獲得的所有ssDNA片段)。在這種群體中，將尋找一些容易連接的 ssDNA分子和其他難以連接的ssDNA分子。容易連接的ssDNA分子、難以連接的ssDNA分子和RNA連接酶在存在ATP的情況下開始連接反應(yīng)后在不同的時間點發(fā)生了什么？
包括RNA連接酶分子的腺苷酸化的第一反應(yīng)步驟在反應(yīng)溫度(對于TS2U6RNA連接酶而言通常在大約60°C )下孵育連接反應(yīng)混合物后立即開始。隨著這個步驟發(fā)生，腺苷酸化的RNA連接酶分子被用在第二反應(yīng)步驟中使ssDNA分子的5’ -磷?；┒讼佘账峄?。 對于容易連接的ssDNA連接底物(意味著被RNA連接酶快速地分子內(nèi)連接的ssDNA底物) 來說，該底物可以在所有RNA連接酶分子被ATP腺苷酸化之前被快速地腺苷酸化，隨后，在第二反應(yīng)步驟后仍與非腺苷酸化連接酶結(jié)合的腺苷酸化ssDNA分子在第三反應(yīng)步驟中被非腺苷酸化RNA連接酶進(jìn)行分子內(nèi)連接。就難以連接的ssDNA連接底物(意味著只非常慢地被RNA連接酶進(jìn)行分子內(nèi)連接的底物)而言，連接反應(yīng)的第二或第三步驟或兩個步驟發(fā)生得更慢。因而，隨著越來越多的RNA連接酶分子被ATP腺苷酸化直至大多數(shù)或所有的RNA 連接酶分子被腺苷酸化，一些ssDNA分子也被腺苷酸化。然而，腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶不能分子內(nèi)連接腺苷酸化的線性ssDNA分子。因此，如果所有RNA連接酶分子的腺苷酸化發(fā)生在一些難以連接的ssDNA分子被腺苷酸化但還沒有被分子內(nèi)連接之后，不可能完成連接步驟3將腺苷酸化的難以連接的線性ssDNA分子轉(zhuǎn)化成環(huán)狀ssDNA分子。具體地說， 如果在連接反應(yīng)步驟2之后所有的RNA連接酶分子被腺苷酸化并且難以連接的ssDNA分子被腺苷酸化但不與非腺苷酸化的RNA連接酶結(jié)合，那么這些腺苷酸化的ssDNA分子將不被連接。因此，在存在ATP的情況下進(jìn)行分子內(nèi)連接反應(yīng)能夠在所有熱穩(wěn)定的RNA連接酶被腺苷酸化且一些線性ssDNA底物被腺苷酸化的情況下限制反應(yīng)。這個問題的一個可能的解決辦法可能是降低連接反應(yīng)混合物中ATP的濃度。然而，如果ATP濃度非常低，連接反應(yīng)步驟1變成速率限制步驟，也降低第二和第三連接反應(yīng)步驟的速率。在反應(yīng)過程中，ATP的濃度降低，因此總反應(yīng)速率也隨著時間降低?？赡苋藗儠捎肁TP再生系統(tǒng)來將ATP濃度保持在不導(dǎo)致連接酶的完全腺苷酸化的穩(wěn)態(tài)水平。然而， 條件可能對于反應(yīng)中所有不同的線性ssDNA分子來說不是最適的。通過添加其他反應(yīng)組分引入的復(fù)雜性也是不期望的，因為更加難以控制或優(yōu)化所有ssDNA分子的連接。概括地說，如果連接反應(yīng)步驟1是快速的，而連接步驟2和3是速率限制的，那么不管反應(yīng)進(jìn)行多長都將產(chǎn)生低產(chǎn)率的環(huán)。這是因為所有的連接酶在[ATP] >> [連接酶] 的標(biāo)準(zhǔn)連接條件下將處于腺苷酸化形式。如果連接反應(yīng)步驟1和2是快速的，而連接反應(yīng)步驟3是速率限制的，那么由于相同的原因?qū)@得低產(chǎn)率的環(huán)。因而，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物和本領(lǐng)域已知的用熱穩(wěn)定的RNA連接酶對ssDNA分子進(jìn)行分子內(nèi)連接的方法時，容易連接的ssDNA連接底物可以在所有的酶被ATP腺苷酸化之前被腺苷酸化并且快速地由RNA 連接酶進(jìn)行分子內(nèi)連接，而難以連接的ssDNA連接底物可以在所有的酶被ATP腺苷酸化之前被腺苷酸化但還未被連接，使得不可能驅(qū)使腺苷酸化的難以連接的ssDNA底物的分子內(nèi)連接完成?；谶@些考慮，申請人假設(shè)，不受理論束縛，分子內(nèi)連接因改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和利用腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶比線性ssDNA分子摩爾過量及無外源ATP的改進(jìn)的連接反應(yīng)條件而改進(jìn)，因為在這些條件下，連接反應(yīng)的第一步驟被繞過，所以不存在將非腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶轉(zhuǎn)化為腺苷酸化形式的ATP，同時線性ssDNA分子在連接反應(yīng)的第二步驟中被腺苷酸化。因而，在穩(wěn)態(tài)條件下，腺苷酸化的RNA連接酶只用于在連接反應(yīng)的第二步驟中使線性ssDNA分子腺苷酸化。同樣，在改進(jìn)的連接反應(yīng)條件下，隨著線性 ssDNA的腺苷酸化發(fā)生，非腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶濃度在反應(yīng)中隨時間增加，這有利于線性ssDNA分子被分子內(nèi)連接合成環(huán)狀ssDNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員沒有注意在連接反應(yīng)混合物中提供的熱穩(wěn)定的RNA連接酶的腺苷酸化水平來改進(jìn)ssDNA分子的分子內(nèi)連接。申請人無法找到如下任何本領(lǐng)域技術(shù)人員的任何公開內(nèi)容已指定包含熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物的連接反應(yīng)混合物，其中高比例的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子被腺苷酸化，或者已公開使用這種改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物進(jìn)行ssDNA分子的分子內(nèi)連接的方法。因而，使用缺乏ATP的本發(fā)明的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物，通過提供熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物，其中高比例的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子被腺苷酸化并且其中該腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶以等于或超過要連接的5’-磷酸化的ssDNA分子摩爾濃度的濃度存在于該連接反應(yīng)混合物中，實現(xiàn)對分子內(nèi)連接反應(yīng)動力學(xué)的更大控制。更進(jìn)一步，本發(fā)明改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和改進(jìn)的連接反應(yīng)條件允許更容易地優(yōu)化其他連接反應(yīng)參數(shù)以改進(jìn)各種DNA樣品的環(huán)狀DNA的速率和產(chǎn)率。例如，如以上所述，申請人發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)連接產(chǎn)率可通過在反應(yīng)中除去鎂和只包括錳作為二價陽離子來改進(jìn)。作為另一個實例，添加甜菜堿到反應(yīng)中也改進(jìn)環(huán)狀DNA的產(chǎn)率。已知甜菜堿使核酸中的G-C堿基配對不穩(wěn)定以及改進(jìn)酶在升高的溫度下的穩(wěn)定性。這兩種效應(yīng)將通過使DNA更易于分子內(nèi)連接以及通過在長孵育階段中保持高酶活性而允許更好的產(chǎn)率。
實施例在以下實施例和權(quán)利要求中進(jìn)一步定義了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解這些實施例雖然指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅通過舉例說明方式給出。從以上討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的必要特征，并且在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下能夠?qū)Ρ景l(fā)明作出各種改變和變更以使其適合于各種運(yùn)用和條件。實施例1來自噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶基因的新克隆的純化的CIRCLIGASE 酶的SDS-PAGE分析腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶在10 % SDS-PAGE凝膠上遷移為比非腺苷酸化的 CIRCLIGASE 略高的條帶。圖1顯示從新克隆獲得的CIRCLIGASE 酶制備物的銀染色的 SDS-PAGE凝膠。通過比較腺苷酸化條帶和非腺苷酸化條帶的相對強(qiáng)度估計腺苷酸化百分比；這里顯示的來自新克隆的CIRCLIGASE 酶估計由大約70%的腺苷酸化形式和大約30% 的非腺苷酸化形式構(gòu)成。實施例2來自新克隆的高腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶與來自舊克隆的低腺苷酸化的 CIRCLIGASE 酶的分子內(nèi)連接活性的比較當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)條件下測定時，來自舊克隆的低腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶將近似> 95%的55-核苷酸對照寡核苷酸(與CIRCLIGASE ssDNA連接酶一起供應(yīng)的線性 ssDNA)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物(圖2)。相比之下，來自新克隆的高腺苷酸化的CIRCLIGASE 酶只將近似50%的相同線性ssDNA寡核苷酸轉(zhuǎn)化為環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物。實施例3ATP濃度對由新克隆純化的高腺苷酸化形式的CIRCLIGASEtmssDNA連接酶進(jìn)行的線性ssDNA的分子內(nèi)連接的影響在標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)化合物中存在50 μ M ATP的情況下，與CIRCLIGASE ssDNA連接酶一起供應(yīng)的近似50%的55-核苷酸ssDNA對照寡核苷酸被轉(zhuǎn)化為環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中省略ATP時，近似> 95%的55-核苷酸ssDNA對照寡核苷酸被轉(zhuǎn)化為環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物(圖3)。環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物對20單位的外切核酸酶I (Exo I ；EPICENTRE) 的消化有抵抗力，外切核酸酶I為需要游離3’端的單鏈特異性外切核酸酶。未連接的線性 ssDNA底物被Exo I降解，而環(huán)狀ssDNA連接產(chǎn)物對Exo I消化具有抵抗力。實施例4使用具有不同核苷酸序列和不同大小的線性ssDNA分子的高腺苷酸化形式的 CIRCLIGASE ssDNA連接酶與低腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA連接酶的分子內(nèi)連接活性的比較只包含低百分比的該酶的腺苷酸化形式的CIRCLIGASEtmssDNA連接酶 (EPICENTRE)對顯示不同核苷酸序列或大小的不同線性ssDNA寡核苷酸底物的分子內(nèi)連接顯示不同的效率。然而，包含高百分比的該酶的腺苷酸化形式的CIRCLIGASEssDNA連接酶當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中省略ATP時對顯示不同核苷酸序列或大小的不同線性ssDNA寡核苷酸底物顯示高得多的分子內(nèi)連接效率(圖4中的表)。雖然從標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物中除去ATP提高了測試的大多數(shù)線性ssDNA寡核苷酸的分子內(nèi)連接，但一些線性ssDNA底物如 4N454B和pYRTP. 5在這些條件下仍連接較差。這些底物用于進(jìn)一步優(yōu)化連接反應(yīng)條件。實施例5使用高腺苷酸化形式的CIRCLIGASETMssDNA連接酶的分子內(nèi)連接反應(yīng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的開發(fā)使用在實施例4中連接較差的線性ssDNA寡核苷酸pYRTP. 5底物和高腺苷酸化形式的CIRCLIGASETMssDNA連接酶(從新克隆純化)評估鎂和錳二價陽離子對分子內(nèi)連接的影響。使用在由 33mM Tris 醋酸鹽 pH7. 6、66mM K0Ac、0. 5mM DTT 和 O、1、2. 5、5 或 IOmM MnCl2或Mg(OAc)2組成的新連接反應(yīng)混合物中的pYRTP. 5ssDNA底物和高腺苷酸化形式的 CIRCLIGASE ssDNA連接酶進(jìn)行分子內(nèi)連接實驗。如圖5所示，發(fā)現(xiàn)用于線性pYRTP. ksDNA 底物的分子內(nèi)連接的優(yōu)化的連接反應(yīng)混合物在不存在鎂陽離子的情況下包含2. 5mM MnCl20在這些連接反應(yīng)條件下，近似30%的線性pYRTP. ksDNA底物被分子內(nèi)連接。此外， 與本領(lǐng)域之前關(guān)于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)混合物的最適連接反應(yīng)條件的發(fā)現(xiàn)不同，連接反應(yīng)混合物中除了 2. 5mM MnCl2之外還存在鎂陽離子沒有改進(jìn)連接。當(dāng)在包含2. 5mM MnCl2和5mM Mg(OAc)2的相同緩沖液中進(jìn)行分子內(nèi)連接反應(yīng)時，< 10%的線性pYRTP. 5ssDNA底物被轉(zhuǎn)化為環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)在包含線性ssDNA寡核苷酸pYRTP. 5底物、高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA連接酶和2. 5mM MnCl2的相同的連接反應(yīng)混合物中進(jìn)行分子內(nèi)連接反應(yīng)時，通過添加 100 μ g/ml的BSA或DMSO (5-20% 7V)沒有觀察到pYRTP. ksDNA底物分子內(nèi)連接的進(jìn)一步改進(jìn)(數(shù)據(jù)未顯示)。本發(fā)明不限于包含Tris的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物。例如，改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些其他實施方案包含MOPS pH 7. 5緩沖液或另一種緩沖液。實施例6改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的進(jìn)一步開發(fā)難以連接的底物的甜菜堿分子內(nèi)連接效率的效應(yīng)使用在由來自實施例5的由33mM Tris醋酸鹽pH 7. 6、66mM K0Ac、0. 5mM DTT和 2. 5mM MnCl2組成的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物加IM甜菜堿中的pYRTP. 5ssDNA底物和高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA連接酶評估兩性離子的三甲基甘氨酸(甜菜堿)對分子內(nèi)連接的影響并且將該反應(yīng)混合物在60°C孵育16小時。在這些改進(jìn)的連接反應(yīng)條件下，幾乎 100%的線性pYRTP. 5ssDNA底物被轉(zhuǎn)化為耐外切核酸酶的環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物(圖5)。甜菜堿對容易連接的線性ssDNA底物(例如，線性pYGT. 5ssDNA寡核苷酸)的分子內(nèi)連接速率沒有可檢測的影響，如通過時程分析所確定的(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，甜菜堿似乎增強(qiáng)了難以連接的ssDNA底物的分子內(nèi)連接而對容易連接的線性ssDNA底物沒有抑制作用。因而，濃度在0. 25M和2. 2M之間的甜菜堿被包括在改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案中，并且在改進(jìn)的連接反應(yīng)條件的一些實施方案中，使用在大約60°C的較長反應(yīng)時間。實施例7CIRCLIGASE ssDNA連接酶的底物大小偏愛的評估許多相關(guān)應(yīng)用要求不同ssDNA底物群體的環(huán)化。為了評估具有不同核苷酸序列和大小的線性ssDNA底物群體的無偏倚的分子內(nèi)連接的可能性，將限制性內(nèi)切核酸酶切割的且變性的基因組DNA作為使用高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE ssDNA連接酶的分子內(nèi)連接的底物來測試。用Alu I完全消化小牛胸腺DNA，通過加熱使之變性，在冰上快速冷卻。得到的線性ssDNA分子在變性PAGE凝膠上顯示可再現(xiàn)的且特異性的帶型和大小分布。將變性的Alu I消化的小牛胸腺ssDNA片段與高腺苷酸化形式的CIRCLIGASE酶在來自實施例6的改進(jìn)的連接反應(yīng)條件下孵育，這導(dǎo)致近似10%的200ng總ssDNA底物轉(zhuǎn)化為耐外切核酸酶的環(huán)狀ssDNA產(chǎn)物(圖7)。對線性ssDNA分子觀察到的相對大小分布和特異性帶型被分子內(nèi)連接后的環(huán)狀ssDNA分子所保留，這指示但不證明，對于高達(dá)約6000個核苷酸大小的ssDNA片段，不存在基于大小或總體序列組成的總底物偏倚(圖7)。用Rsa I切割隨后變性的基因組DNA獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例8改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和改進(jìn)的連接反應(yīng)條件應(yīng)用至使用古細(xì)菌的熱穩(wěn)定的RNA 連接酶進(jìn)行的線性ssDNA分子的分子內(nèi)連接申請人:克隆、表達(dá)并純化了嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌RNA連接酶I(Mthfoil) (Torchia, C 等人，Nucleic Acids Res 36 :6218-6227,2008) 在實施例6中描述的但包含大約50%到 60%腺苷酸化的Mthfoil酶的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和改進(jìn)的連接反應(yīng)條件改進(jìn)了從線性 ssDNA分子合成環(huán)狀ssDNA分子的分子內(nèi)連接效率和產(chǎn)率。Mthfoil酶的連接效率和產(chǎn)率不如具有相當(dāng)?shù)南佘账峄降腃IRCLIGASE (TS2126RNA連接酶)的連接效率和產(chǎn)率高。改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物的一些實施方案包含不同的高腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶的混合物(例如，包括噬菌體TS2U6RNA連接酶和Mthfoil)。實施例9使用產(chǎn)生加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段的方法作為制備下一代測序模板的工藝的一部分在一些實施方案中，線性ssDNA分子包含使用樣品中的RNA(例如，mRNA或總RNA) 或DNA作模板通過DNA聚合酶延伸第一鏈cDNA合成引物而產(chǎn)生的5，加標(biāo)簽的ssDNA片
32段，其中第一鏈cDNA合成引物包含5’端部分和該3’端部分，其中5’端部分由顯示不與該模板互補(bǔ)的序列的標(biāo)簽組成，并且3’端部分顯示不與該模板互補(bǔ)的序列。在一些實施方案中，使用本發(fā)明的改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和改進(jìn)的連接方法分子內(nèi)連接這些5’加標(biāo)簽的 ssDNA片段。在這些實施方案的一些中，第一鏈cDNA合成引物中的標(biāo)簽包含使用特定的下一代測序儀如Roche 4 測序儀進(jìn)行下一代測序的測序標(biāo)簽域。例如，在一些實施方案中， 本發(fā)明的方法的步驟(b)是通過首先使線性ssDNA分子熱變性隨后使用不依賴模板的連接酶通過進(jìn)行以下反應(yīng)使其環(huán)化而進(jìn)行的
達(dá)到20微升終體積的水
χ
1微升 1微升 4微升 10微升 4微升
330 mM Tris 醋酸鹽 pH 7.8, 660 mM KOAc 50 mM MnCl2
5 M甜菜堿
20 |Lig/ml變性的5’加標(biāo)簽的斷裂DNA 100 υ/ι TS2126 連接酶(CIRCLIGASE II,
EPICENTRE)
20微升終反應(yīng)體積將反應(yīng)在60°C孵育2小時。然后，用18單位的外切核酸酶I和20單位的外切核酸酶III在37°C處理反應(yīng)產(chǎn)物1小時以消除非環(huán)化的線性DNA。環(huán)化的產(chǎn)物沒有被消化。實施例10來自實施例9的加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA的PCR分析使用與包含顯示用于特定的下一代測序儀的序列的測序標(biāo)簽域的標(biāo)簽退火的PCR 引物進(jìn)行PCR分析。使用這些PCR引物的PCR產(chǎn)物證明環(huán)化，因為只有連接的、加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA分子能夠被擴(kuò)增產(chǎn)生與環(huán)狀ssDNA的大小對應(yīng)的線性dsDNA產(chǎn)物。如下進(jìn)行PCR 反應(yīng)
“21微升水
1微升外切核酸酶處理的CircLigase II反應(yīng)(1 1000稀釋) 1微升 5 μΜ PCR引物1 (例如，對于Roche FLX 454銜接子A)1微升 5 μΜ PCR引物2 (例如，對于Roche FLX 454銜接子B ) 1微升FailSafe DNA聚合酶
25 微升 FailSafe 2 χ PCR PreMix C
50微升終反應(yīng)體積在如下條件下進(jìn)行PCR持續(xù)四個循環(huán)
94 °C 10 秒.50 °C 10 秒.72°C1 分鐘.凝膠分析表明產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的大小范圍與5’加標(biāo)簽的斷裂ssDNA相當(dāng)。也進(jìn)行了對照反應(yīng)。當(dāng)連接反應(yīng)中省略CIRCLIGASE II ssDNA連接酶時，沒有從 5’加標(biāo)簽的線性ssDNA片段中產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。當(dāng)從PCR反應(yīng)中省略PCR引物時，沒有產(chǎn)生產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物具有與5’加標(biāo)簽的線性ssDNA片段相同的大小分布的事實表明1)5’加標(biāo)簽的線性ssDNA片段可被熱變性以產(chǎn)生變性的加標(biāo)簽的線性ssDNA片段，該變性的加標(biāo)簽的線性ssDNA片段為不依賴模板的連接的底物；和2) 5，加標(biāo)簽的線性ssDNA片段可被有效轉(zhuǎn)化為加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段而沒有可檢測的偏倚(如在外切核酸酶I和外切核酸酶 III處理后通過PCR擴(kuò)增所證實的)。實施例11對來自Nextera 產(chǎn)生的線性加標(biāo)簽的ssDNA片段的加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA的PCR 分析在一些其他實施方案中，本發(fā)明改進(jìn)的連接方法中使用的線性加標(biāo)簽的ssDNA分子包括使用Nextera 樣品制備試劑盒(EPICENTRE)產(chǎn)生的5，加標(biāo)簽的ssDNA片段；在這些實施方案中，使用Nextera從dsDNA產(chǎn)生包含5，加標(biāo)簽的ssDNA片段的線性加標(biāo)簽的 ssDNA分子，所述dsDNA如基因組dsDNA、線粒體dsDNA或甚至從RNA制備的雙鏈cDNA。在這些實施方案中，使用Nextera試劑盒產(chǎn)生的線性加標(biāo)簽的ssDNA片段具有包含轉(zhuǎn)座子末端標(biāo)簽域和測序標(biāo)簽域的標(biāo)簽。在將使用Nextera獲得5’加標(biāo)簽的ssDNA片段而產(chǎn)生的加標(biāo)簽的dsDNA片段變性后，使用與實施例9中所用的方案類似的方案將這些線性加標(biāo)簽的 ssDNA分子環(huán)化。然后，使用與實施例10中所用的方案類似的方案分析該環(huán)狀產(chǎn)物，除外的是PCR引物1與轉(zhuǎn)座子末端序列互補(bǔ)(例如，與非轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座子末端序列互補(bǔ))，而PCR引物2與Roche 454測序儀銜接子互補(bǔ)(例如，與Roche FLX 454B互補(bǔ))；在PCR后，PCR產(chǎn)物具有與5’加標(biāo)簽的線性ssDNA片段相同的大小分布的事實表明(1)轉(zhuǎn)座子末端組合物具有有效的5’加標(biāo)簽的且斷裂的靶基因組DNA ；2)退火的互補(bǔ)5’加標(biāo)簽的線性ssDNA片段已經(jīng)被熱變性以產(chǎn)生變性的加標(biāo)簽的線性ssDNA片段，該變性的加標(biāo)簽的線性ssDNA片段為不依賴模板的連接的底物；和幻5’加標(biāo)簽的線性ssDNA片段已被有效地轉(zhuǎn)化為加標(biāo)簽的環(huán)狀ssDNA片段而沒有可檢測的偏倚(如在外切核酸酶I和外切核酸酶III處理后通過 PCR擴(kuò)增所證實的)。
權(quán)利要求
1.一種用于線性ssDNA分子的不依賴模板的分子內(nèi)連接的連接反應(yīng)混合物，所述連接反應(yīng)混合物包括(a)具有5，-磷?；?，-羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子；(b)熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的組合物，其中高比例的所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的，并且其中在所述連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子的濃度等于或超過所述ssDNA分子的摩爾濃度；(c)將最終的pH保持在大約pH6. 5和大約pH 8. 0之間的緩沖液；和(d)處于對所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶最適的濃度的錳鹽，其中在所述連接反應(yīng)混合物中的Mn2+陽離子的終濃度在大約0. 5mM和大約IOmM之間；其中，ATP在所述反應(yīng)緩沖液中不存在或者以比所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶的非腺苷酸化形式的濃度小的摩爾濃度存在。
2.如權(quán)利要求1所述的連接反應(yīng)混合物，所述連接反應(yīng)混合物另外包括終濃度在大約 0. 25M至大約2M的甜菜堿(兩性離子的三甲基甘氨酸)。
3.一種用于具有5’ -磷?；?’ -羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子的不依賴模板的分子內(nèi)連接來合成環(huán)狀ssDNA分子的方法，所述方法包括(1)制備權(quán)利要求1任一項所述的連接反應(yīng)混合物；和(2)在大約40°C至大約70°C的反應(yīng)溫度在所述連接反應(yīng)混合物中孵育所述線性ssDNA分子持續(xù)足夠的時間，其中合成環(huán)狀ssDNA分子。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述不依賴模板的熱穩(wěn)定的RNA連接酶選自由以下組成的組棲熱菌屬(Thermus)噬菌體RNA連接酶；噬菌體TS2U6RNA連接酶；古細(xì)菌RNA 連接酶；嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌(Me thanobacterium thermoautotrophicum)RNA 連接酶 1。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，所述方法還包括(1)制備所述連接反應(yīng)混合物，所述連接反應(yīng)混合物包括(a)所述具有5’-磷?；?’ -羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子；(b)噬菌體TS2U6熱穩(wěn)定的RNA連接酶的組合物，其中彡60%的所述熱穩(wěn)定的RNA連接酶分子為腺苷酸化的并且以如下的量存在其中在所述連接反應(yīng)混合物中的腺苷酸化的 RNA連接酶分子的摩爾濃度等于或超過所述線性ssDNA分子的摩爾濃度；和(c)所述緩沖劑；(d)提供終濃度在大約0.5mM和IOmM之間的Mn2+陽離子的錳鹽；和(2)在大約55°C和大約65°C之間的溫度孵育所述連接反應(yīng)混合物持續(xù)足夠的時間，其中從所述線性ssDNA分子產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA分子。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述連接反應(yīng)混合物另外包含終濃度為0.25M至2M 的甜菜堿(兩性離子的三甲基甘氨酸)。
7.如權(quán)利要求3-6中任一項所述的方法，其中所述線性ssDNA分子包括線性ssDNA分子的群體或由線性ssDNA分子的群體組成，其中5’端或3’端的核苷酸序列是未知的和/ 或其中所述線性ssDNA分子大小不同。
8.如權(quán)利要求3-7中任一項所述的方法，其中在用于分子內(nèi)連接的所述方法中使用的所述具有5’ -磷酰基和3’ -羥基基團(tuán)的線性ssDNA分子包括線性第一鏈cDNA分子的群體或由線性第一鏈cDNA分子的群體組成，所述線性第一鏈cDNA分子是通過使用DNA聚合酶延伸與由生物樣品中的一個或多個靶核酸分子展示的互補(bǔ)序列退火的一個或多個第一鏈cDNA合成引物而產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過延伸一個或多個第一鏈cDNA合成引物而產(chǎn)生的所述線性第一鏈cDNA分子通過如下方式進(jìn)一步純化通過使用特異性消化所述靶核酸分子但不消化所述線性第一鏈cDNA分子的核酸酶除去所述靶核酸分子，或者通過將親和標(biāo)簽摻入所述線性第一鏈cDNA分子中并使用與所述親和標(biāo)簽形成特異性結(jié)合對的親和性結(jié)合物質(zhì)將所述線性第一鏈cDNA分子拉出，來從所述靶核酸分子中選擇性純化所述線性第一鏈cDNA分子，所述親和性結(jié)合物質(zhì)與表面相連。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一個或多個第一鏈cDNA合成引物中的每一個都包括5’端部分，所述5’端部分包含顯示基本上不與所述靶核酸分子中的序列互補(bǔ)的序列的標(biāo)簽或者由顯示基本上不與所述靶核酸分子中的序列互補(bǔ)的序列的標(biāo)簽組成；以及 3’端部分，所述3’端部分顯示與來自生物樣品的至少一個靶核酸分子所顯示的序列互補(bǔ)的序列。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述一個或多個第一鏈cDNA合成引物的5’端部分中的標(biāo)簽包括一個或多個標(biāo)簽域或者由一個或多個標(biāo)簽域組成，所述標(biāo)簽域選自由以下組成的組顯示正義啟動子序列的RNA聚合酶啟動子標(biāo)簽域；切割位點標(biāo)簽域；序列特異性測序標(biāo)簽域；捕獲標(biāo)簽域；擴(kuò)增標(biāo)簽域；檢測標(biāo)簽域；和地址標(biāo)簽域。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第一鏈cDNA合成引物包括含一個或多個不同標(biāo)簽域的標(biāo)簽或者由含一個或多個不同標(biāo)簽域的標(biāo)簽組成，所述一個或多個第一鏈cDNA 合成引物各自包含在所述第一鏈cDNA的標(biāo)簽域之間或在其5’端部分與其3’端部分之間的切割位點，并且所述方法還包括步驟(3)使所述環(huán)狀第一鏈cDNA分子在所述切割位點處線性化以獲得各自在5’端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的3’端部分的序列并且在3’ 端顯示所述第一鏈cDNA合成引物的5’端部分的序列的線性第一鏈cDNA分子。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一個或多個第一鏈cDNA合成引物的5’端部分包括如下標(biāo)簽或由如下標(biāo)簽組成所述標(biāo)簽包含顯示正義啟動子序列的RNA聚合酶啟動子標(biāo)簽域和位于所述正義啟動子序列的3’ -的切割位點，或者由顯示正義啟動子序列的 RNA聚合酶啟動子標(biāo)簽域和位于所述正義啟動子序列的3’ -的切割位點組成，并且其中所述方法還包括如下子步驟(i)使顯示反義啟動子序列的寡脫氧核糖核苷酸與所述正義啟動子序列在來自步驟C3)的每一個所述線性第一鏈cDNA分子的3’端退火以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄底物， 以及隨后(ii)使用結(jié)合所述雙鏈RNA聚合酶啟動子并由此啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄所述轉(zhuǎn)錄底物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，在子步驟(ii)之前，所述方法還包括通過使用 DNA聚合酶延伸顯示反義啟動子序列的所述寡脫氧核糖核苷酸來產(chǎn)生雙鏈cDNA的子步驟。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述一個或多個第一鏈cDNA合成引物的5’端部分包括如下標(biāo)簽或由如下標(biāo)簽組成所述標(biāo)簽包含兩個測序儀特異性測序標(biāo)簽域或由兩個測序儀特異性測序標(biāo)簽域組成，并且步驟C3)產(chǎn)生在5’端和3’端各具有一個測序標(biāo)簽域的線性ssDNA測序模板(加雙標(biāo)簽的測序模板)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述在5’端和3’端各具有一個測序標(biāo)簽域的線性ssDNA測序模板用作在所述測序標(biāo)簽域?qū)ζ涮禺惖南乱淮鷾y序儀上測序的模板。
17.如權(quán)利要求3-11中任一項所述的方法，所述方法還包括通過選自以下的方法擴(kuò)增環(huán)狀ssDNA分子滾環(huán)復(fù)制、滾環(huán)轉(zhuǎn)錄和PCR。
18.如權(quán)利要求3-11中任一項所述的方法，所述方法還包括使用所述環(huán)狀ssDNA分子作為模板用于大規(guī)模平行測序。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于使用例如熱穩(wěn)定的RNA連接酶對線性ssDNA進(jìn)行改進(jìn)的不依賴模板的分子內(nèi)連接(環(huán)化)的連接反應(yīng)混合物、方法和試劑盒，所述線性ssDNA包括變性的gDNA片段或通過RNA的反轉(zhuǎn)錄制備的第一鏈cDNA。使用所改進(jìn)的連接反應(yīng)混合物和方法獲得的環(huán)狀ssDNA分子可例如用作如下的模板用于通過反向PCR、滾環(huán)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄來擴(kuò)增的模板，或者用于大規(guī)模平行DNA測序的模板。應(yīng)用包括，例如對于諸如人類醫(yī)學(xué)或動物醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)或農(nóng)業(yè)目的用于研究、篩選、醫(yī)學(xué)診斷、治療診斷、個性化醫(yī)學(xué)治療或育種的通過qPCR或使用微陣列的基因表達(dá)分析；gDNA拷貝數(shù)變異的分析；以及特定核酸序列的檢測或定量。
文檔編號C12Q1/68GK102317475SQ201080007788
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
發(fā)明者喬安妮·德克爾, 加力·大鹿, 杰羅馬·箭之撒 申請人:阿霹震中科技公司