專利名稱：用于干細胞培養(yǎng)的灌流裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種用于細胞培養(yǎng)的灌流裝置，特別涉及一種用于胚胎干細胞培 養(yǎng)的灌流裝置。
背景技術：
20世紀50年代，科學家在畸形胎瘤中首次首次發(fā)現了胚胎干細(embryonic StemCell，ES細胞)，從此開創(chuàng)了干細胞生物學研究的歷程。干細胞的研究與應用幾乎涉及 所有生命科學和生物醫(yī)學領域，是當今生命科學領域的熱點和重點。干細胞能自我更新和 多向分化的生物學特性使得干細胞研究在動物克隆、新型高效藥物的開發(fā)和腫瘤臨床治療 等方面有著廣泛的應用前景。在胚胎干細胞體外培養(yǎng)中，除了正常的培養(yǎng)基外，需要先培養(yǎng)一層特殊的細胞 (如小鼠胚胎成纖維-mouse embryonic fibroblast MEF細胞等)，然后再在其上接種要 實驗的干細胞。這些特殊的細胞就是飼養(yǎng)層細胞，通常是成纖維類細胞，這些細胞可以分 泌一些未知的必須生長因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor，LIF)、干細 胞因子(stem cell factor, SCF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast growth factor, bFGF)等，提供胚胎干細胞、誘導多能干細胞更好的營養(yǎng)。這些因子對干細胞的存 活和增殖是必需的，不僅可以使其數量增加，而且與干細胞在體內外的分化有關。實驗證 明，飼養(yǎng)層細胞的作用不僅僅是產生了一些細胞因子，在大多數細胞發(fā)育和分化過程中，細 胞的黏附作用都發(fā)揮了相當重要的作用。ES細胞不能作為完全獨立的細胞而生存，總是與 周圍的細胞相聯系著，在信號傳導中的黏附受體調節(jié)著細胞的運動、增殖和分化。通常在胚胎干細胞/誘導多能干細胞培養(yǎng)體系下，飼養(yǎng)層細胞與干細胞處于共培 養(yǎng)狀態(tài)，兩者無法分離徹底。如果采用飼養(yǎng)層與干細胞分別靜態(tài)培養(yǎng)的方式，無法實時將飼 養(yǎng)層細胞分泌的因子傳送到干細胞培養(yǎng)體系內，且操作過程多，大多不被采用。傳統(tǒng)共培養(yǎng) 方式影響干細胞純度，已在干細胞應用等方面起到了很大的限制作用。

實用新型內容本實用新型的目的在于克服現有培養(yǎng)體系的不足，提供一種既可滿足干細胞的獨 立培養(yǎng)環(huán)境，以保證細胞純度，又避免參雜飼養(yǎng)層細胞影響的用于干細胞培養(yǎng)的灌流裝置。本發(fā)明提供的用于干細胞培養(yǎng)的灌流裝置，包括灌流瓶和廢液瓶，還包括飼養(yǎng)層 細胞培養(yǎng)反應器以及待培養(yǎng)細胞灌流槽；所述飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器包括帶有進液口和出 液口的飼養(yǎng)層細胞灌流槽和與所述出液口相連通的連通管；所述連通管與所述待培養(yǎng)細胞灌流槽相連通，所述灌流瓶與所述飼養(yǎng)層細胞灌流 槽的進液口之間以及所述待培養(yǎng)細胞灌流槽與所述廢液瓶之間均通過管道相連通；所述飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器內設置有能阻止飼養(yǎng)層細胞進入待培養(yǎng)細胞灌流槽 的過濾裝置。該過濾裝置可以實現飼養(yǎng)層細胞和待培養(yǎng)細胞是分開培養(yǎng)，也即這樣飼養(yǎng)層 細胞分泌的細胞因子等都可以隨同培養(yǎng)液一起進入待培養(yǎng)細胞灌流槽中，同時又可以阻止
3飼養(yǎng)層細胞和其它雜細胞進入待培養(yǎng)細胞灌流槽中。在一種實施方式中，上述過濾裝置為孔徑大小能阻止飼養(yǎng)層細胞穿過但能實現液 體通過的半透膜，所述半透膜設置在所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽內。如果所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽內設置有細胞培養(yǎng)板，而所述半透膜設置在所述細胞 培養(yǎng)板的上方，所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口和出液口設置在所述半透膜的上方。這樣 飼養(yǎng)層細胞就可留在所述半透膜的下方，其培養(yǎng)液可以通過出液口進入下一步的待培養(yǎng)細 胞灌流槽中。如果所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽內設置有細胞培養(yǎng)板，而所述半透膜設置在所述細胞 培養(yǎng)板的下方，所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口和出液口設置在所述半透膜的下方。這樣 飼養(yǎng)層細胞就可留在所述半透膜的上方，其培養(yǎng)液可以通過出液口進入下一步的待培養(yǎng)細 胞灌流槽中。在另一種實施方式中，上述過濾裝置可以為孔徑大小能阻止飼養(yǎng)層細胞穿過但能 實現液體通過的半透膜，并且該半透膜設置在所述連通管內的；在又一實施方式中，該半透 膜可設置在所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的出液口處。當然，該半透膜也可設置在所述代培養(yǎng)細胞灌流槽的進液口。上述灌流瓶與廢液瓶的瓶蓋上均可設有穿過所述瓶蓋的氣體濾頭。這樣可以使得 罐流瓶以及廢液瓶內的壓強與外界相同，并且可以隔絕外界空其中的細菌污染。上述灌流瓶的瓶蓋上可設有穿過所述瓶蓋的pH計。pH計的測量端與灌流瓶內培 養(yǎng)基接觸，這樣可實時監(jiān)控灌流瓶內培養(yǎng)基的PH變化情況。上述灌流瓶與所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口之間的管道上設置一個蠕動泵；所 述待培養(yǎng)細胞灌流槽和廢液瓶之間的管道上設置一個蠕動泵。這樣控制培養(yǎng)基液體在微灌 流裝置中的流速以適應細胞的營養(yǎng)需求，可控制液體的流速是0. 02-0. 45ml/h。在一實施例中中，上述待培養(yǎng)細胞灌流槽的底部可設有一層基質如明膠或 Matrigel基質，有利于細胞貼壁生長。在另一實施例中，上述待培養(yǎng)細胞灌流槽內可設置有細胞培養(yǎng)板。該細胞培養(yǎng)板 可以是現有技術中的細胞培養(yǎng)板。上述待培養(yǎng)細胞具體可以是指胚胎干細胞。本實用新型在使用時，把用于干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基裝于灌流瓶1中，灌流瓶1通過 裝設在其上端的氣體濾頭2與外界空氣相通，灌流瓶1中的pH計3對瓶中培養(yǎng)基的pH進 行實時監(jiān)控；灌流瓶1中的培養(yǎng)基通過蠕動泵5流經輸入管4輸送到飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應 器6內，為飼養(yǎng)層細胞提供營養(yǎng)，胚胎干細胞接種于待培養(yǎng)細胞罐流槽9中，飼養(yǎng)層細胞分 泌的因子和培養(yǎng)液組成條件培養(yǎng)基通過連通管8被傳送到待培養(yǎng)細胞罐流槽9中供干細胞 生長，干細胞生長使用后的培養(yǎng)基通過輸出管13輸送到廢液瓶12中收集。本實用新型的灌流裝置，不僅可以滿足干細胞克隆的獨立培養(yǎng)環(huán)境，而且可以保 證干細胞純度，避免參雜飼養(yǎng)層細胞影響干細胞應用，再者可通過液體流動及時排除細胞 代謝毒物，更好的模擬體內環(huán)境，防止細胞代謝物堆積導致的細胞分化，促進干細胞生長。 同時本實用新型也可用于干細胞分化研究，飼養(yǎng)層細胞灌流槽內如培養(yǎng)目的分化細胞，其 所釋放的相關因子可通過灌流裝置流入待培養(yǎng)的干細胞灌流槽，影響干細胞分化。本實用新型又由于其操作相對簡便，可重復性強，較傳統(tǒng)模式減少了較多的操作環(huán)節(jié)，降低了污染和飼養(yǎng)層細胞參雜的機會，利于干細胞生長，為干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供 參考價值。

圖1為本實用新型實施例1的結構示意圖。圖號說明1灌流瓶，2、11氣體濾頭，3pH計，4輸入管，5、10蠕動泵，6飼養(yǎng)層細胞 培養(yǎng)反應器，7嵌入式過濾膜，8連通管，9待培養(yǎng)細胞灌流槽，12廢液瓶，13輸出管，14飼養(yǎng) 層細胞灌流槽。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本實用新型作進一步說明，但本實用新型并不限于以下實 施例。實施例1如圖1所示，一種用于細胞培養(yǎng)的微灌流裝置，包括灌流瓶1和廢液瓶12。灌流瓶 1的瓶蓋與廢液瓶12的瓶蓋上分別設有穿過各自瓶蓋的氣體濾頭2和11，這樣可以使得罐 流瓶1以及廢液瓶12內的壓強與外界相同，并且可以隔絕外界空其中的細菌污染。灌流瓶 1上還設有穿過灌流瓶的瓶蓋的PH計3，pH計3的測量端與灌流瓶內培養(yǎng)基接觸，這樣可 實時監(jiān)控灌流瓶內培養(yǎng)基的PH變化情況。如圖1所示，本發(fā)明提供的灌流裝置還包括飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器6和待培養(yǎng)細 胞灌流槽9。飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器6包括飼養(yǎng)層細胞灌流槽14以及連通管8。飼養(yǎng)層細 胞灌流槽14的兩端分別設有出液口和進液口。飼養(yǎng)層細胞灌流槽14內部設有細胞培養(yǎng)板。該進液口與灌流瓶1之間通過輸入管4連通，這樣既可將灌流瓶1與飼養(yǎng)層細胞 培養(yǎng)反應器6相連通；該出液口與連通管8相連通。該連通管8與待培養(yǎng)細胞灌流槽9是 相連通的。待培養(yǎng)細胞灌流槽9與所述廢液瓶12之間通過輸出管13相連通。本發(fā)明的優(yōu)點是飼養(yǎng)層細胞和待培養(yǎng)細胞是分開培養(yǎng)的。飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器 6內設置有能阻止飼養(yǎng)層細胞進入待培養(yǎng)細胞灌流槽9的過濾裝置。這樣飼養(yǎng)層細胞分泌 的細胞因子等都可以隨同培養(yǎng)液一起進入待培養(yǎng)細胞灌流槽9中，同時又可以阻止飼養(yǎng)層 細胞和其它雜細胞進入待培養(yǎng)細胞灌流槽9中。該過濾裝置具體可以孔徑大小能阻止飼養(yǎng)層細胞穿過但能實現液體通過的半透膜。該半透膜是設置在飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器6的飼養(yǎng)層細胞灌流槽14內的嵌入式 過濾膜7。如果嵌入式過濾膜7設置在飼養(yǎng)層細胞灌流槽14內細胞培養(yǎng)孔板的上方，飼養(yǎng) 層細胞灌流槽14的進液口和出液口應該設置在嵌入式過濾膜7的上方。這樣飼養(yǎng)層細胞 就可以被阻擋在嵌入式過濾膜7的下方，其培養(yǎng)液可以通過出液口進入下一步的待培養(yǎng)細 胞灌流槽9中；如果嵌入式過濾膜7設置在飼養(yǎng)層細胞灌流槽14內細胞培養(yǎng)孔板的下方， 飼養(yǎng)層細胞灌流槽14的進液口和出液口應該設置在嵌入式過濾膜7的下方。這樣飼養(yǎng)層 細胞就可以被阻擋在嵌入式過濾膜7的上方，其培養(yǎng)液可以通過出液口進入下一步的待培 養(yǎng)細胞灌流槽9中。在本實施例中，優(yōu)選是將帶有飼養(yǎng)層細胞的細胞培養(yǎng)孔板置于嵌入式 過濾膜7的下方培養(yǎng)。[0033]當然，在另一實施例中，該過濾裝置具體還可以是設置在飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器 6的連通管8內的半透膜，該半透膜的孔徑大小也能阻止飼養(yǎng)層細胞穿過但能實現液體通 過。如果本發(fā)明提供的微灌流裝置是培養(yǎng)胚胎干細胞的，那么待培養(yǎng)細胞灌流槽9內 裝的就是胚胎干細胞。待培養(yǎng)細胞灌流槽9內可鋪有Matrigel基質(一種從小鼠腫瘤細 胞中提取出的凝膠，包含細胞外基質ECMs，為干細胞生長提供支架)，也可設置一個現有技 術中的細胞培養(yǎng)板。在本實施例中，為了更好地實現細胞貼壁，在待培養(yǎng)細胞灌流槽9內鋪 的是Matrigel基質。為了控制培養(yǎng)基液體在灌流裝置中的流速以適應細胞的營養(yǎng)需求，可在輸入管4 和輸出管13上分別設置蠕動泵5和10，可控制液體的流速是0. 02-0. 45ml/h。本實用新型在使用時，把用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基裝于灌流瓶1中，灌流瓶1通過裝 設在其上端的氣體濾頭2與外界空氣相通，灌流瓶1中的pH計3對瓶中培養(yǎng)基的pH進行 實時監(jiān)控；灌流瓶1中的培養(yǎng)基通過蠕動泵5流經輸入管4輸送到飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器 6內，為飼養(yǎng)層細胞提供營養(yǎng)，胚胎干細胞接種于待培養(yǎng)細胞罐流槽9中，飼養(yǎng)層細胞分泌 的因子和培養(yǎng)液組成條件培養(yǎng)基通過連通管8被傳送到待培養(yǎng)細胞罐流槽9中供干細胞生 長，干細胞生長使用后的培養(yǎng)基通過輸出管13輸送到廢液瓶12中收集。以上所述之實施方式為本實用新型的實施案例之一，并非以此限制本實用新型的 實施范圍，故凡依本實用新型之形狀、構造及原理所做的等效變化，均應涵蓋在本實用新型 的保護范圍內。
權利要求用于干細胞培養(yǎng)的灌流裝置，包括灌流瓶和廢液瓶，其特征在于所述灌流裝置還包括飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器以及待培養(yǎng)細胞灌流槽；所述飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器包括帶有進液口和出液口的飼養(yǎng)層細胞灌流槽和與所述出液口相連通的連通管；所述連通管與所述待培養(yǎng)細胞灌流槽相連通，所述灌流瓶與所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口之間以及所述待培養(yǎng)細胞灌流槽與所述廢液瓶之間均通過管道相連通；所述飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器內設置有能阻止飼養(yǎng)層細胞進入待培養(yǎng)細胞灌流槽的過濾裝置。
2.根據權利要求1所述的灌流裝置，其特征在于所述過濾裝置為孔徑大小能阻止飼 養(yǎng)層細胞穿過但能實現液體通過的半透膜，所述半透膜設置在所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽內。
3.根據權利要求2所述的灌流裝置，其特征在于所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽內設置有細 胞培養(yǎng)板，所述半透膜設置在所述細胞培養(yǎng)板的上方，所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口和 出液口設置在所述半透膜的上方。
4.根據權利要求2所述的灌流裝置，其特征在于所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽內設置有細 胞培養(yǎng)板，所述半透膜設置在所述細胞培養(yǎng)板的下方，所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口和 出液口設置在所述半透膜的下方。
5.根據權利要求1所述的灌流裝置，其特征在于所述過濾裝置為孔徑大小能阻止飼 養(yǎng)層細胞穿過但能實現液體通過的半透膜；所述半透膜設置在所述連通管內的。
6.根據權利要求2-5中任一所述的灌流裝置，其特征在于所述灌流瓶與廢液瓶的瓶 蓋上均設有穿過所述瓶蓋的氣體濾頭。
7.根據權利要求6所述的灌流裝置，其特征在于所述灌流瓶的瓶蓋上設有穿過所述 瓶蓋的PH計。
8.根據權利要求7所述的灌流裝置，其特征在于所述灌流瓶與所述飼養(yǎng)層細胞灌流 槽的進液口之間的管道上設置一個蠕動泵；所述待培養(yǎng)細胞灌流槽和廢液瓶之間的管道上 設置一個蠕動泵。
9.根據權利要求8所述的灌流裝置，其特征在于所述待培養(yǎng)細胞灌流槽的底部鋪設有一層基質。
10.根據權利要求8所述的灌流裝置，其特征在于所述待培養(yǎng)細胞灌流槽內設置有細 胞培養(yǎng)板。
專利摘要本實用新型公開了一種用于干細胞培養(yǎng)的灌流裝置。該灌流裝置包括灌流瓶和廢液瓶，還包括飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器以及待培養(yǎng)細胞灌流槽；所述飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器包括帶有進液口和出液口的飼養(yǎng)層細胞灌流槽和與所述出液口相連通的連通管；所述連通管與所述待培養(yǎng)細胞灌流槽相連通，所述灌流瓶與所述飼養(yǎng)層細胞灌流槽的進液口之間以及所述待培養(yǎng)細胞灌流槽與所述廢液瓶之間均通過管道相連通；所述飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)反應器內設置有能阻止飼養(yǎng)層細胞進入待培養(yǎng)細胞灌流槽的過濾裝置。本實用新型既可滿足干細胞的獨立培養(yǎng)環(huán)境，以保證干細胞純度，又避免參雜飼養(yǎng)層細胞影響，較傳統(tǒng)模式減少了較多的操作環(huán)節(jié)，降低了污染和飼養(yǎng)層細胞參雜的機會。
文檔編號C12M3/06GK201626960SQ2010201069
公開日2010年11月10日 申請日期2010年2月1日 優(yōu)先權日2010年2月1日
發(fā)明者李奎, 牟玉蓮, 王皓, 石放雄, 齊念民 申請人:中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所;上海博因生物技術有限公司