專利名稱：復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，屬于酶工程和農產品加工技術領域。
背景技術：
脫脂小麥胚芽蛋白質含量高達38%左右，是一種全價蛋白，它含有人體必需的8 種氨基酸和2種半必需氨基酸，占總氨基酸34. 74%。小麥胚芽蛋白質中必需氨基酸相互比值與FA0/WH0推薦模式值及大豆、牛肉、雞蛋氨基酸構成比例基本接近，明顯優(yōu)于大米、面粉蛋白質中必需氨基酸構成比例，有很好氨基酸平衡，在營養(yǎng)學上具有重要意義。在科研文獻報道中，小麥胚中谷胱甘肽的含量豐富，位于所有含谷胱甘肽的谷物原料之首。谷胱甘肽能夠清除人體內的自由基，清潔和凈化人體內的環(huán)境污染，從而增進人的身心健康。國內外研究發(fā)現(xiàn)小麥胚芽蛋白生產制備的ACE抑制肽活性高、含量多、被認為是開發(fā)ACE抑制活性肽最具潛力的食物蛋白源；另外麥胚蛋白多肽中還含有阿片活性肽，其主要功能有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛；保護心血管、保護心??；增強免疫力；調節(jié)胃腸運動；增強記憶力；調節(jié)內分泌、調節(jié)精神情緒、調整睡眠等作用。目前提取谷物蛋白的方法主要有堿提和酶解法。堿提主要是利用水作為蛋白質的提取劑，通過調節(jié)水的PH來提取蛋白質，通常將溶液的pH調到9以上對小麥胚芽進行浸提。但在高堿性PH值和加熱的條件下，蛋白質分子間相互作用會生成賴氨酰丙氨酸，對動物呈毒性反應。酶法抽提小麥胚芽蛋白是利用蛋白酶對小麥胚芽蛋白的水解和修飾作用， 使其變成可溶的肽類而被提取出來，酶法水解生產蛋白條件溫和，提取率較高，部分蛋白質分解成多種氨基酸和許多小肽段，口感較好，可作為消化系統(tǒng)功能不健全特定人群(老年人、嬰兒等)膳食蛋白來源。以往的研究中只選用單一酶，提取率不高且酶用量大。我國小麥胚芽資源量在10萬噸以上，但由于多種因素制約，至今仍未能得到充分合理利用，大部分被當作麩皮處理。同時，近年來小麥胚芽豐富的營養(yǎng)保健成分和具有突出生理功能的活性物質受到國內外研究者的重視，相關的研究日益深入。因此，加速這一資源的研究開發(fā)，提高麥胚蛋白的利用率，更加科學合理地利用麥胚，對于緩解我國十分緊缺的蛋白和油脂資源，豐富我國營養(yǎng)、保健食品的種類，提高我國人民的膳食營養(yǎng)與健康水平， 提高企業(yè)的經(jīng)濟效益，具有十分重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一種復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法。該方法以脫脂小麥胚芽為原料，首先對其進行脫糖，脫糖后離心分離；得到的固形物用復合酶對其進行水解，然后調節(jié)溶液的PH8 9進行堿提，堿提后進行離心分離；離心分離后上清液通過膜進行分離，通過最小分子量膜的液體再進行透析脫鹽；各級分離物采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。本發(fā)明的技術方案是復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，包括粉碎、脫糖、復合酶水解、堿提、膜分離、透析脫鹽、雙效濃縮和噴霧干燥。具體步驟如下1)脫脂小麥胚芽粉碎，過80 100目篩；稱取粉碎后的脫脂小麥胚芽加入容器中，加入其質量5 8倍的水，攪勻后于75 85°C水浴0. 8 1. 2小時進行脫糖；2)離心分離棄上清，加入水使底物濃度為3 6% (g/Ι)，然后加入食品級的鹽酸調節(jié)溶液的PH值為6 7 ；溫度40 60°C下，將中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例 2 1 1 2添加到溶液中，加酶量為400 600U/g底物，酶解90 120min ；3)使用食品級氫氧化鈉將酶解液的pH值調到8 9，在40 50°C浸提0. 8 1. 2 小時；4) 4500 5500rap/min離心12 18min，得到混合肽酶解液；5)將得到的混合肽酶解液分別經(jīng)過麗2000、MW600和麗300的聚砜膜分離，得到不同分子量大小的多肽溶液；6)將通過MW300聚砜膜的液體進行透析脫鹽；7)將步驟5)和6)得到的各級分離物(步驟5)未通過麗2000聚砜膜的液體、通過麗2000聚砜膜但未通過MW600聚砜膜的液體、通過MW600聚砜膜但未通過麗300聚砜膜的液體和步驟6)透析脫鹽的通過MW300聚砜膜的液體)分別采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。噴霧干燥的條件為料液濃度為30-35wt%，料液溫度為 55 65°C，流量為130 170ml/h，進口溫度為180 200°C，出口溫度為60 70°C。上述制得的蛋白質含量測定方法為利用R)lin-酚試劑法。本發(fā)明的有益效果1、脫脂小麥胚芽粕，原料易得，來源廣泛；2、利用復合酶水解蛋白時，酶的添加量為400U/g底物時，麥胚蛋白的提取率達到了 94.56wt%，生產1噸麥胚蛋白多肽，加入酶的成本為130-150元。而現(xiàn)有報導的麥胚蛋白最高提取率為92. 43wt %，其中只使用木瓜蛋白酶，且加酶量為3000U/g溶液，其生產1噸麥胚蛋白多肽，加入酶的成本為640-660元。因此，利用復合酶提高了麥胚蛋白的提取率， 同時降低酶的用量，節(jié)省了成本，提高了經(jīng)濟效益。3、結合堿提，使提取更徹底，使其提取率達到94. 56wt%且防止了純堿提取需要高的PH帶來的負面影響；4、通過膜分離的控制得到了不同分子量且純度較高的肽。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明的方法作進一步說明，但不限于此。實施例中使用的脫脂小麥胚芽由山東廣明實業(yè)有限公司提供，蛋白含量為36. 5wt%，脂肪含量為 2. 90-3. 20wt %。各種蛋白酶均由山東省發(fā)酵設計院提供。實施例11)蛋白酶的選擇本實驗從木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶四種蛋白酶中選出兩種酶對脫脂后的小麥胚芽蛋白進行水解。按照每種蛋白酶的最適反應條件水解蛋白，用R)lin-酚法測水解液中蛋白質的含量。四種蛋白酶水解麥胚蛋白的提取率分別為83. 56wt%,76. 84wt%,76. 55wt%,87.但是，由于堿性蛋白酶水解得到的水解液略
有苦味，不適宜食用。而且，菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶比較來看，其提取率相差不大。從經(jīng)濟角度考慮，中性蛋白酶的添加量較菠蘿蛋白酶少，且價格較便宜，最終選擇木瓜蛋白酶和中性蛋白酶作為制備麥胚生物活性肽的酶。2)最佳復合酶配比的選擇將木瓜蛋白酶與中性蛋白酶以2 1、1 1、1 2和1 3的酶活比例配比混合， 加酶量為500U/g，在55°C，pH為6，底物濃度為8% (g/Ι)的條件下水解2小時，測其水解中多肽的含量，得出粗提率。蛋白質的提取率隨著木瓜蛋白酶與中性蛋白酶配比的不同而不同，其提取率分別為87. (Mwt %，90. 23wt %，84. 16wt %和81. 78wt %。實驗結果表明，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的配比為11時提取率最高。3)最佳胚芽顆粒度的選擇原料粒度的大小直接決定原料的比表面積，進而影響酶與底物的接觸和作用過程，原料直徑愈小，直徑方向上的尺寸對酶的作用阻礙愈小，酶分子的流動阻礙愈小，酶與原料接觸愈充分，酶解速度就愈快。實驗結果表明隨著粒度的減小提取率逐漸增加，但當粒度減小到80目以上時，提取率增加趨于平緩。由于粒度越小，粉碎的強度越大，由于局部過熱導致蛋白質變性的可能性也越大，同時耗能也越大，而且100目篩下物較少。4)最佳提取溫度的選擇每種酶都有各自的最適水解溫度，木瓜蛋白酶為60°C，中性蛋白酶為55°C。為了探索混合酶的最適反應溫度，取20g過80目的脫脂麥胚5份于燒杯中，在加酶量為500U/ g底物，木瓜蛋白酶中性蛋白酶酶活比例為1 1，PH為6，底物濃度為8% (g/Ι)，分別在40°C，45°C，50°C，55°C，60°C條件下水解2小時，多肽的提取率分別為83. 66wt %， 86. 94wt%,91. 04wt%,88. 01襯％和85. (Mwt%。實驗結果表明隨著溫度的升高提取率逐漸增大，但當溫度升高至50°C以后，隨著溫度的繼續(xù)升高提取率逐漸下降，因此將實驗的最適反應溫度定為50°C。5)最佳提取pH的選擇取20g脫脂麥胚(過80目)于燒杯中，在50°C，pH分別為4、5、6、7、8的條件下水解池，加酶量和底物濃度同上。通過i^olin-酚法測得的水解液中多肽含量及提取率分別為 67. 85wt%,76. 31wt%,89. 56wt%,91. 74wt%禾口 83. 37wt%0 結果表明隨著 pH 的升高， 提取率也逐漸升高，當pH為6和7時提取率較高，且相差并不大。隨著pH的繼續(xù)增大，提取率卻隨之減小，因此，將實驗的最佳PH確定為6-7之間。6)最佳提取時間的選擇分別取20g脫脂麥胚(過80目)于燒杯中，在50°C，pH為6，底物濃度為8% (g/ 1)，加酶量同上的條件下水解45min、60min、90min、120min和180min，得到蛋白提取率分別為 65. 64wt%,84. 90wt%,90. 63wt%，9099wt%* 91. 23wt%。實驗結果表明提取的蛋白質含量從開始的30min起呈明顯的上升趨勢，但到90min基本達到穩(wěn)定，過分長的提取時間是無效的。這是因為木瓜蛋白酶和中性蛋白酶是內切酶，在反應初期，大量的肽鍵可同時被其水解，但隨著水解時間的推移，水解液中可被蛋白酶水解的肽鍵的濃度逐漸減少，同時酶活性也會隨水解進程而逐漸減弱，加之酶本身也是蛋白質，也有被水解的可能。因此，將實驗的最佳提取時間定為90min。7)最佳底物濃度的選擇分別取20g脫脂麥胚(過80目)于燒杯中，在50°C，pH為6，底物濃度分別為10% (g/l)>8% (g/l),5% (g/1)和3% (g/1)，加酶量同上的條件下水解90min，蛋白質的提取率分別為73. 84wt%,86. 49wt%,91. 2Iwt%^P 91. 59wt%0實驗結果表明隨著底物濃度的降低，提取率逐漸升高，且當?shù)陀?% (g/1)后提取率升高更加緩慢，但這一條件不僅影響到蛋白質的得率，同時也考慮生產成本的合理性，從經(jīng)濟角度考慮，將最佳的底物濃度定為 5% (g/1)。8)最佳添酶量的選擇分別取20g脫脂麥胚(過80目)于燒杯中，在50°C，pH為6，底物濃度為5% (g/Ι)， 加酶量分別為250U/g底物、350U/g底物、400U/g底物、450U/g底物、500U/g底物和600U/ g 底物，水解 90min,蛋白的提取率分別為 66. 85wt%，78. 49wt%,91. IOwt%，90. 5wt 5%, 89. 86wt%和90. Hwt%。實驗結果表明加酶量的增加使提取率趨于直線增加，但當加酶量增加到400U/g底物后，提取率基本趨于平穩(wěn)，因此最佳添酶量為400U/g底物，其用量均比各單一酶的添加量少。原因可能是當酶增加到一定量時酶分子已被底物充分結合達到飽和狀態(tài)，此時再增加酶用量也是無用的。9)多肽粉的制備以上的實驗得到了酶解脫脂麥胚的最佳配方，在該配方的條件下酶解麥胚后， 將酶解液的PH調到8-9之間，45°C堿提lh，5000rap/min離心15min后得到水解液。用 !7Olin-酚法測水解液中蛋白質的含量。蛋白質的提取率為94. 56wt %，然后將得到的混合肽酶解液分別經(jīng)過麗2000、MW600和麗300的聚砜膜分離，得到不同分子量大小的多肽溶液；將通過麗300膜的液體進行分級透析脫鹽；得到的各級分離物。未通過麗2000聚砜膜的液體、通過MW2000聚砜膜但未通過MW600聚砜膜的液體、通過MW600聚砜膜但未通過麗300聚砜膜的液體和透析脫鹽的通過麗300聚砜膜的液體分別采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉，測得分子量從大到小的分離物的蛋白質的純度分別為 96. 74wt%,95. lwt%,95. 8wt%,89. 64wt%。實施例21)脫脂小麥胚芽粉碎成粉狀，過80目篩。稱取粉碎后的20g脫脂小麥胚芽于燒杯中，加入120ml的水，攪勻后于80°C水浴1小時進行脫糖。2)離心分離棄上清，加入水使底物濃度為6% (g/Ι)，使用食品級鹽酸調節(jié)水解液的PH值為6-7，溫度50°C，將中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例1 1，添加到浸泡液中， 加酶量為400U/g底物，酶解120min ；3)使用食品級氫氧化鈉將酶解液的pH值調到8-9，在45°C浸提1小時；4) 5000rap/min離心15min，得到混合肽酶解液；5)將得到的混合肽酶解液分別經(jīng)過麗2000、MW600和麗300的聚砜膜，得到不同
分子量大小的多肽溶液；6)將通過MW300膜的液體進行分級透析脫鹽；7)將由幻和6)得到的各級分離物采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的肽粉，噴霧干燥的條件為料液濃度為30-35wt%，料液溫度為60°C，流量為150ml/h，進口溫度為190°C，出口溫度為70°C ；測得分子量從大到小的分離物的蛋白質的純度分別為
94.96wt %、95. Owt %、93. 5wt %、90. 5wt %。蛋白質的提取率達到 94. 45wt %。實施例3 1)脫脂小麥胚芽粉碎成粉狀，過80目篩。稱取粉碎后的20g脫脂小麥胚芽蛋白于燒杯中，加入130ml的水，攪勻后于80°C水浴1小時進行脫糖。2)離心分離棄上清，加入水使底物濃度6% (g/Ι)，使用食品級鹽酸調節(jié)水解液液的PH值為6-7之間，溫度60°C，將中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例1 1，添加到浸泡液中，加酶量為450U/g底物，酶解120min ；3)利用食品級氫氧化鈉將酶解液的pH值調到8-9之間，再45°C浸提1小時；4) 5000rap/min離心15min，得到混合肽酶解液溶液；5)將得到的混合肽酶解液分別經(jīng)過麗2000、MW600和麗300的聚砜膜，得到不同
分子量大小的多肽溶液；6)將通過MW300膜的液體進行分級透析脫鹽；7)將由幻和6)得到的各級分離物采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的肽粉，噴霧干燥的條件為料液濃度為30% -35wt%之間，料液溫度為60°C，流量為150ml/h， 進口溫度為190°C，出口溫度為70°C;測得分子量從大到小的分離物的蛋白質的純度分別為
95.34wt%,95. 4wt%,96. 3wt%,90. 12wt%0 蛋白質的提取率達到 94. 38wt%0
權利要求
1.一種復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，其特征是，以脫脂小麥胚芽為原料，首先對其進行脫糖，脫糖后離心分離；得到的固形物用復合酶對其進行水解，然后調節(jié)溶液的pH8 9進行堿提，堿提后進行離心分離；離心分離后上清液通過膜進行分離，通過最小分子量膜的液體再進行透析脫鹽；各級分離物采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。
2.如權利要求1所述的復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，其特征是，包括以下步驟1)脫脂小麥胚芽粉碎，過80 100目篩；稱取粉碎后的脫脂小麥胚芽加入容器中，加入其質量5 8倍的水，攪勻后于75 85°C水浴0. 8 1. 2小時進行脫糖；2)離心分離棄上清，加入水使底物濃度為3 6%，然后加入食品級的鹽酸調節(jié)溶液的 PH值為6 7;溫度40 60°C下，將中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例2 1 1 2 添加到溶液中，加酶量為400 600U/g底物，酶解90 120min ；所述底物濃度百分數(shù)為質量體積比；3)使用食品級氫氧化鈉將酶解液的pH值調到8 9，在40 50°C浸提0.8 1. 2小時；4)4500 5500rap/min離心12 18min，得到混合肽酶解液；5)將得到的混合肽酶解液分別經(jīng)過麗2000、MW600和麗300的聚砜膜分離，得到不同分子量大小的多肽溶液；6)將通過MW300聚砜膜的液體進行透析脫鹽；7)將步驟幻和6)得到的各級分離物分別采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉；所述各級分離物為步驟幻未通過MW2000聚砜膜的液體、通過MW2000聚砜膜但未通過MW600聚砜膜的液體、通過MW600聚砜膜但未通過MW300聚砜膜的液體和步驟 6)透析脫鹽的通過MW300聚砜膜的液體；所述噴霧干燥的條件為料液濃度為30-35wt%， 料液溫度為昍 65°C，流量為130 170ml/h，進口溫度為180 200°C，出口溫度為60 70 "C。
3.如權利要求2所述的復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步驟2)底物濃度為6%，酶解溫度為50°C，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶活比例為1 1， 加酶量為400U/g底物，酶解時間為120min。
4.如權利要求2所述的復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步驟2)底物濃度為5%，酶解溫度為50°C，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶活比例為1 1， 加酶量為400U/g底物，酶解時間為90min。
5.如權利要求2所述的復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步驟幻浸提溫度為45°C，浸提時間為1小時。
6.如權利要求2-5中任意一項所述的復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法， 其特征是，所述步驟7)噴霧干燥的條件為料液濃度為30-35wt%，料液溫度為60°C，流量為150ml/h，進口溫度為190°C，出口溫度為70°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復合酶結合堿法制備小麥胚芽活性多肽的方法，屬于酶工程和農產品加工技術領域。該方法以脫脂小麥胚芽為原料，首先對其進行脫糖，脫糖后離心分離；得到的固形物用復合酶對其進行水解，然后調節(jié)溶液的pH8～9進行堿提，堿提后進行離心分離；離心分離后上清液通過膜進行分離，通過最小分子量膜的液體再進行透析脫鹽；各級分離物采用雙效濃縮后噴霧干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。本發(fā)明通過低廉原材料制備出高純度的生物活性肽，提高麥胚蛋白的利用率，對于緩解我國十分緊缺的蛋白和油脂資源，提高我國人民的膳食營養(yǎng)與健康水平，提高企業(yè)的經(jīng)濟效益，具有十分重要的意義。
文檔編號C12P21/06GK102168124SQ20101061143
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權日2010年12月29日
發(fā)明者于功明, 張志國, 王成, 王成忠, 趙乃峰, 高超 申請人:山東廣明實業(yè)有限公司, 山東輕工業(yè)學院