專利名稱：熱帶假絲酵母細(xì)胞及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題是基因工程改性的熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)細(xì)胞、其用途以及用于制備ω-羥基-羧酸和ω-羥基-羧酸酯的方法。技術(shù)狀態(tài)熱帶假絲酵母能夠用鏈烷烴生成二羧酸，是一種具有良好特征的子囊菌。W091/006660描述了在β -氧化過程中通過中斷Ρ0Χ4和/或Ρ0Χ5基因而完全抑制的熱帶假絲酵母細(xì)胞，其可提高a，ω-二羧酸的收率。W000/020566描述了熱帶假絲酵母的Cytochrom Ρ450單加氧酶和NADPH Cytochrom Ρ450氧化還原酶，以及將其用來干預(yù)ω-羥基化反應(yīng)，ω-氧化反應(yīng)的第一步
馬聚οW003/089610描述了熱帶假絲酵母菌產(chǎn)生的、可催化ω-氧化反應(yīng)的第二步驟使脂肪醇轉(zhuǎn)變?yōu)槿┑拿福约皩⑵溆脕硖岣叨人岬漠a(chǎn)量。迄今為止所述的這些細(xì)胞和方法并不適合用來制備ω-羥基-羧酸或者其酯，因為ω -羥基-羧酸僅僅短時間以中間產(chǎn)物形式存在，并且立即將其代謝。ω -羥基-羧酸及其酯可作為聚合物的前體物質(zhì)，是很經(jīng)濟(jì)的化合物，因此本發(fā)明適合于商業(yè)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)在于，尋找一種能夠以發(fā)酵方式、特別是在細(xì)胞周圍的介質(zhì)中，制備足量的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯的方法。本發(fā)明的說明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，以下所述的細(xì)胞有助于解決這任務(wù)。因此本發(fā)明的主題是一種如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步的主題是本發(fā)明所述細(xì)胞的用途，以及本發(fā)明所述的細(xì)胞用于制備 ω_羥基-羧酸和ω-羥基-羧酸酯的方法。本發(fā)明的優(yōu)點是能夠?qū)⑺玫碾x析物(Eduktes)轉(zhuǎn)變成ω-羥基-羧酸和相應(yīng)的酯，且該方法的特異性很高，因此相對于所用離析物的收率很高。本發(fā)明的一個主題是一種尤其源自ATCC 20336菌株的熱帶假絲酵母細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞與其野生型相比至少一種酶的活性有所降低，可通過選自以下兩組沒有內(nèi)含子的核酸序列對所述的酶進(jìn)行編碼Α)序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號 15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25、序列號27、序列號四、序列號31、 序列號33、序列號35、序列號37、序列號39、序列號41、序列號43、序列號45、序列號47、序列號49、序列號51、序列號53、序列號55、序列號57、序列號59、序列號61、序列號63、序列號65和序列號67 ；尤其是序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25、序列號27、序列號四、序列號31、序列號33、序列號35、序列號37、序列號39、序列號41、序列號43、序列號 45、序列號47、序列號49和序列號51 ；更特別是序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25和序列號27，B)與以下序列號的序列至少80%—致、特別優(yōu)選至少90%—致、特別適宜優(yōu)選至少95%—致、最優(yōu)選至少99% —致的一種序列序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25、序列號27、序列號四、序列號31、序列號33、序列號35、序列號37、序列號39、序列號 41、序列號43、序列號45、序列號47、序列號49、序列號51、序列號53、序列號55、序列號57、 序列號59、序列號61、序列號63、序列號65和序列號67 ；尤其是序列號1、序列號3、序列號 5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25、序列號27、序列號四、序列號31、序列號33、序列號35、序列號37、序列號39、序列號41、序列號43、序列號45、序列號47、序列號49和序列號51 ；更特別是序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25和序列號27。本發(fā)明所述的優(yōu)選核酸序列組是組 A)。本發(fā)明所述的細(xì)胞的“野生型”優(yōu)選指的是可以對通過上述核酸序列號編碼的酶的活性有影響的元素(諸如例如包括用來對相應(yīng)酶進(jìn)行編碼的上述核酸序列的基因，或者包含在相應(yīng)基因之中與上述核酸序列有功能關(guān)系的啟動子)進(jìn)行操控從而從中產(chǎn)生本發(fā)明所述細(xì)胞的起始菌株。如果能夠以抑制相應(yīng)基因的方式使得例如ATCC 20336菌株中以序列號1編碼的酶的活性降低，則應(yīng)將未經(jīng)改變、用于進(jìn)行相應(yīng)操控的ATCC 20336菌株看成是“野生型”。本發(fā)明所述的術(shù)語“基因”并非僅僅指編碼的或者轉(zhuǎn)錄為mRNA的DNA區(qū)域，S卩“結(jié)構(gòu)基因”，而且也指啟動子區(qū)、可能的內(nèi)含子區(qū)、增強(qiáng)區(qū)和其它調(diào)控序列區(qū)以及終止子區(qū)。本發(fā)明所述術(shù)語“酶的活性”指的是能夠通過整個細(xì)胞對從12-羥基-十二烷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，12-十二烷二酸的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶活性。優(yōu)選根據(jù)以下方法測定該活性以單菌落為原料，在溫度為30°C和90rpm的條件下，將盛有10毫升YM培養(yǎng)基 (0.3%酵母萃取物，0.3%麥芽萃取物，0.5%蛋白胨和1.0% (w/w)葡萄糖)的100毫升錐形燒瓶培養(yǎng)M小時。然后以該培養(yǎng)物為原料，取10毫升注射到盛有100毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基 (對于1升25克葡萄糖，7. 6克NH4Cl, 1. 5克Na2SO4, 300毫升ImM磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7. 0)，20毫克aiS04x7H20，20毫克MnS04x4H20，20毫克煙酸，20毫克吡哆素，8毫克硫胺素和 6毫克泛酸鹽)的1升錐形燒瓶之中。在溫度為30°C的條件下培養(yǎng)M小時。經(jīng)過M小時之后，在細(xì)胞懸浮液中計量加入12-羥基-十二烷酸，使得濃度不大于0.5g/l。此外還加入葡萄糖或丙三醇作為共基質(zhì)，使得共基質(zhì)的濃度不低于0.2g/l。經(jīng)過0小時、0.5小時、1小時，和然后直至M小時培養(yǎng)時間之后，每小時取一些試樣(1毫升) 用于檢測12-羥基-十二烷酸、12-氧代-十二烷酸和1，12-十二烷二酸以及相應(yīng)的甲酯， 以及檢查細(xì)胞數(shù)。每次檢測之后，使用6NNa0H或4N H2SO4將pH值保持在5. 0 6. 5之間。 在培養(yǎng)期間以檢查“菌落形成單位”(CFU)的方式檢查細(xì)胞生長情況。通過LC-MS系統(tǒng)檢查12-羥基-十二烷酸的減少量以及1，12-十二烷二酸或者相應(yīng)甲酯的產(chǎn)量。為此可將
5500 μ 1培養(yǎng)液調(diào)整到PH 1，然后用等體積的二乙醚或乙酸乙酯進(jìn)行提取，并且利用LC-MS 進(jìn)行分析。該檢測系統(tǒng)的組成為一個HP1100HPLC(Agilent jTechnologiesjaldbronr^Dhm 有除氣器、自動取樣器和柱溫箱，與一個四極質(zhì)譜選擇檢測器MSD (Agilent Technologies, ffaldbronn,D)聯(lián)用。在溫度為40°C的條件下，在一個例如12h2mm Luna C18(2)反相色譜柱(Phenomenex，Aschaffenburg，D)上進(jìn)行色譜分離。以每分鐘0. 3毫升的流量進(jìn)行梯度洗脫(A 0. 02%蟻酸水溶液，和B 0. 02%蟻酸乙腈溶液)。也可利用GC-FID (Perkin Elmer, Rodgau-Jugesheim,D)分析有機(jī)萃取物。在甲基聚硅氧烷(5%苯基)相色譜柱上進(jìn)行色譜分離，例如 Elite 5，30m，0.25mm ID，0· 25 μ m FD (Perkin Elmer，Rodgau-Jiigesheim，D)。進(jìn)行檢測之前在游離酸中摻入一種甲基化劑，例如氫氧化三甲基锍“TMSH” (Macherey-Nagel GmbH & Co.KG，DUren，D)，然后注射到相應(yīng)的甲酯之中。計算所測定的1，12-十二烷二酸濃度和取樣時間點的細(xì)胞數(shù)，即可確定從12-羥基-十二烷酸獲得1，12-十二烷二酸的比產(chǎn)出率，從而確定細(xì)胞中上述定義的“酶的活性”。 “與其野生型相比降低的活性”這一說法優(yōu)選指的是相對于野生型活性而言，活性降低了至少50%，特別優(yōu)選降低了至少90%，特別優(yōu)選降低了至少99.9%，還更優(yōu)選降低了至少 99. 99%，最優(yōu)選降低了至少99. 999% ο其中在相同條件諸如例如培養(yǎng)基、曝氣、攪拌下培養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)以上所述在細(xì)胞數(shù) /濃度盡可能相同的情況下測定活性的方法，測定本發(fā)明所述細(xì)胞的活性與其野生型相比有所降低?？梢岳靡阎姆椒y定相對于指示序列的“核苷酸一致性”。通?？筛鶕?jù)具體需要使用具有相關(guān)算法的特殊計算機(jī)程序。優(yōu)選的致性測定方法首先在待比較序列之間產(chǎn)生最大的一致性。用于確定一致性的計算機(jī)程序包括(但并不僅限于此)GCG程序包，包括-GAP (Deveroy, J.等人，1984 年核酸研究雜志第 12 期第 387 頁(Nucleic Acid Research 12 (1984)，P387)，威斯康辛大學(xué)遺傳學(xué)計算機(jī)集團(tuán)，醫(yī)學(xué)(Wi)，以及-BLASTP, BLASTN 和 FASTA (Altschul，S.等人，1990 年分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)第215期第403-410頁。BLAST程序可向國際生物技術(shù)信息中心(NCBI)及其它來源訂購(BLAST 手冊，Altschul S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894 ；Altschul S.等人)。同樣也可使用已知的Smith-Waterman算法來確定核苷酸致性。使用BLASTN程序測定“核苷酸一致性”的優(yōu)選參數(shù)(Altschul，S.等人，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)第 215 期(1990)第 403-410 頁期望(Expect)閾值10字大小28匹配得分1失配得分-2空位罰分線性上述參數(shù)是核苷酸序列比較過程中的默認(rèn)參數(shù)。GAP程序同樣也適合與上述參數(shù)一起使用。按照上述算法得出的80%—致性在本發(fā)明中就表示一致性為80%。同理適用于更高的一致性。通過術(shù)語“通過沒有內(nèi)含子的核酸序列編碼的”強(qiáng)調(diào)了與這里所述的序列進(jìn)行序列比較時必須預(yù)先從待比較的核酸序列中清除可能的內(nèi)含子。如果沒有其它說明，所有百分?jǐn)?shù)(％ )均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。專業(yè)人士均知曉降低微生物中酶活性的方法。這里尤其可使用分子生物技術(shù)。關(guān)于修飾和降低蛋白質(zhì)表達(dá)從而降低熱帶假絲酵母的酶活性的說明，尤其是關(guān)于中斷特異性基因的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參 1 :W091/006660 ；W003/100013 ；Picataggio et al. Mol Cell Biol.1991Sep ；11 (9) 4333-9 ；Rohrer et al. Appl Microbiol Biotechnol. 1992Feb ；36 (5) :650-4 ；Picataggio et al.Biotechnology(N Y). 1992Aug ； 10 (8) :894-8 ；Ueda et al.Biochim Biophys Acta. 2003Mar 17 ；1631 (2) :160-8 ；Ko et al. Appl Environ Microbiol. 2006Jun ；72 (6) 4207-13 ；Hara et al.Arch Microbiol. 2001Nov ；176 (5) :364-9 ；Kanayama et al. J Bacteriol. 1998Feb ； 180(3) :690_8。本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞的特征在于，采用修飾至少一種基因的方式降低酶活性，所述基因包括選自上述核酸序列組A)和B)的某一個序列，其中所述修飾選自包括、優(yōu)選組成如下的組將外源DNA插入基因之中，刪除至少該基因的一部分，在基因序列中形成點突變，對該基因進(jìn)行在RNA干涉影響下的中斷(Aussetzen)，或者用外源DNA替換基因的一部分，尤其是啟動子區(qū)。所述外源DNA指的是基因(并非生物體)“之外”的DNA序列，也就是說，熱帶假絲酵母的內(nèi)源DNA序列也可以作為“外源DNA”。特別優(yōu)選采用插入一種選擇標(biāo)記基因的方式中斷基因，因此外源DNA是一種選擇標(biāo)記基因，其中優(yōu)選采用同源重組方式插入到基因座之中。比較有益的方式是給選擇標(biāo)記基因增加一些隨后能夠從基因中刪除的其它功能， 例如可以通過Cre/loxP系統(tǒng)、通過翻轉(zhuǎn)酶識別靶(FRT)或者同源重組法實現(xiàn)。本發(fā)明優(yōu)選細(xì)胞的特征在于，在其氧化過程中至少部分、優(yōu)選完全將其阻斷， 因為這樣可防止基質(zhì)外流，從而可實現(xiàn)比較高的滴度。關(guān)于在其β -氧化過程中部分阻斷的熱帶假絲酵母細(xì)胞的例子是在ΕΡ0499622中所述的菌株Η41、Η41Β、Η51、Η45、Η43、Η53、Η534、Η534Β和Η435，從中可得到本發(fā)明優(yōu)選的熱帶假絲酵母細(xì)胞。例如在W003/100013中還描述了其它在β -氧化過程中阻斷的熱帶假絲酵母細(xì)胞。優(yōu)先選用的是那些能夠使基因Ρ0Χ2、Ρ0Χ4或Ρ0Χ5中至少一種基因誘導(dǎo)失效的方式引起β-氧化反應(yīng)的細(xì)胞。這些優(yōu)選的細(xì)胞的特征在于，可從選自ATCC 20962和US2004/0014198中所述熱帶假絲酵母HDClOO的菌株得到本發(fā)明優(yōu)選的熱帶假絲酵母細(xì)胞。本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的細(xì)胞用于制備ω-羥基-羧酸或者ω-羥基-羧酸酯的用途。特別是本發(fā)明所述的細(xì)胞用于制備羧酸的鏈長為6 24、優(yōu)選8 18、特別優(yōu)選 10 16個碳原子的(其優(yōu)選為直鏈、飽和和非取代的)，和酯的醇組分的鏈長為1 4、尤
7其為1或2個碳原子的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯的用途。所述ω-羥基-羧酸優(yōu)選是12-羥基-十二烷酸，所述ω -羥基-羧酸酯適宜是12-羥基-十二烷酸甲酯。本發(fā)明所述的優(yōu)選用途的特征在于使用如上所述的本發(fā)明的優(yōu)選細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種用于制備前面所述的本發(fā)明熱帶假絲酵母細(xì)胞的方法，該方法包括以下方法步驟I)準(zhǔn)備一種熱帶假絲酵母細(xì)胞，優(yōu)選在其氧化過程中至少部分、優(yōu)選完全阻斷的細(xì)胞；II)對至少一種基因進(jìn)行修飾，所述基因包括選自上述核酸序列組Α)和B)中的某一個沒有內(nèi)含子的核酸序列，所述修飾通過將外源DNA，尤其是對選擇標(biāo)記基因進(jìn)行編碼的DNA插入到基因之中，刪除至少該基因的一部分，在基因序列中形成點突變，對該基因進(jìn)行在RNA干涉影響下的中斷，或者用外源DNA替換基因的一部分，尤其是啟動子區(qū)。本發(fā)明還涉及一種用于制備ω-羥基-羧酸或者ω-羥基-羧酸酯的方法，尤其是羧酸的鏈長為6 Μ、優(yōu)選8 18、特別優(yōu)選10 16個碳原子的(其優(yōu)選為直鏈、飽和與非取代的)、和酯的醇組分的鏈長為1 4、尤其為1或2個碳原子的ω-羥基-羧酸或 ω -羥基-羧酸酯，尤其是12-羥基十二烷酸或12-羥基-十二烷酸甲酯，該方法包括以下方法步驟Α)使得上述本發(fā)明所述的細(xì)胞接觸一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有一種羧酸或羧酸酯，尤其是羧酸的鏈長為6 Μ、優(yōu)選8 18、特別優(yōu)選10 16個碳原子的(其優(yōu)選為直鏈、飽和與非取代的)，和酯的醇組分的鏈長為1 4個碳原子的羧酸或羧酸酯，尤其是十二烷酸或者十二烷酸甲酯，B)在所述細(xì)胞能夠從羧酸或羧酸酯生成相應(yīng)ω -羥基-羧酸或ω -羥基-羧酸酯的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并且C)任選分離出所生成的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯。本發(fā)明的優(yōu)選方法使用的是上述本發(fā)明優(yōu)選所述的細(xì)胞。例如用于制備12-羥基-十二烷酸或12-羥基十二烷酸甲酯的方法包括以下方法步驟a)接觸一種在其β -氧化過程中至少部分阻斷的、源自菌株ATTC 20336的熱帶假絲酵母細(xì)胞，這種細(xì)胞與其野生型相比至少一種酶的活性有所降低，可通過選自上述核酸序列組Α)和B)中沒有內(nèi)含子的核酸序列對所述的酶進(jìn)行編碼，其中通過修飾一種基因的方式達(dá)到酶活性的降低，所述基因包括選自上述核酸序列組Α)和B)的某一個核酸序列，其中所述修飾包括將一種選擇標(biāo)記基因插入到基因之中，與一種含有十二烷酸或十二烷酸甲酯的培養(yǎng)基相接觸，b)在所述細(xì)胞能夠從羧酸或羧酸酯生成相應(yīng)ω-羥基-羧酸或ω-羥基羧酸酯的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并且c)更特別優(yōu)選任選分離出所生成的ω -羥基-羧酸或ω -羥基-羧酸酯。專業(yè)人士均知曉適宜的熱帶假絲酵母的培養(yǎng)條件。尤其適用于方法步驟b)的條件是專業(yè)人士知曉的根據(jù)生物轉(zhuǎn)化法利用熱帶假絲酵母制備二羧酸的培養(yǎng)條件。例如在W000/017380和W000/015828中就描述了此類培養(yǎng)條件。用于分離出所生成的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯的方法是專業(yè)人士知曉
8的方法。這些均為從水溶液中分離出長鏈羧酸的標(biāo)準(zhǔn)方法，諸如例如蒸餾或萃取，且也可以例如參閱W02009/077461所述的方法。適宜使用按照本發(fā)明所述方法獲得的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯來制備聚合物尤其是聚酯。此外還可以用ω-羥基羧酸來制備內(nèi)酯，以后可以用內(nèi)酯來例如制備聚酯。另一種有益的用途是將ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)棣?-氨基-羧酸或ω-氨基-羧酸酯，以便獲得聚合物聚酰胺。也可以將ω-氨基-羧酸或ω-氨基-羧酸酯首先轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的內(nèi)酰胺，然后再以陰離子或酸催化法將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫埘０?。更特別適宜在第一道反應(yīng)步驟中將ω-羥基-羧酸或者相應(yīng)的酯轉(zhuǎn)變?yōu)棣?氧代-羧酸或者相應(yīng)的酯，然后在例如還原胺化過程中對氧代基團(tuán)進(jìn)行胺化。就此而言，特別優(yōu)選的是12-羥基-十二烷酸或12-羥基-十二烷酸甲酯用于制備聚合物尤其是聚酰胺12的用途。
權(quán)利要求
1.熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞與其野生型相比至少一種酶的活性有所降低，可通過選自以下兩組A)和B)中沒有內(nèi)含子的核酸序列對所述的酶進(jìn)行編碼A)序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、 序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25、序列號27、序列號四、序列號31、序列號33、序列號35、序列號37、序列號39、序列號41、序列號43、序列號45、序列號47、序列號49、序列號51、序列號53、序列號55、序列號57、序列號59、序列號61、序列號63、序列號 65和序列號67 ；B)與以下序列號的序列之一至少80%—致的一種序列序列號1、序列號3、序列號5、 序列號7、序列號9、序列號11、序列號13、序列號15、序列號17、序列號19、序列號21、序列號23、序列號25、序列號27、序列號四、序列號31、序列號33、序列號35、序列號37、序列號 39、序列號41、序列號43、序列號45、序列號47、序列號49、序列號51、序列號53、序列號55、 序列號57、序列號59、序列號61、序列號63、序列號65和序列號67。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熱帶假絲酵母細(xì)胞，其特征在于，以修飾一種基因的方式達(dá)到酶活性的降低，所述基因包括權(quán)利要求1中所述的一種核酸序列，其中所述修飾選自將外源DNA插入到基因之中，刪除該基因的至少一部分，在基因序列中形成點突變，對該基因進(jìn)行在RNA干涉影響下的中斷，并且用外源DNA替換基因的一部分，尤其是啟動子區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熱帶假絲酵母細(xì)胞，其特征在于，所述外源DNA是一種選擇標(biāo)記基因。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項所述的熱帶假絲酵母細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞在其β-氧化過程中至少部分阻斷。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中至少一項所述的熱帶假絲酵母細(xì)胞，其特征在于，所述熱帶假絲酵母細(xì)胞衍生自選自以下的菌株熱帶假絲酵母Η41、熱帶假絲酵母Η41Β、熱帶假絲酵母 Η51、熱帶假絲酵母Η45、熱帶假絲酵母Η43、熱帶假絲酵母Η53、熱帶假絲酵母Η534、熱帶假絲酵母534Β、熱帶假絲酵母Η435、熱帶假絲酵母ATCC20962和熱帶假絲酵母HDC100，尤其是熱帶假絲酵母ATCC20962和熱帶假絲酵母HDC100。
6.上述權(quán)利要求中至少一項所述的細(xì)胞用于制備ω-羥基-羧酸或者ω-羥基-羧酸酯的用途。
7.用于制備權(quán)利要求1 5中至少一項所述的熱帶假絲酵母細(xì)胞的方法，包括以下方法步驟I)準(zhǔn)備一種熱帶假絲酵母細(xì)胞，并且II)對至少一種基因進(jìn)行修飾，所述基因包括選自權(quán)利要求1所述核酸序列組Α)和B) 中的某一個序列，所述修飾是通過將外源DNA尤其是對選擇標(biāo)記基因進(jìn)行編碼的DNA插入到基因之中，刪除該基因的至少一部分，在基因序列中形成點突變，對該基因進(jìn)行在RNA干涉影響下的中斷，并且用外源DNA替換基因的一部分，尤其是啟動子區(qū)。
8.用于制備ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯的方法，尤其是羧酸的鏈長為6 對個碳原子和酯的醇組分的鏈長為1 4個碳原子的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯， 尤其是12-羥基-十二烷酸或者12-羥基-十二烷酸甲酯，該方法包括以下方法步驟a)使權(quán)利要求1 5中至少一項所述的細(xì)胞接觸含有一種羧酸或羧酸酯的培養(yǎng)基，b)在所述細(xì)胞能夠從羧酸或羧酸酯生成相應(yīng)的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并且c)任選分離出所生成的ω-羥基-羧酸或ω-羥基-羧酸酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求5所述的在其β-氧化過程中至少部分阻斷的細(xì)胞。
10.通過權(quán)利要求8或9所述方法獲得的ω-羥基-羧酸或者ω-羥基-羧酸酯用于制備聚合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明的主題是基因工程改性的熱帶假絲酵母細(xì)胞、及其用途以及用于制備ω-羥基-羧酸和ω-羥基-羧酸酯的方法。
文檔編號C12P7/42GK102154139SQ201010610768
公開日2011年8月17日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者H-G·亨內(nèi)曼, M·珀特, S·沙費(fèi)爾, T·哈斯 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司