專利名稱：：西方伊薩酵母的生物脫毒用途以及它對半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及一種西方伊薩酵母的生物脫毒用途，以及它對半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵的方法。
背景技術：
：半纖維素是植物細胞壁中除纖維素之外的聚糖類，含量隨不同植物而有所差別，大致占植物體重量的20-35%，是地球上除纖維素之外最豐富的多糖。纖維素是完全由葡萄糖單元聚合成的均一性聚糖，而半纖維素則主要是由木糖以β-(1-4)糖苷鍵構(gòu)成主鏈，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支鏈結(jié)構(gòu)的非均一性聚糖。半纖維素的木聚糖主鏈一般含有50-150個木糖單位，無結(jié)晶結(jié)構(gòu)，結(jié)合在纖維素微纖維的表面。半纖維素比纖維素容易水解得多，用稀酸在100_13(TC條件下，就很容易將半纖維素，水解生成以五碳糖為主要成分的半纖維素水解物。發(fā)酵半纖維素水解物生產(chǎn)市場容量大的木糖醇、乙醇等各類化工產(chǎn)品，是能夠大規(guī)模利用半纖維素資源的有效途徑。雖然用稀酸將半纖維素水解生成以單糖為主要成分的水解物的過程并不困難，但是，稀酸水解過程會伴隨產(chǎn)生一系列微生物代謝抑制物，要改善半纖維水解物的發(fā)酵性能，必須除去其中的微生物代謝抑制物，即脫毒過程是必不可少的。目前在半纖維素水解物中已鑒定的毒物成分已經(jīng)有幾十種，其中代表性毒物包括三大類，即糠醛類化合物，如糠醛，5-羥甲基糠醛；脂肪酸類化合物，如甲酸，乙酸，丙酸；木質(zhì)素降解生成的一系列含有苯環(huán)的化合物，如愈創(chuàng)木酚，苯甲醛，阿魏酸等。已經(jīng)報道真空蒸發(fā)，溶劑抽提，活性炭吸附，大孔樹脂吸附，離子交換樹脂處理，都可以脫去某些毒物，改善水解物的發(fā)酵性能。然而，一種物理或化學方法只能除去某一類有毒物質(zhì)，通常需要聯(lián)合采用多種理化措施處理，半纖維水解物才能達到比較好的脫毒效果。但是，脫毒是一個耗費成本的過程，同時使用多種理化措施對半纖維素水解物進行脫毒處理，必須大幅度提高產(chǎn)物發(fā)酵的成本。事實上，自然界的一些微生物對半纖維素水解物中的某些毒物具有降解活性。例如，例如降解木質(zhì)素及由木質(zhì)素降解生成的一系列酚類化合物的白腐菌(林海陸鋼張慶娜，降解造紙廢水木質(zhì)素菌種的篩選鑒定及應用，北京科技大學學報。2007，29(6)569-573；陶楊廖俊和羅學剛，生物制漿技術最新應用研究進展。纖維素科學與技術。2007，15(1):70-74，降解糠醛，5-羥甲基糠醛細菌，酵母(代書玲，張魯嘉，糠醛及其衍生物微生物降解(轉(zhuǎn)化)研究進展。氨基酸和生物資源2007，29(4)41-45；劉愛平許學書樊行雪，利用酵母生物轉(zhuǎn)化植物纖維為乙醇的研究進展。生物技術通訊，2004，15(2)193-196)，降解短鏈脂肪酸的子囊菌(何剛強堵國成劉立明，嗜熱子囊菌利用短鏈有機酸生產(chǎn)角質(zhì)酶。生物工程學報，2008，24(5)821-828)近年有人開始嘗試以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶與過氧化物酶聯(lián)合處理木材酸水解物，能除去了大部分的單環(huán)酚性物(monoaromaticphenoliccopounds)0處理后的水解物用于乙醇發(fā)酵，結(jié)果葡萄糖消耗速率與乙醇生成速率提高了近5倍(JonssonJL,PalmqvistE,NilvebrantN0.,Detoxificationofwoodhydrolysateswithlaccaseandperoxidasefromthewhite-rotfungusTrametesversicolor.Appl.MicrobiolBiotechnol.1998，(49):691_697))。但復雜的毒物成分需要復雜的酶系的聯(lián)合降解，這無疑大大增加了脫毒的成本。Lopez等人以微生物ConichaetaligniariaNRRL30616發(fā)酵處理木質(zhì)纖維稀酸水解物，不僅去除糠醛、5-羥甲基糠醛的效果顯著，同時也明顯減少了水解物中的酚類物質(zhì)。經(jīng)過這一菌株處理的水解物再用產(chǎn)乙醇酵母發(fā)酵，80h產(chǎn)生1.66%°乙醇，而未處理的去口沒有乙酉享產(chǎn)生(LopezJΜ,NicholsNN,DienBSetal.Isolationofmicroorganismsforbiologicaldetoxificationoflignocellulosechydrolysates.ApplMicrobiolBiotechnol.2004,64(1):125_131)。上述研究表明，利用微生物降解木質(zhì)纖維水解物中復雜有毒物質(zhì)是可能實現(xiàn)的。尤其是，如果能夠獲得一種同時具備降解半纖維水解物中的三大代表性毒物的代謝系統(tǒng)，即可以同時降解糠醛、脂肪酸及含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)化合物的微生物，并且這種微生物又不能利用木糖的話，那么直接利用這種微生物發(fā)酵半纖維水解物進行脫毒物質(zhì)處理，就能有效克服現(xiàn)有理化脫毒方法工藝繁瑣、成本高的缺點，并具有環(huán)境友好的優(yōu)勢。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的半纖維素水解物理化脫毒工藝所存在的過程煩瑣，成本高的問題。本發(fā)明的內(nèi)容包括發(fā)明人自造紙廠，木糖廠，糠醛廠周圍土壤污泥樣富含培養(yǎng)、分離、篩選，獲得能有效改善木質(zhì)纖維水解物發(fā)酵性能的兩個分離物S-7和Lj-3。發(fā)明人鑒定分離物S-7屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)，它在2006年9月18日被保存到中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCN0M206098，不能利用木糖；分離物Lj-3屬于西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)，它在2006年9月18日被保存到中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCN0:M206097，利用木糖的能力極微弱。發(fā)明人用這種脫毒活性新菌株建立了半纖維水解物的生物脫毒法；將脫毒活性菌株與發(fā)酵木糖生成木糖醇微生物混合接種，實現(xiàn)半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇；將脫毒活性菌株與發(fā)酵木糖生成乙醇的微生物混合接種，實現(xiàn)半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。上述兩種酵母的保藏信息參見本專利申請所附的兩份保藏受理通知書。屬于本發(fā)明的兩個生物脫毒活性菌株S-7(CCTCCNO:M206098)和Lj_3(CCTCCNO:M206097)，其分離篩選、及分類鑒定的過程如下用蔗渣半纖維素水解物為分離培養(yǎng)基的基本成分，適當真空后用堿調(diào)節(jié)pH5-6。如果制成平板，外加瓊脂20g/L作為固形劑。從紙漿廠廢水污染的環(huán)境采集的土壤、淤泥作分離樣品。250ml三角瓶裝量25ml，接入廢水或淤泥分離樣品約lg，30°C，200rpm搖瓶富集培養(yǎng)72h。取有菌體生長的培養(yǎng)液在同一培養(yǎng)基平板上劃線分離，選擇能夠快速生長的類型，轉(zhuǎn)到斜面保存。斜面培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到半纖維稀酸水解物中并在搖瓶條件下培養(yǎng)24小時，離心除去菌體，然后接入能夠同化木糖的酵母菌株進行發(fā)酵，選留那些能夠有效改善半纖維素稀酸水解物發(fā)酵性能的脫毒活性菌株。如此經(jīng)過十余個批次的樣品分離，獲得改善半纖維素水解物發(fā)酵性能活性最強的兩個分離物，編號分別為S-7和Lj-3。高效液相色譜的檢測結(jié)果表明，S-7和Lj-3對半纖維素稀酸水解物中的代表性毒物醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。上述方法分離得到的兩個菌株于4°C冷藏或凍干法保藏。按照《酵母菌鑒定手冊》(青島海洋大學出版社)一書提供的方法，鑒定了S-7和Lj-3的細胞、菌落與生理生化特征(表1，表2)。分離物S-7的生理、生化特征與《酵母菌鑒定手冊》中所描述的東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)完全相同；分離物Lj_3的生理、生化特征與同一書中所述的西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)完全相同。用引物5，-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3，和5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增S-7和Lj-3的26SrDNAD1/D2區(qū)域核酸序列(方法參照KurtzmanCP,FournewCandidaspeciesfromgeographicallydivetselocations.AntonievanLeeuwenhoek,2001,79353-361)0測定擴增產(chǎn)物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotideBLAST)。搜索結(jié)果表明，S-7的26SrDNAD1/D2區(qū)域的核酸序列，與GenBank現(xiàn)有Issatchenkiaorientalis同一區(qū)域核酸序列同源性均達100%；Lj-3與其中與Issatchenkiaoccidentalis同一區(qū)域核酸序列的同源性達到100%。根據(jù)上述的細胞、菌落形態(tài)、生理生化與分子生物學特征的可以確定，S-7的分類地位屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)；Lj-3的分類地位屬于的西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)。東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCCNO:M206098，它的26SrDNAD1/D2區(qū)域的核苷酸序列在GenBank的登記號為EF030708http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi？db=nucleotide&val=116834296；西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3在CCTCC的保藏號為CCTCCNO:M206097，它的26SrDNAD1/D2區(qū)域的核苷酸序列的GenBank登記號為EF030710http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi？db=nucleotide&val=116834298。表1分離物S-7、Lj-3的細胞與菌落形態(tài)特征菌落形態(tài)細胞特征S-7表面干燥，邊緣輻射狀。多端出芽，細胞平均長度為1020um之間。^Lj-3有光澤，表面粘稠，邊緣整齊平滑。多端出芽，細胞平均長度為515。表2分離物S-7、Lj-3的生理生化特征(+，利用；_，不利用)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7(CCTCCNO:M206098)26SrDNADl/D2區(qū)域的核酸序列(GenBank登記號EF030708)1taagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaaga61gctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctgtgt12lggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagccccgtggga181tgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaa241gcgggtggtaaattccatctaaggctaaatactggcgagagaccgatagcgaacaagtac301tgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattgttga36laagggaagggtattgcgcccgacatggggattgcgcaccgctgcctctcgtgggcggcgc421tctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcaggagaaggggttctggaacgtg481gctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcggggaccgaggactgcggcc541gtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaacacgga西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj-3(CCTCCNO:M206097)的26SrDNAD1/D2區(qū)域核酸序列(GenBmk登記號EF030710)1tatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcg61gcaaaagctcagatttgaaatcgtgtttcggcacgagttgtagattgcaggttggagtct121ttgtggaagcgtgtgtctaagtcccttggaacagggtgccattgagggtgagagccccgt181gagacgcgtgcggaagctgtaaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagct241ctaagtgggtggtaaattccatctaaggctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaa301gtactgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattg361ttgaaagggaagggtattgggctcgacatgggatttgcgcaccgctgctccttgtgggcg421gcgctctgtgcttttcctgggccagcatcggtttttgccgcaggagaaggcgtgctggaa481tgtggctcttcggagtgttatagccagtgcgagatgctgcgtgcggggaccgaggactgc541gacatctgtctcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgtaa本發(fā)明按下述方法制備所需要的半纖維素水解物將甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸稈粉碎至適當粒度，按固液比167加入0.33%(w/w)的稀硫酸或稀鹽酸溶液，攪拌均勻，在耐酸的壓力容器內(nèi)加熱至100130°C，維持0.53小時。水解結(jié)束后濾除殘渣，濾液即為半纖維素水解物。用固體碳酸鈣或氫氧化鈣將半纖維素稀酸水解液調(diào)至PH值38，可直接或濃縮后再進行生物脫毒。一般地，較高酸濃度的條件可以使用較低的水解溫度，或相應縮短水解時間，較低的酸濃度則必須提高水解溫度或延長水解時間。本發(fā)明按下述方法培養(yǎng)用于半纖維水解物生物脫毒，木糖醇發(fā)酵，乙醇發(fā)酵的微生物菌種脫毒菌株種子液的培養(yǎng)將CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097的斜面培養(yǎng)物接入液體種子培養(yǎng)基，裝液量為搖瓶容量的20%，在27--30°C，轉(zhuǎn)速200rmp條件下?lián)u床培養(yǎng)1218小時，即可獲得可用于脫毒的種液。種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖50g/L，MgSO4.7H202g/L,K2HPO44g/L，KH2PO46g/L，酵母膏5g/L。發(fā)酵木糖生成木糖醇的菌株種子液培養(yǎng)所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，它在2005年6月15日被保存到中國武漢·武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M205067，分類命名為熱帶假絲酵母l-18Candidatropicalis1-18,(見發(fā)明專利“熱帶假絲酵母菌株的分離及其用于木糖醇生產(chǎn)的方法”，發(fā)明專利申請?zhí)?00510037580.2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分與培養(yǎng)條件同脫毒菌株種子培養(yǎng)。發(fā)酵木糖生成乙醇的菌株種子液培養(yǎng)所用的菌株為保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)的嗜單寧管囊酵母(Pachysolentannophilus)CICC1770，培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件同發(fā)酵木糖生成木糖醇的菌種培養(yǎng)。本發(fā)明按下述方法進行半纖維素水解物生物脫毒半纖維素水解物總糖含量為420%(w/w)，其中還原性單糖占總糖含量>90%以上，以木糖為主成分。用堿液(氫氧化鈣，氨水等)調(diào)節(jié)至PH3-7，按10%(ν/ν)接種量接入培養(yǎng)好的CCTCCNO:Μ206098或CCTCCNO:Μ206097種子液，在2535°C，通氣條件下發(fā)酵脫毒520小時，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集離心沉淀的菌體重復用于下一批新鮮的半纖維素水解物脫毒，離心上清液可直接或者濃縮后用于木糖醇發(fā)酵，或乙醇發(fā)酵。本發(fā)明按下述方法發(fā)酵脫毒后的半纖維素水解物生產(chǎn)木糖醇已經(jīng)過CCTCCNO:M206098，或CCTCCNO:M206097發(fā)酵脫毒過的半纖維素水解物，真空濃縮至木糖約150g/L，氨水調(diào)節(jié)至pH=6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇發(fā)酵的半纖維素水解物培養(yǎng)基。木糖醇發(fā)酵用搖瓶進行，搖瓶裝量10%，按5%(ν/ν)接種量接入熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067種子液，200rmp，33°C進行發(fā)酵至木糖消耗完。收集離心沉淀的菌體，投入到新鮮的半纖維素水解物培養(yǎng)基中繼續(xù)新一輪的木糖醇發(fā)酵，離心上清液用于制備木糖醇。本發(fā)明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇真空濃縮半纖維素水解物至木糖含量約100-150g/L，用堿(氫氧化鈣，或氨水)調(diào)至PH3--pH7，，離心或過濾除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纖維素水解物培養(yǎng)基，分裝于三角瓶；取培養(yǎng)好的株CCTCCNO:M206098種子液，或者CCTCCNO:M206097的種子液，并與等體積的CCTCCN0:M205067種子液混合，然后按5%(ν/ν)和用種量接入半纖維素水解物中，搖瓶培養(yǎng)至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞并用于新鮮的培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步脫毒發(fā)酵。如此不斷地循環(huán)，直至酵母細胞不能利用。本發(fā)明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發(fā)酵生產(chǎn)乙醇同步脫毒發(fā)酵生產(chǎn)乙醇所用的半纖維素水解物的培養(yǎng)基，與同步脫毒發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的培養(yǎng)基相同。取培養(yǎng)好的株CCTCCNO:Μ206098種子液，或者CCTCCNO:Μ206097的種子液，與等體積的CICC1770種子液混合，然后按5%(ν/ν)和用種量接入半纖維素水解物培養(yǎng)基搖瓶中，培養(yǎng)至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞循環(huán)用于發(fā)酵新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)同步脫毒發(fā)酵，如此不斷地循環(huán)，直至酵母細胞不能利用。蒸餾回收離心上清液中的乙醇。本發(fā)明用高效液相色譜法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物中的代表性毒物質(zhì)，及主要酚類物質(zhì)降解活性。選擇乙酸、糠醛及愈創(chuàng)木酚作為半纖維素水解物中不同類型抑制物的代表，將這三種化合物一起加入到普通酵母培養(yǎng)基中，并接入脫毒活性菌株(CCTCCNO:M206097,或CCTCCNO:M206098)進行發(fā)酵。利用這三種化合物均在198nm處均有較強的紫外吸收的特點，在如下色譜條件WaterS486高效液相色譜儀，ZORBAXXDB-C18色譜柱，流動相甲醇磷酸(0.2%，w/w)=7525(v/v)，對比檢測這三種化合物在發(fā)酵前后的含量變化，判斷這兩個菌株對這三種代表性有毒成分均具有降解活性(圖1)。由于酚類化合物在270nm附近均有強的紫外吸收，故以270nm為檢測波長，以高效液相對比檢測操作1的蔗渣半纖維素水解物、操作3的經(jīng)東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物脫毒，經(jīng)西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097生物脫毒的蔗渣半纖維素水解物(圖2)。并分析這一檢測波長條件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纖維素水解物經(jīng)生物脫毒處理之后，其中的糠醛及許多有毒的酚類物質(zhì)已被降解。本發(fā)明用對比生物發(fā)酵的方法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物的脫毒效果用CCTCCNO:M205067對比發(fā)酵經(jīng)CCTCCNO:M206097,或經(jīng)CCTCCNO:M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發(fā)酵產(chǎn)物木糖醇；或用CICC1770對比發(fā)酵經(jīng)CCTCCNOM206097，或經(jīng)CCTCCNO:M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發(fā)酵產(chǎn)物乙醇。可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過本發(fā)明所提供的生物菌株及脫毒方法處理后的半纖維水解物，無論用于木糖醇發(fā)酵或乙醇發(fā)酵，發(fā)酵物的產(chǎn)量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本發(fā)明提供的生物脫毒菌株及生物脫毒方法能有效地提高半纖維素水解物的發(fā)酵性能。本發(fā)明突出的實質(zhì)性特點和顯著進步是1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并提供的東方伊薩酵母CCTCCNO=M206097，西方伊薩酵母CCTCCNO=M206098這兩個菌株，對半纖維水解物中三大代表性微生物代謝抑制物以醋酸為代表的有機酸，以糠醛為代表的糖類降解產(chǎn)物，及以愈創(chuàng)木酚為代表的酚類化合物，均同時具有降解活性，它們對半纖維水解物均具有突出的生物脫毒活性。2.本發(fā)明利用東方伊薩酵母CCTCCNO=M206097，或西方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物降解半纖維素水解物中的多種有毒成分，事實減少了基質(zhì)中的雜質(zhì)。與傳統(tǒng)的理化脫毒工藝相比，用本發(fā)明對半纖維素水解物進行脫毒，顯然具有簡捷、低成本、及環(huán)境友好的突出優(yōu)勢。3.本發(fā)明提供的兩個脫毒活性菌株，其中CCTCCNO=M206097完全不能同化木糖、CCTCCNO=M206098對木糖的代謝能力也十分微弱，利用它們對半纖維素水解物脫毒，并并不會造成其中的木糖損失。由于這一特點，將它們與發(fā)酵木糖生成木糖醇，或發(fā)酵木糖生成乙醇的微生物置于同一發(fā)酵系統(tǒng)中，可實現(xiàn)半纖維水解物脫毒過程與木糖醇發(fā)酵，或與乙醇發(fā)酵相偶聯(lián)，極大地簡化發(fā)酵半纖維素水解物生產(chǎn)木糖醇發(fā)酵，或生產(chǎn)乙醇的工藝。圖1為抑制物經(jīng)脫毒活性菌株降解后的高效液相色譜變化。其中參數(shù)為(A)抑制物，(B)培養(yǎng)基，(C)添加了抑制物的培養(yǎng)基，(D)含抑制物的培養(yǎng)基經(jīng)CCTCCNO:M206097發(fā)酵脫毒，E含抑制物培養(yǎng)其經(jīng)CCTCCN0:M206098發(fā)酵脫毒。峰號與化合物1乙酸，2糠醛1，3愈創(chuàng)木酚，4、5培養(yǎng)基成分，6糠醛降解產(chǎn)物，7愈創(chuàng)木酚降解產(chǎn)物。圖2為蔗渣半纖維水解物生物脫毒前后的HPLC圖譜(檢測波長270nm)。其中參數(shù)為A，糠醛標樣；B，蔗渣半纖維水解物；CJ^CCTCCNO:M206098脫毒的蔗渣半纖維水解物；D，經(jīng)CCTCCNO:M206097脫毒的蔗渣半纖維水解物。具體實施例方式操作1稱已經(jīng)水洗并重新干燥過的蔗渣3kg，按固液比(w/v)為17加入H2S04溶液(2.5%,w/w)，120°C水解2h，離心收集濾液，濾渣水洗一次，合并濾液，用碳酸鈣固體調(diào)pH值至3，抽濾除去沉淀，得蔗渣半纖維素水解物。此水解物還原糖含量3%，木糖單糖占總糖的80%以上。操作2取已經(jīng)粉碎的干玉米芯2kg，按固液比17加入2%(w/w)WH2SO4溶液，120°C水解2h，收集液體部分，碳酸鈣中和至pH值3，抽濾除去沉淀物，得以玉米芯半纖維素稀酸水解液。此水解液總糖含量5%，其中木糖約占總糖的60%。操作3將東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098斜面接種到液體種子培養(yǎng)基上，200rmp,30°C搖床培養(yǎng)12h，得活化種子液。按15%(ν/ν)的接種量接入操作1，所得的蔗渣半纖維素稀酸水解液中，200rmp，33°C搖床發(fā)酵脫毒45h，離心上清液即為經(jīng)東方伊薩酵母CCTCCNOM206098生物脫毒的蔗渣半水解物。(或者按同條件，用西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097處理操作1的蔗渣半纖維素水解物，得到經(jīng)西方伊薩酵母CCTCCN0:M206097生物脫毒的蔗渣半纖維素水解物。)操作4操作3所得的經(jīng)生物脫毒處理的蔗渣半纖維素水解物，繼續(xù)真空濃縮至木糖150g/L，氨水調(diào)節(jié)至pH=6，另加入酵母膏5g/L，接入熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067種子液，接入量為5%(ν/ν)，200rmp，33°C進行發(fā)酵。對比HPLC檢測結(jié)果(表3)，經(jīng)過生物脫毒處理后的半纖維素水解物用于木糖醇發(fā)酵，不僅產(chǎn)物生成速率提高了一倍以上，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率也接近提高一倍。表3.生物脫毒處理對木糖醇發(fā)酵的影響(初始木糖濃度，150g/L;發(fā)酵時間，61.5h)^木糖木糖醇木糖醇木糖醇干細胞密脫毒^胃利用率濃度轉(zhuǎn)化率生成速率度_(%)(g/L)(g/g)(g/L.h)(g/L)對照組77.563.20.541.0314.6S-790125.00.932.0314.3Lj-393,O124.O0.89_LW_13.6操作5將操作1所得的半纖維素水解物，減壓濃縮至可溶性固形物木糖含量約120g/L，氨水調(diào)節(jié)至PH5，一組等量接入離心收集的東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098和熱帶假絲酵母CCTCCNO=M205067細胞，另一組則等量接入西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097細胞和熱帶假絲酵母CCTCCNO=M205067細胞。它們的總接種量均約為干細胞50g/L。33°C,200rpm條件下?lián)u瓶同步脫毒發(fā)酵30小時。結(jié)果(表4)表明，同步脫毒發(fā)酵能明顯提高發(fā)酵產(chǎn)物濃度，產(chǎn)物生成速率與產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。表4.半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵與直接發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇性能的比較(初始木糖，120g/L;發(fā)酵時間，30小時)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>操作6.將操作2所得的半纖維素水解物，減壓濃縮至可溶性固形物木糖含量約60g/L，氨水調(diào)節(jié)至pH5，分別按東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098與熱帶假絲酵母CCTCCNO=M205067組合，西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097與熱帶假絲酵母CCTCCNO:M205067組合的方式，進行等量混合細胞接種，總接種量約為培養(yǎng)其體積的5%，33°C，200rpm條件下?lián)u瓶同步脫毒發(fā)酵80小時。結(jié)果(表5)表明，同步脫毒發(fā)酵能明顯提高發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的生成速率與乙醇濃度。表5生物脫毒處理對木質(zhì)纖維素水解殘渣同步糖化發(fā)酵乙醇性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>參見圖1.抑制物經(jīng)脫毒活性菌株降解后的高效液相色譜變化。其中參數(shù)為(A)抑制物，(B)培養(yǎng)基，(C)添加了抑制物的培養(yǎng)基，(D)含抑制物的培養(yǎng)基經(jīng)CCTCCNOM206097發(fā)酵脫毒，E含抑制物培養(yǎng)其經(jīng)CCTCCNO:M206098發(fā)酵脫毒。峰號與化合物1乙酸，2糠醛1，3愈創(chuàng)木酚，4、5培養(yǎng)基成分，6糠醛降解產(chǎn)物，7愈創(chuàng)木酚降解產(chǎn)物。圖2為蔗渣半纖維水解物生物脫毒前后的HPLC圖譜(檢測波長270nm)。其中參數(shù)為A，糠醛標樣；B，蔗渣半纖維水解物；C，經(jīng)CCTCCNO:M206098脫毒的蔗渣半纖維水解物；D，經(jīng)CCTCCN0M206097脫毒的蔗渣半纖維水解物。表6生物脫毒處理之后蔗渣半纖維水解物中某些紫外吸收物的含量變化(檢測波長270nm)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求一種微生物菌株西方伊薩酵母Issatchenkiaoccidentalis(Lj-3)的用途，其特征在于，以所述微生物菌株西方伊薩酵母的純培養(yǎng)物接種至半纖維素水解物并進行培養(yǎng)，用于降解所述半纖維素水解物中的微生物代謝抑制物，進而用于實現(xiàn)對所述半纖維素水解物的生物脫毒。2.根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述微生物菌株西方伊薩酵母Issatchenkiaoccidentalis(Lj-3)為CCTCCNO:M206097及其馴化菌株。3.一種用于木糖醇生產(chǎn)的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，以具有生物脫毒功能的微生物菌株西方伊薩酵母Issatchenkiaoccidentalis(Lj-3),CCTCCNO:M206097的純培養(yǎng)物接種至半纖維素水解物，并同時向所述半纖維素水解物接種能發(fā)酵五碳糖生成木糖醇的微生物，使所述半纖維素水解物的生物脫毒、木糖醇發(fā)酵在同一個反應器內(nèi)同時完成。4.根據(jù)權利要求3所述的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，所述能發(fā)酵五碳糖生成木糖醇的微生物為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067。5.根據(jù)權利要求3或者4所述的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，所述半纖維素水解物需外加氮源，如無機氮源或有機氮源。6.根據(jù)權利要求5所述的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，所述無機氮源為尿素或者硫酸銨；所述有機氮源為酵母或者米糠熱水浸出物。7.一種用于乙醇生產(chǎn)的半纖維水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，以具有生物脫毒功能的微生物菌株西方伊薩酵母Issatchenkiaoccidentalis(Lj-3),CCTCCNO:M206097的純培養(yǎng)物，并同時向所述半纖維素水解物接種能發(fā)酵五碳糖生成乙醇的微生物，使所述半纖維素水解物脫毒與乙醇發(fā)酵在同一個反應器內(nèi)同時完成。8.根據(jù)權利要求7所述的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，所述能發(fā)酵五碳糖生成乙醇的微生物為嗜單寧管囊(Pachysolentannophilus)CICC1770。9.如權利要求7或者8所述的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，所述的半纖維素水解物需外加氮源，如無機氮源或有機氮源。10.根據(jù)權利要求9所述的半纖維素水解物同步脫毒發(fā)酵方法，其特征在于，所述無機氮源為尿素或者硫酸銨；所述有機氮源為酵母或者米糠熱水浸出物。全文摘要本發(fā)明涉及一種微生物菌株西方伊薩酵母Issatchenkiaoccidentalis(Lj-3)CCTCCNOM206097及其馴化菌株的用途，以所述微生物菌株西方伊薩酵母的純培養(yǎng)物接種至半纖維素水解物并進行培養(yǎng)，用于降解所述半纖維素水解物中的微生物代謝抑制物，進而用于實現(xiàn)對所述半纖維素水解物的生物脫毒。本發(fā)明還公開了用所述菌株制備木糖醇和乙醇的方法。與傳統(tǒng)技術相比，本發(fā)明生產(chǎn)效率，產(chǎn)品質(zhì)量更高。文檔編號C12R1/74GK101805703SQ200910000580公開日2010年8月18日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權日2009年1月16日發(fā)明者周玉恒,張厚瑞,蔡愛華,覃香香,陳海珊申請人:唐傳生物科技(廈門)有限公司