專利名稱：塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到利用DNA提取試劑盒和PCR-DGGE技術(shù)，對塔式蚯蚓生態(tài)濾池中的多級復(fù)合填料(土壤、砂石、碎青石)中的微生物群落組成進行分析檢測，屬于環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
塔式蚯蚓生態(tài)濾池是一種根據(jù)蚯蚓具有提高土壤透水性能和促進有機物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化的生態(tài)學(xué)功能而設(shè)計的一種生物、生態(tài)相結(jié)合技術(shù)，因為脫氮除磷能力強、運行費用低、無污泥產(chǎn)生等優(yōu)點，在農(nóng)村生活污水處理領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。為了提高廢水處理性能和穩(wěn)定性，人們對塔式蚯蚓生態(tài)濾池的運行條件和污染物去除機理進行了大量研究。廢水處理過程中主要是依賴土壤、砂石和碎青石中的微生物群落來降解和轉(zhuǎn)化污染物，但由于研究技術(shù)和手段的缺乏，人們對塔式蚯蚓生態(tài)濾池中微生物群落研究甚少，只好通過控制和監(jiān)控塔式蚯蚓生態(tài)濾池的物化參數(shù)來實現(xiàn)廢水的無害化排放。但這些物化條件的改變是否破壞微生物群落結(jié)構(gòu)，能否長期穩(wěn)定的達到廢水的高效處理，都是工程師們和微生物學(xué)家熱衷的問題。因此需要對參與廢水處理的微生物群落中各個種群的組成、豐度、分布及其在環(huán)境中生理生化特性進行全面研究，確定出塔式一級蚯蚓生態(tài)濾池、塔式二級蚯蚓生態(tài)濾池和塔式三級蚯蚓生態(tài)濾池在廢水處理過程中的優(yōu)勢微生物種群。以此為基礎(chǔ)改變操作條件，以適應(yīng)廢水生物處理中涉及的微生物的生長，優(yōu)化塔式蚯蚓生態(tài)濾池廢水處理效率。目前自然界中只有很少部分微生物能夠被分離和純化，因此傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和鑒定方法不足以代表微環(huán)境中的真實情況。rRNA基因同源分析方法是目前分子生物學(xué)研究的熱點，是多種分子生物學(xué)技術(shù)的組合，它通過對微生物的rRNA進行分析，揭示微生物的多樣性，是分子微生物生態(tài)學(xué)的重要方法，目前取得了大量的成果。同源性分析方法中包括環(huán)境樣品的總DNA提取，探針及引物的設(shè)計，PCR擴增，梯度電泳(DGGE&TGGE)，基因文庫的篩選，序列測定及分析，系統(tǒng)樹的構(gòu)建，原位雜交等技術(shù)。rRNA基因分析方法是微生物多樣性及微生物生態(tài)學(xué)研究方法的重大革新，使人們對微生物群體有全面的，進一步的認識。(denaturing gradient gelelect rophoresis) ^^ 才目同但是序列不同的DNA片斷的混合物，對于特異性引物PCR擴增的環(huán)境微生物的16SrDNA基因，一般的電泳很難將序列不同的片斷分開，DGGE膠在聚丙烯酰胺膠中添加了線性梯度的變性劑，可以形成從低到高的線性梯度，在一定的溫度下，同一濃度的變性劑中，不同序列的產(chǎn)物，其部分解鏈程度不同，DNA解鏈程度不同決定其電泳的遷移率，結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開。在變性條件適當(dāng)?shù)那闆r下，該技術(shù)能分辨一個堿基對，DGGE在微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，微生物種群的動態(tài)分析，富集培養(yǎng)物以及分離物的分析，16SrDNA同源性的分析中得到廣泛應(yīng)用。目前有利用DGGE技術(shù)分析污水廠污泥和工業(yè)廢水處理中的微生物群落的專利申請，但是用來處理農(nóng)村生活污水的塔式蚯蚓生態(tài)濾池填料復(fù)雜，微生物種類繁多，所以這方面的研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落組成的檢測技術(shù)，即填料中DNA的提取，總DNA的PCR再經(jīng)DGGE分離DNA條帶，分離的DNA再次PCR后測序進而對塔式蚯蚓生態(tài)中多種填料如土壤、砂石和碎青石中微生物群落組成進行檢測的技術(shù)。本發(fā)明技術(shù)方案是①塔式蚯蚓生態(tài)濾池不同填料層取多種填料進行預(yù)處理，利用DNA提取試劑盒提取基因組總DNA ；②設(shè)計16S rDNAV3 區(qū)引物 R3F和 1387R(—次PCR) ；338F-GC和 518R(二次PCR)]對樣品DNA進行巢式PCR擴增；③利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術(shù)分析PCR擴增產(chǎn)物，得到的DGGE圖譜利用Quantity one軟件分析；④特征DGGE條帶切割回收，樣品DNA再次PCR后測序分析，判定微生物種類；步驟①中，樣品的預(yù)處理取塔式蚯蚓生態(tài)濾池少量的土壤、砂石和碎青石放入無菌帶，放入冷凍干燥儀冷凍干燥后用研缽研磨，最后過100目的塞子，無菌帶分裝放入-20°c中冷藏備用。DNA提取采用Ultra Clean Soil DNA isolation KIT試劑盒，具體步驟是稱量0. 5g預(yù)處理完的填料樣品加到Bead Solution Tubes中，然后分別加60ul的SolutionSl和200ul的^S solution在漩渦儀上漩渦15min ；IOOOOg離心30s上清液轉(zhuǎn)移到2mlCollection Tubes 中，加 250ul Solution S2 漩渦 5s 然后 4°C下靜置 5min ；IOOOOg 離心 Imin 上清液轉(zhuǎn)移到 2mlCollection Tubes 中加 1. 3ml Solution S3 后漩渦，取 700ul溶液轉(zhuǎn)移到Spin Filter中IOOOOg離心lmin，棄掉過濾液，再取700ul溶液按上步驟操作直到Collection Tubes中的液體轉(zhuǎn)移完；把Spin Filter中的硅膠柱轉(zhuǎn)移到新的2mlCollection Tubes中，加入50ul Solution S5到硅膠柱的白色濾膜上，IOOOOg離心30s，DNA 轉(zhuǎn)移到了 Collection Tubes 中。步驟②中，使用16S rDNAV3區(qū)設(shè)計引物對提取的DNA進行擴增，一次PCR擴增條件為預(yù)變性94°C 5min,然后94°C變性45s，55°C退火lmin，72°C延伸4 共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。二次PCR擴增條件為預(yù)變性95°C lOmin，然后95°C變性lmin，63°C退火2min，72°C延伸lmin共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。步驟③中，DGGE分析PCR擴增產(chǎn)物的條件為制備變性劑尿素濃度梯度50% -75%，丙烯酰胺凝膠濃度為10%的變性梯度凝膠電泳(DGGE)，電泳電壓90V，電泳時間12h，二溴乙錠染色15min，脫色25min。步驟④中特征條帶回收DNA再次PCR，PCR引物為338F和518R，擴增條件預(yù)變性940C lOmin，然后94°C變性lmin，62°C退火2min，72°C延伸Imin共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。根據(jù)DGGE分離后的條帶經(jīng)測序并在Genbank中比對，判斷其代表的微生物種類。本發(fā)明的有益效果利用PCR-DGGE技術(shù)，初步判定出塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料的微生物群落組成。
①可以確定土壤、砂石和碎青石中的優(yōu)勢微生物②分析判斷出塔式蚯蚓生態(tài)濾池中一級、二級、三級土壤中微生物種群的變化，相應(yīng)的可以確定砂石和碎青石中的微生物群落變化③與污染物質(zhì)去除率聯(lián)合分析，分別確定出對有機物、氮和磷去除作用最大的微生物種類。


圖1復(fù)合填料DNA提取瓊脂糖電泳2復(fù)合填料一次PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳3復(fù)合填料二次PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳4復(fù)合填料PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖
具體實施例方式1、填料樣品收集、預(yù)處理用IOcm 8cm的無菌帶收集塔式蚯蚓生態(tài)濾池一級、二級、三級中的土壤(10cm)、砂石(5cm)和碎青石(3cm)填料50g左右，收集后在-80°C下冷凍干燥5天。冷凍干燥后的填料樣品用消過毒的研缽研磨，然后用100目的塞子過塞，過塞后分裝到新的無菌帶中在-20°C中冷藏。2、DNA提取、純化稱量0.5g預(yù)處理完的填料樣品加到Bead Solution Tubes中，然后分別加60ul的Solution Sl和200ul的IRS solution在漩渦儀上漩渦15min ； IOOOOg離心30s上清液轉(zhuǎn)移到 2mlCollection Tubes 中，加 250ulSolution S2 漩渦 5s 然后 4°C下靜置 5min ；IOOOOg 離心 Imin 上清液轉(zhuǎn)移到 2mlCollection Tubes 中加 1. 3mlSolution S3 后漩渦，取700ul溶液轉(zhuǎn)移到Spin Filter中IOOOOg離心lmin，棄掉過濾液，再取700ul溶液按上步驟操作直到Collection Tubes中的液體轉(zhuǎn)移完；把Spin Filter中的硅膠柱轉(zhuǎn)移到新的2mlCollection Tubes中，加入50ul Solution S5到硅膠柱的白色濾膜上，IOOOOg離心30s，DNA 轉(zhuǎn)移到了 Collection Tubes 中。DNA的提取液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)，顛倒混勻，12000rpm 4°C離心20min，收集上清液；加入0. 1倍體積3M NaAc (ρΗ5· 2)，顛倒混勻，再加入0. 6倍體積異丙醇4°C沉淀DNA Ih ；沉淀后12000rpm 4°C離心20min，棄上清液，DNA沉淀用冷的70%乙醇洗滌2次，冷凍干燥后溶于50 μ 1滅菌TE緩沖液中。 3、總DNA巢式PCR擴增用移液槍依次將試劑加入0. 2mlEP管中，加入順序如下無菌水 34. 75ul，IObuffer 5ul, MgCl2 (25mM) 4ul, dNTPs (2. 5mM)4ul, primerone(25mM) Iul, primer two (25mM) Iul, Taq 酶(5U/ul)0. 25ul，模板 DNAlul。每次試驗，以同體積無菌dd水代替樣品DNA做陰性對照，操作均在冰上進行。使用16S rDNA V3區(qū)設(shè)計引物對提取的DNA進行擴增，一次PCR擴增條件為預(yù)變性94°C 5min,然后94°C變性45s，55°C退火lmin，72°C延伸4 共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。二次PCR擴增條件為預(yù)變性95°C lOmin，然后95°C變性lmin，63°C退火2min，72°C延伸lmin共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。一次擴增引物63F和1387R，二次擴增正向引物338F-GC和反向引物 518R(5' -ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')。電泳稱取0. 36g瓊脂糖溶于30ml的ITAE中，高溫溶解至清澈透明。加1. 5ulEB,倒入做膠板，插入梳子，等待冷卻。膠體冷凝后拔出梳子，放入電泳槽中，每孔道加入3ul6buffer和5ul PCR產(chǎn)物的混合物，添加DNA MARKER作為DNA長度判斷的標尺。膠體在IOOmV電壓下跑25分鐘后于凝膠成像儀中觀察，拍照。4、DGGE電泳分析PCR產(chǎn)物制備變性劑尿素濃度梯度50% -75%，丙烯酰胺凝膠濃度為10%的變性梯度凝膠電泳(DGGE)。其中變性劑和丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增。待變性梯度膠完全聚合后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中，取PCR樣品15μ 1和相同體積的上樣緩沖液混合后加入上樣孔。60°C在90V電壓下，DGGE電泳12h，電泳結(jié)束后，將凝膠進行EB染色染色15min，脫色25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。5、特征條帶回收，測序分析微生物種類用酒精棉對刀片消毒，同一水平位置的特征條帶選較亮的一條割下，放入EP管中，加入30ul TE溶液溶解，4°C下靜置Mh，取溶解液做為DNA模板進行PCR擴增。50ul PCR反應(yīng)體系為無菌水 33. 75ul，IObuffer 5ul, MgCl2 (25mM) 4ul, dNTPs (2. 5mM) 4ul, primerone(25mM) lul,primer two (25mM) lul，Taq 酶(5U/ul) 0. 25ul，模板 DNA 2ul。PCR 擴增程序為預(yù)變性94°C lOmin，然后94°C變性lmin，62°C退火2min，72°C延伸Imin共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。根據(jù)DGGE分離后的條帶經(jīng)測序并在Genbank中比對，判斷其代表的微生物種類。
權(quán)利要求
1.一種塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其特征在于，具體步驟如下①分別在塔式蚯蚓生態(tài)濾池不同填料層取多種填料進行預(yù)處理；②利用DNA提取試劑盒提取基因組總DNA；③利用16SrDNAV3區(qū)引物對樣品DNA進行巢式PCR擴增；④利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術(shù)分析PCR擴增產(chǎn)物，得到的DGGE圖譜利用Quantity one軟件分析；⑤特征DGGE條帶切割回收，樣品DNA再次PCR后測序分析，判定微生物種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其特征為步驟①中所述多種填料預(yù)處理，包括塔式一級蚯蚓生態(tài)濾池、塔式二級蚯蚓生態(tài)濾池和塔式三級蚯蚓生態(tài)濾池中的土壤、砂石和碎青石填料。填料先經(jīng)過-80°C的冷凍干燥然后研磨、最后100目過塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其特征為步驟②中所述的DNA提取試劑盒，具體為MOBIO公司的Ultra Clean Soil DNA isolationKIT試劑盒,包括Bead SolutionTubes、2ml Collection Tubes、Spin Filter Units in 2m 1Tubes、IRS soIution>Solution SKSolution S2>SoIutionS3>Solution S4、Solution S5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其特征為步驟③中所述的16S rDNAV3區(qū)引物，設(shè)計的引物為63F和1387R( —次PCR) ；338F-GC和518R( 二次PCR)。一次PCR擴增條件為預(yù)變性94°C 5min，然后94°C變性45s，55°C退火lmin，72°C延伸4 共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。二次PCR擴增條件為預(yù)變性950C lOmin，然后95°C變性lmin，63°C退火2min，72°C延伸Imin共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其特征為步驟④中利用DGGE分析所述PCR擴增產(chǎn)物的條件為制備變性劑尿素濃度梯度50% -75%，丙烯酰胺凝膠濃度為10%的變性梯度凝膠電泳(DGGE)，電泳電壓90V，電泳時間12h，二溴乙錠染色15min，脫色25min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其特征為步驟⑤中特征條帶回收DNA再次PCR，PCR引物為338F和518R，擴增條件預(yù)變性940C lOmin，然后94°C變性lmin，62°C退火anin，72°C延伸Imin共30個循環(huán)，最后在72°C下延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種塔式蚯蚓生態(tài)濾池復(fù)合填料(土壤、砂石、碎青石)微生物群落組成分析方法，能夠較好的反應(yīng)出微生物種群多樣性和動態(tài)性變化。具體步驟如下①分別在塔式蚯蚓生態(tài)濾池不同填料層取樣進行預(yù)處理；②利用MOBIO DNA提取試劑盒提取基因組總DNA；③利用16S rDNA V3區(qū)設(shè)計引物對樣品DNA進行巢式PCR擴增；④利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術(shù)分析PCR擴增產(chǎn)物，得到的DGGE圖譜利用Quantity one軟件分析；⑤特征DGGE條帶切割回收，樣品DNA再次PCR后測序分析，判定微生物種類。
文檔編號C12Q1/04GK102559857SQ20101060861
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者汪龍眠, 王正芳, 羅艷, 郭敏, 郭飛宏 申請人:郭飛宏