專利名稱：一種提高2-酮基-l-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，尤其是一種利用明膠強(qiáng) 化關(guān)鍵氨基酸豐度以提升生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維生素C，又稱L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)，其工業(yè)化生產(chǎn)普遍采用“二步 發(fā)酵”工藝，即第一步反應(yīng)與“萊氏法”相同，由D-葡萄糖加氫生成的D-山梨醇先經(jīng)細(xì) 菌，如生黑葡萄糖酸桿菌力acier沢/has)、弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter suboxydans)或生黑醋酸桿菌(Acetobacter melanogenum)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖；第二 步為“二步發(fā)酵法”最主要的特點(diǎn)由普通生酮古龍酸菌(Jetogiilonigeniim vulgare，原 絮鑒定為Gluconobacter oxydans)和巨大芽胞桿菌、Baci 1 lusmegaterium)組成的混合 菌系催化L-山梨糖到維生素C前體一2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的反應(yīng)。在該混菌發(fā)酵體系中，只有普通生酮古龍酸菌能合成2-KLG，伴生菌巨大芽孢桿菌 不具有合成2-KLG的酶系，但在發(fā)酵過程中分泌的某些未知胞內(nèi)/胞外蛋白對(duì)普通生酮古 龍酸菌細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，從而促進(jìn)2-KLG產(chǎn)量顯著提高。目前，科學(xué)界對(duì)普通生 酮古龍酸菌和巨大芽孢桿菌兩菌間的生理關(guān)系沒有清晰、透徹的理解，從而難以從生理學(xué) 和工程學(xué)角度闡述影響維生素C “二步發(fā)酵”過程的規(guī)律，進(jìn)而難以提出更好的控制方法和 策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)生產(chǎn)強(qiáng) 度的方法。為解決上述技術(shù)問題，在普通生酮古龍酸菌Ofeio卵Awi^^i腫ra^are)和巨大 芽孢桿菌(Bacillus megaterium)組成的混合菌系中添加明膠強(qiáng)化L-甘氨酸和L-脯氨酸 豐度。本發(fā)明所用菌株普通生酮古龍酸菌(Ketogulonigeniim vulgare)和巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)混合菌系(2980)為江蘇江山制藥提供的菌株(一種2-酮基-L-古 龍酸高濃度發(fā)酵生產(chǎn)工藝，申請(qǐng)?zhí)?200810180630. 6)。所述明膠的濃度為0. 5^1. 5 g · L—1。所述明膠的濃度為0. 80 g · IA具體步驟為
(1) “一步發(fā)酵”培養(yǎng)
取新鮮黑醋酸桿菌Ucetobacter me lanogenum斜面，接種于“一步發(fā)酵”
種子培養(yǎng)基(75 mL/750 mL錐形瓶)，33 C，200 rpm振蕩培養(yǎng)16 h。將培養(yǎng)液按10%接種 量轉(zhuǎn)接種子罐(65 L/100 L攪拌罐)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。初始種子培養(yǎng)基pH值通過2 mol -L"1 醋酸溶液調(diào)為5. Γ5. 5，整個(gè)培養(yǎng)過程中不對(duì)pH值進(jìn)行控制，培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量 分別設(shè)置為 35° C, 150 rpm和 1 vvm (volume/volume/minute)。L-山梨糖含量達(dá)85 g以上到達(dá)終點(diǎn)后，將種子液以10%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐(650 L/1000 L攪拌罐)，培養(yǎng)條件 同上述種子罐。當(dāng)醇糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上即為發(fā)酵終點(diǎn)。獲得的培養(yǎng)液通過巴氏消毒法 (80° C, 30min)滅活黑醋酸桿菌，冷卻至2(Γ30° C后無(wú)菌保存，備用。(2) “二步發(fā)酵”培養(yǎng)
取普通生酮古龍酸菌和巨大芽胞桿菌混菌斜面接種于“二步發(fā)酵”種子培養(yǎng)基(75 mL/750 mL錐形瓶)，30 C，200 rpm振蕩培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)液按10%接種量轉(zhuǎn)接種子罐(65 L/100 L攪拌罐)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。初始種子培養(yǎng)基pH值用25% Na2CO3溶液調(diào)為6. 7 7. 0， 整個(gè)培養(yǎng)過程中不對(duì)PH值進(jìn)行控制，培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量分別設(shè)置為30° C，150 rpm 和 1 vvm (volume/volume/minute)。產(chǎn)酸達(dá) 5 10 g .Γ1，pH 值彡 6. 7 時(shí)，將二步種液按 10%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐(350 L/1000 L攪拌罐)。初始L-山梨糖濃度為15 25 g·!/1，發(fā) 酵壙8 h后開始連續(xù)流加L-山梨糖(即無(wú)菌一步發(fā)酵液)，控制流加過程中L-山梨糖濃度 為15 30 g ·ΙΛ當(dāng)流加總糖濃度達(dá)到80 85 g .L-1時(shí)流加結(jié)束。發(fā)酵起始pH值6. 7 7. 0， 24^40 h后調(diào)pH值7.廣7.3，發(fā)酵4(T44 h調(diào)pH值7. 4 7. 6，直至發(fā)酵結(jié)束。整個(gè)發(fā)酵過程 控制溶解氧在30 50%。本發(fā)明的原理本研究室利用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)獲得的關(guān)于普 通生酮古龍酸菌和巨大芽孢桿菌生理關(guān)系的理解并結(jié)合生化工程策略，確定了對(duì)2-KLG生 產(chǎn)強(qiáng)度有顯著促進(jìn)作用的關(guān)鍵氨基酸一L-甘氨酸和L-脯氨酸。然而，用自由氨基酸強(qiáng)化 2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度時(shí)，氨基酸費(fèi)用就成了重要的成本決定因素，限制了氨基酸在2-KLG工業(yè)化 生產(chǎn)中的應(yīng)用。經(jīng)過研究，我們發(fā)現(xiàn)通過廉價(jià)明膠強(qiáng)化L-甘氨酸和L-脯氨酸豐度可提升 2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度。相關(guān)培養(yǎng)基
“一步發(fā)酵”種子培養(yǎng)基(g.L-1) :D-山梨醇170，大豆蛋白胨2. 5，酵母膏2. 5，NaCO3 1. 5。用2 mol · L-1醋酸溶液調(diào)起始pH值為5.廣5. 5，121 C滅菌15 min ；
“一步發(fā)酵”發(fā)酵培養(yǎng)基(g·!^1) :D-山梨醇220，酵母膏0.46，大豆蛋白胨0.38， CaCO3 1。用2 mol · Γ1醋酸溶液調(diào)起始pH值為5.廣5. 5，121 C滅菌15 min ；
“二步發(fā)酵”種子/斜面培養(yǎng)基(g·!^1) :L-山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏 3，玉米漿 1.5，尿素 LCaCO3 LMgSO4 0. 2,KH2PO4 1，瓊脂 20 (斜面培養(yǎng)基)。用 2 mol NaOH溶液調(diào)起始pH值為6. Tl. 0，121 C滅菌15 min ；
“二步發(fā)酵”發(fā)酵初始培養(yǎng)基(g · Γ1) :L-山梨糖20，尿素12, CaCO3 5，MgSO4 0.1， KH2PO4 1，玉米漿5。明膠在發(fā)酵起始時(shí)添加，用25% Na2CO3溶液調(diào)起始pH值為6. 7 7.0， 121 C滅菌15 min,明膠的濃度為0. 5 1. 5 g · L—1，最佳濃度為0. 80 g · L-1。2-KLG和L-山梨糖濃度的測(cè)定
2-KLG碘量法測(cè)定準(zhǔn)確吸取樣品2 mL，于25 mL試管中，加入2 mL 7 mol · L—1的硫 酸，搖勻于沸水中加熱煮沸25 min，取出稍冷后用蒸餾水分次洗入250 mL三角瓶中，以淀粉 為指示劑，用0.1 mol · L—1碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色(30 s不褪色即可)為終點(diǎn)。2-KLG含量計(jì)算公式
權(quán)利要求
一種提高2 酮基 L 古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特征在于在普通生酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)組成的混合菌系發(fā)酵中添加明膠強(qiáng)化L 甘氨酸和L 脯氨酸豐度。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述普通生酮古龍酸菌和巨大芽孢桿菌組成的 混合菌可大量積累2-KLG。
3.權(quán)利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述明膠的濃度為0.5^1. 5 g · L—1。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述明膠的濃度為0.80g·!/1。
全文摘要
一種提高2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過添加廉價(jià)明膠，強(qiáng)化普通生酮古龍酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)混菌發(fā)酵體系關(guān)鍵氨基酸—L-甘氨酸和L-脯氨酸豐度，從而達(dá)到經(jīng)濟(jì)、高效生產(chǎn)2-KLG的目的。在2-KLG混菌發(fā)酵過程中，當(dāng)用0.8g/L明膠強(qiáng)化L-甘氨酸和L-脯氨酸豐度時(shí)，2-KLG發(fā)酵周期縮短至43h(縮短15.6%)，2-KLG濃度可達(dá)81.43g·L-1，2-KLG產(chǎn)酸速率為1.89g·(L·h)-1(增加25.2%)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101985646SQ201010578780
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者劉杰, 劉立明, 陳克杰, 陳堅(jiān), 黃建民 申請(qǐng)人:江南大學(xué)