專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化制備s-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，特別涉及一種 以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266為生物催化劑、以3_酮基四氫呋 喃為底物制備(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃的新方法。
背景技術(shù)：
(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃((S) - (+)-3-Hydroxytetrahydrofuran)，CAS 登錄號 86087-23-2，分子式C4H8O2，分子量88. 11。(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃是合成治療艾滋病藥 物安普那韋的一個重要的中間體。在二苯醚類除草劑農(nóng)藥中引入(S)-(+)-3-羥基四氫呋 喃基團(tuán)后可以明顯提高二苯醚類除草劑的除草活性和選擇性。文獻(xiàn)報道中(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃的合成可以通過二氫呋喃的不對稱硼 氫化或氫硅化得到，需要手性催化劑，手性催化劑制備過程繁瑣，價格昂貴；可以通過 4-氯-3-羰基丁酸酯的不對稱氫化-還原-分子內(nèi)醚化制備，該方法成本較高，不適于工業(yè) 化生產(chǎn)；可以通過3-羥基四氫呋喃消旋體的酶法拆分制備，酶法拆分的拆分效率最高只能 達(dá)到50%，生產(chǎn)效率較低；可以通過蘋果酸的還原-分子內(nèi)醚化合成，但此方法需要用昂貴 的氫化鋁鋰來還原蘋果酸二酯，而且需要保護(hù)仲羥基以防止消旋。上述的制備方法多數(shù)情 況下產(chǎn)物的光學(xué)純度不夠，或者存在著分離提取困難等不利于工業(yè)化生產(chǎn)的因素。采用微生物轉(zhuǎn)化法不對稱還原3-酮基四氫呋喃可以獲得對映體過剩值較高的光 學(xué)純(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃，常溫常壓下即可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，成本 低廉。微生物細(xì)胞中含有還原過程中需要的輔酶供氫體，同時微生物細(xì)胞中含有豐富的酶 系有利于通過在反應(yīng)液中添加廉價的輔助底物(如蔗糖或葡萄糖)實現(xiàn)輔酶的原位再生， 大大提高底物的轉(zhuǎn)化效率，理論上底物可以100%地轉(zhuǎn)化為(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃。微 生物易于大規(guī)模培養(yǎng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，微生物轉(zhuǎn)化法是制備(S)-(+)-3-羥基四氫 呋喃的綠色合成工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，該方法 催化效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、成本低廉，易于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)_3-羥基四氫呋喃的方法，所述方法是以3-酮基四氫 呋喃為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌 體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述S-(+)-3-羥基四氫呋喃。本發(fā)明所述方法在如下條件下進(jìn)行在pH 5.0 8.0的磷酸鹽緩沖液中，以3-酮 基四氫呋喃為底物，以釀酒酵母CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于 25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述S_(+)_3_羥 基四氫呋喃。
所述3-酮基四氫呋喃在磷酸鹽緩沖液中的初始濃度為1 lOmmol/L。所述含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計為1 70g/g3_酮基四氫呋喃底物；所述含 酶菌體細(xì)胞干重的測定是將發(fā)酵液離心分離后，棄去上清液，將濕細(xì)胞在120°C烘干48小 時至恒重，測定干細(xì)胞的重量；取部分發(fā)酵液中離心所得濕細(xì)胞測定細(xì)胞干重，計算出發(fā)酵 液中單位含酶菌體細(xì)胞中干細(xì)胞比率，再以這個比率計算定量細(xì)胞干重所需含有含酶菌體 細(xì)胞發(fā)酵液用量。所述磷酸鹽緩沖液中添加有終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，有利 于提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率。所述含酶菌體細(xì)胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵培 養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，26 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含酶菌 體細(xì)胞。本發(fā)明所述S-(+)_3-羥基四氫呋喃分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液 4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙 酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液減壓蒸餾除去乙 酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃。所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)_3-羥基四氫呋喃的方法，推薦按照以下步驟進(jìn)行 (1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，^ 35°C培養(yǎng)4 6天得菌 體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜 面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 2 得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖^5 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸 銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L, K2HPO4 · 3Η200· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L,用 NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；( 發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積 分?jǐn)?shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為沈 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，分離得到含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度 組成為葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸銨3 6g/L，無水MgSO4O. 2 0. 4g/L， K2HPO4 ·3Η20 0· 5 1. 5g/L，KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用 NaOH 或 HCl 溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的 pH 值為7.0，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH 5.0 8.0的磷酸鹽緩沖液中，加入1 lOmmol/L 的3-酮基四氫呋喃，添加10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，以及細(xì)胞干重質(zhì)量為3-酮 基四氫呋喃1 50倍的含酶菌體細(xì)胞，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時，反應(yīng)結(jié)束制 得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等 體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉 除去少量水分，抽濾，濾液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃。釀酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保 藏中心，位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)，保藏號CGMCC No. 2266，保 藏日期2007年11月沈日，已在先前授權(quán)專利200810059686中作為新菌株予以保護(hù)。菌株來源本發(fā)明中所述的微生物菌株釀酒酵母CGMCC No. 2266是從杭州西湖啤 酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌株用于轉(zhuǎn)化3-酮基四氫呋喃，得到釀 酒酵母CGMCC No. 2266具有良好的轉(zhuǎn)化3-酮基四氫呋喃生產(chǎn)(S) - (+)-3-羥基四氫呋喃的能力。所述釀酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光 澤、平坦、邊緣整齊、濕潤、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。具體的，本發(fā)明用微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)_3-羥基四氫呋喃的方法，按照以下步驟 進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，沈 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/ L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌 20min，滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，沈 35°C，搖床轉(zhuǎn) 速為150 200r/min，培養(yǎng)18 沈1!得種子液；所述的種子培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖 26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η200· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積比10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 溫度為26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h得到含有含酶菌體細(xì)胞的 發(fā)酵液，離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入1 10mmol/L的3_酮 基四氫呋喃，添加10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物有利于提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率，以及 細(xì)胞干重質(zhì)量為3-酮基四氫呋喃1 50倍的含酶菌體細(xì)胞，于25 45°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng) 8 40小時；(5)分離純化反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將 上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入 無水硫酸鈉除去少量水分，抽濾后，得到的乙酸乙酯溶液減壓蒸餾除去乙酸乙酯即得所述 (S)-(+)-3-羥基四氫呋喃。本發(fā)明(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃純品可用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測確定產(chǎn)物 的純度和分子量。本發(fā)明摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃的對映體過剩值(ee% )的確 定采用氣相色譜分析檢測。色譜柱為Varian CP Chirasil-DEX手性柱。該手性柱 可以檢測到(R)-(-)-3-羥基四氫呋喃和(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃兩種對映體的含量，進(jìn) 一步計算出反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃的對映體過剩值(ee% )。本發(fā)明中采用微生物細(xì)胞不對稱還原3-酮基四氫呋喃制備( - (+) -3-羥基四氫 呋喃，可以獲得高對映體過剩值的產(chǎn)品，添加終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底 物，有利于提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明采用的微生物轉(zhuǎn)化法制備(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃與化學(xué)合成法、酶催 化法相比具有以下優(yōu)點(1)生產(chǎn)菌株安全無毒，微生物菌體易于大規(guī)模培養(yǎng)，可以獲得大量的生物催化劑，比化學(xué)催化劑成本低廉；(2)操作簡便，反應(yīng)過程中不需要添加價格昂貴 的輔酶，通過添加輔助底物葡萄糖可以大幅度提高底物的轉(zhuǎn)化效率，收率高；C3)易于實現(xiàn) 大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；(4)常溫常壓下就能實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，是 (S) - (+) -3-羥基四氫呋喃的清潔合成工藝。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此斜面培養(yǎng)基的配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂 20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，冷卻后制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組 成配制葡萄糖 30g/L，酵母粉 3g/L，硫酸銨 5g/L，無水 MgSO4O. 25g/L，K2HPO4 · 3H20 lg/L， KH2P04lg/L，溶劑為水，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7.0，121°C滅菌20min。實施例1將CGMCC No. 2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面。用接種 針從菌體斜面上取一接種環(huán)菌體接種在含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、 180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將IOmL種子液(接種量以培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)10% 計)接種于含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)Mi 獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，得含酶菌體細(xì)胞。菌體干重的測定是將發(fā)酵液離心后從含酶菌體細(xì)胞的濕菌體中取小部份在120°C 烘干48小時至恒重，測定干細(xì)胞的重量，計算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細(xì)胞中干細(xì)胞比 率，再以這個比率計算定量細(xì)胞干重所需含有含酶菌體細(xì)胞發(fā)酵液用量。本實施例的每升 發(fā)酵液中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為50克。在10份含有IOOmL pH7. 0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中分別加入上述所得200毫升 發(fā)酵液離心后獲得的濕細(xì)胞，其中含有含酶菌體細(xì)胞的干重為10g，各自加入3-酮基四氫 呋喃，使3-酮基四氫呋喃的終濃度分別為lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、 6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L 和 10mmol/L，置于 30°C，180r/min 的搖床中反應(yīng) 24h。 反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙 酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去少量水 分，抽濾，濾液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃，底物初始濃度 對S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的摩爾轉(zhuǎn)化率及對應(yīng)體過剩值(ee%)的影響見表1。表1 底物初始濃度對轉(zhuǎn)化率及(S)-(+)_3-羥基四氫呋喃的影響
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所述方法是以 3-酮基四氫呋喃為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo. 2266發(fā)酵獲 得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制得所述S-(+)-3-羥基四氫呋喃。
1.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于 所述方法為在PH 5. O 8. O的磷酸鹽緩沖液中，以3-酮基四氫呋喃為底物，以釀酒酵母 CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40 小時，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述S-(+)-3-羥基四氫呋喃。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所 述3-酮基四氫呋喃在磷酸鹽緩沖液中的初始濃度為1 lOmmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所 述含酶菌體細(xì)胞用量以細(xì)胞干重計為1 70g/g底物。
4.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所 述磷酸鹽緩沖液中還添加有終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所 述含酶菌體細(xì)胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖 床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，26 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含酶菌體細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于 所述S- (+) -3-羥基四氫呋喃分離純化方法如下反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心20 分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在 乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述 (S)-(+)-3-羥基四氫呋喃。
7.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所 述方法按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基， ^ 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；( 種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子 培養(yǎng)基，26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 2 得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng) 取種子液，以體積分?jǐn)?shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為沈 35°C，搖 床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；(4) 生物轉(zhuǎn)化在PH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度為1 lOmmol/L的3-酮基四 氫呋喃，再添加終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，以及以細(xì)胞干重為3-酮基 四氫呋喃質(zhì)量1 50倍的含酶菌體細(xì)胞，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時，反應(yīng)結(jié)束 制得轉(zhuǎn)化液；(5)分離純化將轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液 用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫 酸鈉除去水分，抽濾，濾液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃。
8.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法，其特征在于所 述方法按照以下步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCCNo. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天 得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨 4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，沈 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 2 得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖沈 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積比10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度 為26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h得到含有含酶菌體細(xì)胞的發(fā)酵 液，離心分離得到所述含酶菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖沈 32g/L， 酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L， KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(4)生物轉(zhuǎn)化在pH5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入1 lOmmol/L的3-酮基四 氫呋喃，再添加終濃度10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，以及細(xì)胞干重為3-酮基四氫 呋喃1 50倍的含酶菌體細(xì)胞，于25 45°C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 40小時，反應(yīng)結(jié)束制得轉(zhuǎn)化 液；(5)分離純化反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液 用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫 酸鈉除去水分，抽濾，濾液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羥基四氫呋喃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物轉(zhuǎn)化制備S-(+)-3-羥基四氫呋喃的方法在pH 5.0～8.0的磷酸鹽緩沖液中，以3-酮基四氫呋喃為底物、以釀酒酵母CGMCC No.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，于25～45℃下轉(zhuǎn)化反應(yīng)8～40小時，反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述S-(+)-3-羥基四氫呋喃；本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在(1)生產(chǎn)菌株安全無毒，易于大規(guī)模培養(yǎng)，成本低廉；(2)操作簡便，反應(yīng)過程中不需要添加價格昂貴的輔酶，收率高；(3)易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；(4)反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。
文檔編號C12P17/14GK102071231SQ20101056780
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者歐志敏, 沈文和, 陳慶美, 隋志紅 申請人:浙江九洲藥業(yè)股份有限公司, 浙江工業(yè)大學(xué)