專利名稱：一種豬細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的重要病原體之一，主 要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及弱子等特征，此外PPV還與非化膿性心肌炎、 皮炎、腸炎及病毒血癥等有關(guān)，PPV能加重豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)引起的 斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，大型集約化豬場(chǎng)的相繼出 現(xiàn)，該病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。1966年Mary和Mahnel首次于豬瘟病毒組織中分離到該病毒并證實(shí)了其病原作 用。此后在歐、美、亞、非及大洋洲很多國(guó)家均有報(bào)道。我國(guó)于1982年由中國(guó)獸藥監(jiān)察所分 離到該病毒，此后在上海、黑龍江、吉林、四川、浙江等地均分離到該病毒，雖然各地分離的 PPV來(lái)源不同，名稱各異，但均為同一型，血清學(xué)上無(wú)差別。隨著研究的深入，國(guó)內(nèi)外眾多的 科研工作者已從多方面對(duì)此病毒進(jìn)行了不同層次的研究。目前，PPV的診斷方法主要有病原學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法、分子生物學(xué)診 斷方法。病原學(xué)診斷方法是PPV最確切的一種實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但從流產(chǎn)胎兒組織接種細(xì) 胞分離病原操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力。血清學(xué)診斷方法主要包括血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn) (HI)、血清中和試驗(yàn)(SN)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作(ELLISA)。血 清學(xué)試驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)單，但是其靈敏性較低，易出現(xiàn)非特異反應(yīng)，在感染初期，由于低水平抗體 效價(jià)的影響，尤其是對(duì)隱性感染動(dòng)物往往漏檢，從而造成了本病的流行和蔓延。分子生物學(xué) 診斷方法主要是各種PCR技術(shù)和核酸探針雜交，這些方法具有高特異性和高靈敏度，引物 與探針可以大量合成并長(zhǎng)期保存，檢測(cè)速度快、結(jié)果可靠，避免散毒等優(yōu)點(diǎn)，在畜禽傳染病 的檢測(cè)、鑒別診斷方面已得到了廣泛應(yīng)用。但PCR技術(shù)也存在其缺陷，最主要的問(wèn)題是成本 較高，技術(shù)性較強(qiáng)，操作煩瑣，設(shè)備昂貴，樣品檢測(cè)費(fèi)用較高，故不適合于基層診斷和大規(guī)模 流行病學(xué)調(diào)查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒 基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)，可以快速 檢測(cè)豬細(xì)小病毒。本發(fā)明提供了檢測(cè)豬細(xì)小病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用引物 組成；一對(duì)引物是與豬細(xì)小病毒的基因組DNA (GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與豬細(xì)小病毒的基因組DNA (GenBankAccession Number NC-001718)中NSl基因結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與豬細(xì)小病毒的基因組 DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl 基因結(jié)合的環(huán)形引物對(duì)。NSl 基因?yàn)?PPV全基因組中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1的基因，如GenBank AccessionNumber NC-001718中自5，末端第292至2280位核苷酸所示。所述專用引物的靶序列具體可為豬細(xì)小病毒的基因組DNA (GenBank AccessionNumber NC-001718)中NSl基因的部分區(qū)域，該部分區(qū)域的核苷酸序列如序列表 的序列1所示。所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)由上游引物FIP和下游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷 酸序列具體可為序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具體可為序列表中的 序列5 ；所述外側(cè)引物對(duì)由上游引物F3和下游引物B3組成，所述上游引物F3的核苷酸序 列具體可為序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3 ； 所述環(huán)形引物對(duì)由上游引物L(fēng)F和下游引物L(fēng)B組成，所述上游引物L(fēng)F的核苷酸序列具體可 為序列表中的序列6，所述下游引物L(fēng)B的核苷酸序列具體可為序列表中的序列7。F3 :5，-CAAGCAACAATGGCTAGCTATATG-3，(序列表的序列 2)；B3 5' -GTTGGTGTTGTTGGCTCGC-3‘(序列表的序列 3)；FIP :5，-GTATTTATTGGGGTTTGCATTTTTTTATCATTGGGGAAATGTACCTGAT-3，(序列表的 序列4)；BIP 5，-ACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCTTTTGCTAAATCCAGGTCCTCCTGT-3，(序列表的 序列5)；LF :5，-GCTCCTCCCATTTTTCTGAC-3，(序列表的序列 6)；LB :5，-ACAACAACTACGCAGCAACTC-3，(序列表的序列 7)。應(yīng)用所述專用引物檢測(cè)豬細(xì)小病毒的原理如下根據(jù)豬細(xì)小病毒的基因組DNA (GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl 基 因的部分區(qū)域(GenBank Accession Number NC-001718 自 5’末端第 1918-2144 位核苷酸； 序列表的序列1)設(shè)計(jì)一組用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，即內(nèi)側(cè)引物對(duì)(內(nèi)側(cè)上游引物FIP 和內(nèi)側(cè)下游引物BIP)、外側(cè)引物對(duì)(外側(cè)上游引物F3和外側(cè)下游引物B3)和環(huán)形引物對(duì) (環(huán)形上游引物L(fēng)F和環(huán)形下游引物L(fēng)B)。三對(duì)引物和所述區(qū)域變異區(qū)域的八個(gè)特定區(qū)域的 序列完全配對(duì)(見(jiàn)表1)，可以確保反應(yīng)的徹底進(jìn)行，也保證了檢測(cè)方法的特異性。表1專用引物與豬細(xì)小病毒的基因組DNA的結(jié)合區(qū)域
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)豬細(xì)小病毒的專用引物，由以下三對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所用引物組成；一對(duì) 引物是與豬細(xì)小病毒的基因組DNA中NSl基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與豬細(xì)小病 毒的基因組DNA中NSl基因結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與豬細(xì)小病毒的基因組DNA中 NSl基因結(jié)合的環(huán)形引物對(duì)；所述NSl基因如GenBank Accession NumberNC-OO 1718中自 5，末端第292至2280位核苷酸所示。
2.如權(quán)利要求1所述的專用引物，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)由上游引物FIP和下 游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP 的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)由上游引物F3和下游引物B3組成，所 述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表 中的序列3 ；所述環(huán)形引物對(duì)由上游引物L(fēng)F和下游引物L(fēng)B組成，所述上游引物L(fēng)F的核苷 酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物L(fēng)B的核苷酸序列是序列表中的序列7。
3.權(quán)利要求1或2所述的專用引物在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒用于檢測(cè)待測(cè) 樣本中是否含有豬細(xì)小病毒和/或輔助鑒定豬細(xì)小病毒。
4.一種含有權(quán)利要求1或2所述的專用引物的試劑盒；所述試劑盒用于檢測(cè)待測(cè)樣本 中是否含有豬細(xì)小病毒和/或輔助鑒定豬細(xì)小病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括溶液B；所述溶液B由溶 劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下所述上游引物F3為2. 4-3. 6pmol/ μ 1，所述下游引物Β3為2. 4-3. 6pmol/μ 1，所述上游引物FIP為20-28pmol/μ 1，所述下 游引物BIP為20-28pmol/ μ 1，所述上游引物L(fēng)F為IO-Hpmol/ μ 1，所述下游引物L(fēng)B為 10-14pmol/y 1。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述溶液B中，所述上游引物F3為3pmol/ μ 1，所述下游引物Β3為3ρπι01/μ 1，所述上游引物FIP為24ρπι01/μ 1，所述下游引物BIP 為24ρπι01/μ 1，所述上游引物L(fēng)F為12pm0l/l·! 1，所述下游引物L(fēng)B為12pmol/y L·
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括溶液A；所述 溶液A由溶劑和溶質(zhì)組成；所述溶劑為水；所述溶質(zhì)及其濃度如下KC1為16. 67nmol/yl, MgSO4 · 7H20 為 13. 33nmol/y 1，(NH4)2SO4 為 16. 67nmol/y 1，鈣黃綠素為 0. 083nmol/y 1， MnCl2 · 4H20 為 lnmol/μ 1，四種脫氧核苷酸各 2. 33hmol/y 1，甜菜堿為 0. 33ymol/y 1，IM pH8. 8Tris-HCl 為 33· 33nmol/y 1，Tween-20 為 0. (體積百分含量)，Bst DNA 聚合酶 為 0. 8υ/μ 1。
8.—種檢測(cè)來(lái)自死亡動(dòng)物的樣品中是否攜帶豬細(xì)小病毒的方法，是用權(quán)利要求1或 2所述專用引物對(duì)來(lái)自死亡動(dòng)物的樣品的總DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn) 物，確定來(lái)自死亡動(dòng)物的樣品中是否攜帶豬細(xì)小病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為 60-65 °C、30-90min。
9.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求4至7中任一所述試劑盒在檢測(cè)待測(cè)樣本 中是否含有豬細(xì)小病毒中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2所述專用引物或權(quán)利要求4至7中任一所述試劑盒在輔助鑒定豬 細(xì)小病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括三對(duì)引物，即與豬細(xì)小病毒的基因組DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)、外側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)。本發(fā)明的豬細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度高，最低可檢測(cè)出10個(gè)拷貝的靶DNA，操作簡(jiǎn)單方便，特別適于基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)及食品中可能污染的豬細(xì)小病毒的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102002539SQ201010561158
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者吳文學(xué), 李佳禾, 黃書(shū)林 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)