專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及水稻活體轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn) 基因方法，適用于秈稻和粳稻，以及各種可以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的的質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
1983年，美國華盛頓大學(xué)植物學(xué)家Zambryski等用切去成瘤基因的根瘤農(nóng)桿菌 (At)首次實現(xiàn)了抗卡那霉素基因(npt II)在煙草上的轉(zhuǎn)基因試驗，使轉(zhuǎn)基因的煙草具有 抗卡那霉素的特性(王琴芳等，2000)。這一開創(chuàng)性的研究拉開了全球性的轉(zhuǎn)基因植物研 究、開發(fā)和利用的新的農(nóng)業(yè)技術(shù)革命。如美國孟山都公司把編碼蘇云金桿菌的毒素蛋白 基因引入到棉花、煙草等植物上，最先培育出抗蟲棉和抗蟲煙草新品種。越來越多的事例證 明，轉(zhuǎn)基因植物不僅可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)；也可用于生產(chǎn)有益于人們身體健康的 食品、藥品和促進環(huán)境保護的化工產(chǎn)品的開發(fā)。因此，開拓轉(zhuǎn)基因植物研究具有廣闊的應(yīng)用 前景。自1996年第一個轉(zhuǎn)基因作物品種商業(yè)化種植以來，全世界轉(zhuǎn)基因作物的種植面積逐 年增加，2000年以后年均增長率達到15%，現(xiàn)已有轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜已進入大 規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用階段。至2005年，全球轉(zhuǎn)基因作物面積達9000萬公頃。以轉(zhuǎn)基因性狀而 言，面積最大的是抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物，其次是抗蟲轉(zhuǎn)基因作物。如我國抗蟲棉的種植面積 占棉花總面積的66%以上(黃軍英，2007)。現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因水稻、番茄、馬鈴薯、煙草等重要農(nóng) 作物也在逐步進入商業(yè)化階段。水稻是世界上最重要的糧食作物，因此，水稻的遺傳改良一直備受人們關(guān)注，它對 保障世界糧食安全和提高人們生活水平意義重大。但據(jù)文獻報道，目前水稻的轉(zhuǎn)基因方法 主要還是通過愈傷組織，不僅耗時長、效率低，而且受基因型的限制(秦代錦等，2008)。尤 其秈稻由于組織培養(yǎng)的分化再生頻率低，一直是限制水稻基因工程規(guī)?；瘧?yīng)用的瓶頸(寧 約瑟等，2007)。因此，自從轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生以來，人們一直在探索適合水稻的轉(zhuǎn)基因方法， 改良水稻品質(zhì)和產(chǎn)量。2000年《科學(xué)》雜志報道德國和瑞士的科研人員合作將含有3種外源 基因(兩個來自水仙花，一個來自細菌)轉(zhuǎn)化水稻品種獲得了金稻品種，能夠產(chǎn)生維生素A 原。2005年，英國的科學(xué)家通過進一步努力，將金稻進一步改進，獲得了可以商品化的金稻 品種，其Vitamin A的生產(chǎn)能力達到35mg/g以上，這對改善非洲和亞洲地區(qū)青少年Vitamin A缺乏起到重要的推動作用(Tang，2009)。此外，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)合作成功地獲得了轉(zhuǎn)Bt基因雜交水稻，對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟的毒殺效果 達到95%。但這些水稻遺傳工程的進展并沒有帶來轉(zhuǎn)基因方法學(xué)上的突破，因此，水稻轉(zhuǎn) 基因的研究仍然是水稻遺傳工程的障礙之一。為了探討如何利用外源有利基因改良水稻品 種，多年來，人們一直在進行各種嘗試，探討、研究水稻的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過多年的試驗和探索，我們以特定的外源表達載體作為研究對象，采用農(nóng)桿菌 溶液注射浸泡減數(shù)分裂和四分體時期的幼穗，感染幼嫩的生殖組織，將外源基因整合到受 體植株的基因組中。為了便于規(guī)模化應(yīng)用，我們采用攜帶有⑶S和Bar基因的雙標記表達 載體。在經(jīng)過簡單的除草劑噴施篩選即可獲得株陽性水稻，并可通過進一步的PCR分子定性檢測陽性株。在我們的研究中，曾注射過上百個稻穗，轉(zhuǎn)化效率達0. 33-1. 59%。并經(jīng)PCR和⑶S 染色雙重檢測證明外源質(zhì)粒整合到受體水稻的基因組中并正常表達。更為重要的是，本研 究采用的是秈稻品種9311作為受體，充分證明了該方法在秈稻中應(yīng)用的可行性。因此，它 的成功將使秈稻的轉(zhuǎn)化不再成為水稻遺傳工程的障礙，為我國廣泛栽培的秈稻的生物技術(shù) 的應(yīng)用開創(chuàng)了光明的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于在于提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，方法易 行，操作簡便，該發(fā)明涉及生產(chǎn)上種植的秈稻和粳稻品種，都有較好轉(zhuǎn)化效率。該方法涉及 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌濃度范圍的選擇，以農(nóng)桿菌溶液的0D_值在0. 3 0. 6時轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)?？捎?于農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化水稻的外源質(zhì)粒，植物表達質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)可以有效地將外源 基因整合在水稻基因組中。轉(zhuǎn)化水稻發(fā)育時期的選擇，不論秈稻和粳稻，在水稻小孢子減數(shù) 分裂期和四分體時期是最有效的轉(zhuǎn)化時期。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)措施一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，其步驟是1、幼穗轉(zhuǎn)化處理利用分光光度計測定農(nóng)桿菌濃度后，將農(nóng)桿菌菌株EH105A(購自北京鼎國昌盛生 物技術(shù)有限責任公司)溶液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至0D_值0. 3 0. 6，然后按Iml分裝在 1. 5ml離心管中備用。注射處理根據(jù)水稻發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征，選擇小孢子減數(shù)分裂至四分體時期的幼 穗，掛上標簽，做好記號。注射時，首先用注射器吸取Iml農(nóng)桿菌，右手拿注射器，左手捏住 穗莖的中部，將注射器斜著從中上部輕輕插入，當手感到突然被插空的感覺時，表示此時針 頭已經(jīng)插入莖中空腔。然后慢慢推動注射器，緩緩將農(nóng)桿菌液注進穗腔。如果有液體外滲， 說明沒有找準莖中空腔，需將注射器拔出重新插入。注射后，套袋、掛牌，并在標簽牌注明品 種、日期、濃度和發(fā)育時期。注射處理40 50天后，收獲成熟稻穗。2、轉(zhuǎn)基因陽性苗的除草劑篩選由于轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA3301_ubi(購買自Bios Cambialab公司)攜帶抗除草劑 草胺磷(Basta)基因，因此，利用除草劑草胺磷可以有效篩選轉(zhuǎn)基因陽性水稻。篩選時，將 pCAMBIA3301-ubi轉(zhuǎn)化處理所獲得的種子常規(guī)方法(丁穎主編，中國水稻栽培學(xué)，中國農(nóng)業(yè) 出版社，1961)催芽后，全部播種于營養(yǎng)缽中，以非轉(zhuǎn)基因9311 (請見遺傳資源表)為對照， 苗期2葉1心時噴施濃度為50mg/l的草胺磷，連續(xù)噴施兩天，每天一次。四天后，絕大部分 植株變黃，一周后，除了陽性轉(zhuǎn)基因幼苗仍然綠色外，其他的假陽性苗子全部枯死。將這些 表現(xiàn)正常的抗性植株移栽至新的培養(yǎng)盆中，用于后續(xù)的分子檢測。3、轉(zhuǎn)基因陽性株的檢測PCR鑒定為了更進一步驗證抗除草劑草胺磷篩選出的陽性植株的可靠性，申請 人又提取了其葉片的總DNA進行PCR檢測。本實驗所設(shè)計的ubi引物(ubi-F TGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC ；ubi-R TTCTATCGCGGCTTAACGTAATTCA)擴增出的目的片段大 小為200bp左右，如果轉(zhuǎn)基因植株中擴增出一條特異性、與目的帶大小一致的200bp條帶，即說明篩選出的轉(zhuǎn)基因水稻為陽性植株。而9311和陰性對照都沒有任何擴增產(chǎn)物。4、轉(zhuǎn)基因陽性株的⑶S檢測為了更進一步鑒定外源基因是否在受體植株中正常表達，申請人采用組織化學(xué)染 色法分析了 GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達。具體即取對照9311和轉(zhuǎn)基因陽性植株的新 鮮葉片直 接浸泡在0. 5mg/ml的X-Gluc (5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷)溶液中處理3h，觀 察轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因在水稻中的表達。染色結(jié)果顯示，GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的葉片 中強表達，葉片被染色成深藍色；而對照9311的葉片為淺色，和陽性水稻形成鮮明的對照。 結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因正常表達，進一步證明其為陽性。 本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明不需要組織培養(yǎng)，因此，可以避免水稻組織培養(yǎng)過程中的秈稻分化比率 低所帶來的基因型限制；(2)本發(fā)明免除了組織培養(yǎng)所需要的專門培養(yǎng)室，簡化了實驗條件，大幅度降低了 實驗費用；(3)本發(fā)明操作程序簡單、方便，材料消耗少，大幅度提高轉(zhuǎn)化效率(4)本發(fā)明充分利用除草劑在苗期進行規(guī)?；Y選，空間少、時間短，簡單易行，高 效低耗。進一步證明外源基因已經(jīng)整合到受體水稻的基因組中。該研究證明水稻活體轉(zhuǎn)基 因方法具有可行性，轉(zhuǎn)化效率達0. 33-1. 59%。該法簡便、實用，突破了水稻尤其是秈稻轉(zhuǎn)基 因操作的技術(shù)瓶頸，具有較強的應(yīng)用價值。表1.農(nóng)桿菌活體轉(zhuǎn)化法與組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)缺點比較
權(quán)利要求
1. 一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，其步驟是A、幼穗轉(zhuǎn)化處理利用分光光度計測定農(nóng)桿菌濃度后，將農(nóng)桿菌溶液用液體LB培養(yǎng)基 稀釋至0D600值0. 3 0. 6，然后按Iml分裝在1. 5ml離心管中備用；注射處理選擇減數(shù)分裂至四分體時期的幼穗，掛上標簽，做好記號，注射時，首先注射 器吸取Iml農(nóng)桿菌，將注射器斜著從中上部插入，推動注射器，將農(nóng)桿菌液注進穗腔，注射 后，套袋、掛牌，并在標簽牌注明品種、日期、濃度和發(fā)育時期，注射處理40 50天后，收獲 成熟稻穗；B、轉(zhuǎn)基因陽性苗的除草劑篩選轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA3301-ubi攜帶抗除草劑草胺磷基 因，利用除草劑草胺磷篩選轉(zhuǎn)基因陽性水稻，篩選時，將pCAMBIA3301-ubi轉(zhuǎn)化處理所獲得 的種子常規(guī)方法催芽后，播種于營養(yǎng)缽中，以非轉(zhuǎn)基因9311為對照，苗期2葉1心時噴施濃 度為50mg/l的Basta，連續(xù)噴施兩天，每天一次，四天后，絕大部分植株變黃，一周后，除了 陽性轉(zhuǎn)基因幼苗仍然綠色外，其他的假陽性苗子全部枯死，將正常的抗性植株移栽至新的 培養(yǎng)盆中，用于后續(xù)的分子檢測；C、轉(zhuǎn)基因陽性株的檢測PCR鑒定為了進一步驗證抗除草劑篩選出的陽性植株，提取 了其葉片的總DNA進行PCR檢測，所設(shè)計的ubi引物ubi_F: TGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC ； ubi-R: TTCTATCGCGGCTTAACGTAATTCA擴增出的目的片段大小為200bp，轉(zhuǎn)基因植株中擴增 出一條特異性、與目的帶大小一致的200bp條帶，篩選出的轉(zhuǎn)基因水稻為陽性植株；D、轉(zhuǎn)基因陽性株的⑶S檢測為了更進一步鑒定外源基因在受體植株中正常表達，采 用組織化學(xué)染色法分析了 GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達，取對照9311和轉(zhuǎn)基因陽性植株 的新鮮葉片直接浸泡在0. 5 mg/ml的X-Gluc :5_溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷溶液中處理3h， 觀察轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因在水稻中的表達，染色結(jié)果顯示，GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的葉片 中表達，葉片被染色成深藍色；對照9311的葉片為淺色，和陽性水稻形成鮮明的對照，轉(zhuǎn)基 因水稻中外源基因正常表達，進一步證明為陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，其步驟A、幼穗轉(zhuǎn)化處理利用分光光度計測定農(nóng)桿菌濃度后，將農(nóng)桿菌溶液用液體LB培養(yǎng)基稀釋；B、轉(zhuǎn)基因陽性苗的除草劑篩選除草劑進行轉(zhuǎn)基因陽性水稻的篩選，篩選時，將pCAMBIA3301-ubi轉(zhuǎn)化處理所獲得的種子催芽后，播種于營養(yǎng)缽中；C、轉(zhuǎn)基因陽性株的檢測PCR鑒定篩選出的轉(zhuǎn)基因水稻為陽性植株；D、轉(zhuǎn)基因陽性株的GUS檢測取對照9311和轉(zhuǎn)基因陽性植株的新鮮葉片直接浸泡在溶液中處理，GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的葉片中表達，葉片被染色成深藍色；轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因正常表達，證明其為陽性。本發(fā)明具有可行性，轉(zhuǎn)化效率達0.33-1.59%，簡便、實用，突破了水稻尤其是秈稻轉(zhuǎn)基因操作的瓶頸，具有較強的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/82GK102061309SQ201010560948
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者朱英國, 李紹清, 田裴秀子 申請人:武漢大學(xué)