專利名稱：奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及其制備方法，特別是 經(jīng)基因定點(diǎn)缺失的奶牛大腸桿菌重組工程菌乳房炎滅活疫苗(稱奶牛大腸桿菌乳房炎滅 活疫苗，又稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)制備方法，用于大腸桿菌感染性奶牛乳房炎 的免疫預(yù)防。屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧業(yè)發(fā)展、食品安全、人類健 康的重大傳染病，特別是近年環(huán)境改變、抗生素濫用耐藥，超級(jí)細(xì)菌出現(xiàn)，細(xì)菌感染奶牛乳 房炎發(fā)病率和死亡率逐年攀升，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展、食品安全和人類健康，由此再次敲響 警鐘，奶牛乳房炎已成為國(guó)計(jì)民生的頭等大事，疫苗防控勢(shì)在必行。據(jù)國(guó)際奶牛聯(lián)合會(huì)報(bào)告，全球有2. 2億頭奶牛，因理化所致奶牛乳房炎發(fā)病率明 顯下降，而病原微生物感染奶牛乳房炎呈顯著上升，其發(fā)病率高達(dá)60%以上。引發(fā)奶牛乳 房炎的病原達(dá)140余種，主要是細(xì)菌類占主流，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌感 染占90%以上，且由多種病原菌共同或單獨(dú)引起。據(jù)臨床流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)奶牛乳 房炎以大腸桿菌、金葡菌和鏈球菌病原菌為主，占細(xì)菌感染的91. 4%，其中大腸桿菌感染達(dá) 30%，大腸桿菌按0抗原分就有130多個(gè)型，與當(dāng)前國(guó)際報(bào)道感染菌種和型及流行趨勢(shì)相一 致，均可直接由一種大腸桿菌或者多種大腸桿菌混合感染引起的乳腺炎，成為危害奶業(yè)發(fā) 展的主要病原菌。奶牛乳腺炎可分為臨床型和隱性型，臨床型乳區(qū)發(fā)熱、腫痛、泌乳量減少， 乳汁性狀發(fā)生改變，細(xì)菌數(shù)增多、體細(xì)胞增加，重者并發(fā)多器官衰竭，甚至死亡；隱性型乳腺 炎沒(méi)有特異的臨床表現(xiàn)，僅通過(guò)體細(xì)胞、產(chǎn)奶量及質(zhì)量檢測(cè)才能檢出，但奶牛罹患率比臨床 型高得多，造成病原微生物的進(jìn)一步播散，在一定條件下轉(zhuǎn)化成臨床型，實(shí)際損失可能比臨 床型高得多。奶牛乳房炎不但影響奶牛生活質(zhì)量和產(chǎn)量，而且經(jīng)濟(jì)損失也明顯突出，如發(fā)達(dá) 美國(guó)每年達(dá)30億美元、英國(guó)4億美元，我國(guó)35億元以上，尤其是奶制品及肉食品抗菌素及 細(xì)菌產(chǎn)物嚴(yán)重超標(biāo)，已成為國(guó)計(jì)民生的社會(huì)現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。目前奶牛乳房炎治療抗生素為首選，大量抗生素使用造成耐藥，而得不到有效控 制，已嚴(yán)重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展。人們最大愿望就是通過(guò)接種疫苗有效控制奶牛乳房炎，其 目的就是增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，特別是乳腺組織的免疫應(yīng)答反應(yīng)來(lái)阻止、中和、殺滅外界 進(jìn)入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特點(diǎn)給有效免疫力的產(chǎn)生帶來(lái)了 了一系列特殊 的挑戰(zhàn)。第一，乳房炎是乳腺組織的炎癥，然而免疫應(yīng)答增強(qiáng)在奶?；既榉垦椎那闆r下并不 總是有益的。免疫反應(yīng)的一個(gè)重要組成部分是大量的嗜中性粒白細(xì)胞從血液遷移到感染的 乳腺來(lái)發(fā)揮作用。在現(xiàn)實(shí)牛奶中出現(xiàn)大量的體細(xì)胞并不認(rèn)為是好事，因?yàn)轶w細(xì)胞數(shù)量增加 說(shuō)明奶牛已患乳房炎，并且此時(shí)牛奶品質(zhì)、產(chǎn)量會(huì)明顯下降。第二，乳腺中的牛奶會(huì)稀釋抗 感染的嗜中性粒細(xì)胞的濃度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中 性粒細(xì)胞的殺菌能力。第三，奶牛飼養(yǎng)有大量可引起乳房炎的微生物的環(huán)境中，而且奶汁本 身給病原菌生長(zhǎng)提供了溫床。因此，使奶牛乳腺產(chǎn)生有效的免疫力，降低乳房炎的發(fā)生率， 需要攻克的難題較多，給奶牛乳房炎疫苗研發(fā)提出比其它傳染病疫苗更高的要求。疫苗是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能從而使機(jī)體獲得天然的抗病能力，并且疫苗 具有安全、穩(wěn)定、有效等特點(diǎn)，因此研制安全、有效的奶牛乳腺炎疫苗成為防控乳腺炎的必由選擇。用于預(yù)防大腸桿菌感染引發(fā)乳腺炎的大腸桿菌疫苗MastiguarcK由E. coli (0111 B4) J-5菌株研制)和沙門(mén)氏菌疫苗(S. typhimuriumR/17菌株研制)，已在美國(guó)、歐洲等地 得到了廣泛應(yīng)用，隨后美國(guó)加州大學(xué)與我國(guó)合作推廣該疫苗，奶牛戶普遍反映費(fèi)用很高，使 用效果不理想，沒(méi)有得到認(rèn)可，其主要原因是中國(guó)奶牛飼養(yǎng)環(huán)境和帶菌狀況緊密相關(guān)，由此 研發(fā)適宜本國(guó)流行代表菌株和環(huán)境的疫苗勢(shì)在必行。國(guó)內(nèi)研究的奶牛大腸桿菌乳腺炎疫苗 均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，但由于乳腺炎病原菌復(fù)雜，乳腺免疫具有獨(dú)特性質(zhì)，研究不深入， 菌苗制造過(guò)程中存在技術(shù)難題，使得尚無(wú)高效、商業(yè)化運(yùn)作成熟、廣泛使用的奶牛大腸桿菌 乳腺炎疫苗。奶牛大腸桿菌是引起急性和亞急性乳腺炎的主要環(huán)境病原菌，種型繁多，重要 抗原有0、K、H3種，且多數(shù)有莢膜，菌毛等。為了防止不同種型細(xì)菌感染，疫苗要么含大量的 不同抗原，要么只含不同細(xì)菌共有的保護(hù)性抗原。尋找不同菌株的共同抗原是國(guó)際上通行 的做法。不同株的大腸桿菌寡糖側(cè)鏈有很大不同，而核心多糖和脂多糖A在不同菌株之間 的變異比寡糖側(cè)鏈小的多。J-5大腸桿菌乳腺炎疫苗正是把變異較大的大腸桿菌寡糖側(cè)鏈 缺失而使其共同核心抗原暴露在外，刺激產(chǎn)生的免疫球蛋白能夠抵抗革蘭氏陰性菌的核心 抗原，對(duì)種類繁多的大腸桿菌均產(chǎn)生保護(hù)。而仔豬大腸桿菌病雙價(jià)基因工程活疫苗利用基 因突變技術(shù)保留毒素的免疫原性而去除了毒性，口服免疫母豬，通過(guò)哺乳仔豬，保護(hù)仔豬抵 抗黃痢、白痢，為研發(fā)奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗提供了新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗及其制備方法，特別是 經(jīng)基因定點(diǎn)缺失的奶牛大腸桿菌重組工程菌乳房炎滅活疫苗(稱奶牛大腸桿菌乳房炎滅 活疫苗，又稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)制備方法；本發(fā)明的目的還在于公開(kāi)該疫苗 可用于大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的免疫預(yù)防。發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、通過(guò)對(duì)我國(guó)內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等東西南北中30個(gè)省 市90個(gè)中大型奶牛場(chǎng)、近3萬(wàn)頭奶牛乳腺炎奶汁樣品，分離、鑒定奶牛乳房炎大腸桿菌株， 確定了我國(guó)大腸桿菌0 008、01216、02138、02555等菌株為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株。在本發(fā)明的方法中，包括但不限于0 008、01216、02138、02555大腸桿菌株作為 奶牛大腸桿菌乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株；包括任何適宜于制備奶牛乳房炎大腸桿疫苗生產(chǎn) 的當(dāng)前和今后廣泛流行大腸桿菌野生株。2、通過(guò)構(gòu)建自殺致死質(zhì)粒pCVD442-galE，運(yùn)用同源重組技術(shù)敲除0 008、01216、 02138和02555等大腸桿菌候選優(yōu)勢(shì)菌株的LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而不影 響除0抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選到X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大 腸桿菌重組工程菌株，在體外普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，傳代穩(wěn)定、免疫原性良好的奶牛大腸 桿菌乳房炎疫苗優(yōu)勢(shì)候選菌株。在本發(fā)明的方法中，包括但不限于乂-10、乂-89、乂-326、乂-2138和乂-2555等大腸桿 菌重組工程菌株作為奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株；包括通過(guò)該方法制備的其它突變菌疫 苗株。3、本發(fā)明選用X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌優(yōu)勢(shì)疫苗株，制 備優(yōu)勢(shì)流行菌株的兔血清，與已有國(guó)內(nèi)外臨床分離奶牛大腸桿菌乳房炎菌野生株及從ATCC購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)株免疫交叉中和保護(hù)達(dá)97%以上，由此選用的奶牛乳房炎X-10、X-89、X-326、 X-2138和X-2555等大腸桿菌優(yōu)勢(shì)疫苗株具有代表國(guó)內(nèi)外流行株和疫苗株。4、選用X-IO大腸桿菌突變株為代表的優(yōu)勢(shì)疫苗株，接種于TSB等培養(yǎng)基中， 35-36°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后劃線接種TSA瓊脂和5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取符合標(biāo) 準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)混合接種TSB半固體、液體培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基若干、置35-36°C培養(yǎng) 20-24小時(shí)，斜面培養(yǎng)基細(xì)菌用脫脂牛奶沖下，第二代建立了奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗 原始種子批、第三代建立主種子批、第四代建立工作種子批庫(kù)，菌種分裝，凍干后-80°C保 存。進(jìn)-步通過(guò)理化性質(zhì)、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的X-IO大腸桿 菌疫苗菌株三級(jí)種子批庫(kù)符合疫苗生產(chǎn)用要求。在本發(fā)明專利中，包括但不限于X-IO大腸桿菌建立種子批庫(kù)；包括通過(guò)該方法 制備的大腸桿菌基因工程菌(稱奶牛大腸桿菌，又稱X-大腸桿菌)株建立疫苗株種子批庫(kù) 的疫苗生產(chǎn)。5、通過(guò)奶牛X-IO大腸桿菌苗工作種子批株，從IOL到1000L發(fā)酵放大培養(yǎng)，培養(yǎng) 基是TSB，制備了 X-IO奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制 備了純化大腸桿菌滅活全菌，抗原純度達(dá)95% ；通過(guò)對(duì)溫度、時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu) 化，獲得了規(guī)?；a(chǎn)滅活全菌抗原原液；進(jìn)一步進(jìn)行血清型別、理化性質(zhì)、基因特征、外源 因子、免疫原性等全面鑒定。在本發(fā)明專利中，包括但不限于X-IO大腸桿菌工作種子批菌株、TSB和LB培養(yǎng)基 用于疫苗原液規(guī)?；a(chǎn)；包括適用于大腸桿菌基因工程菌株、及LB等培養(yǎng)基作為生產(chǎn)介 質(zhì)。6、制備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌抗原，有效劑量抗原與適量不含有 佐劑或含有白花油、FIA、鋁鹽、MF59、SP01和SP02等疫苗佐劑中的一種或幾種，制備有或無(wú) 佐劑的奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型，分別免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛動(dòng)物，間隔28天， 皮下免疫2次，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體重、 體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及ELISA、ELISP0T測(cè)定抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫水平及死亡情況。試驗(yàn)結(jié) 果可見(jiàn)，這幾種佐劑均能提高奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗抗體滴度、依次是FIA、白花油、 SP0UMF59和鋁鹽佐劑，且在不同動(dòng)物呈現(xiàn)一致性趨勢(shì)。由此SP01、SP02、MF59、白花油、FIA 和鋁鹽均可有效的作為奶牛乳房炎滅活疫苗的佐劑。在本發(fā)明專利中，包括但不限于制備X-IO大腸桿菌滅活疫苗，包括X-89、X-326、 X-2138和X-2555等其它大腸桿菌疫苗株用于制備奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型；包含 但不限于SPO1、SP02、MF59、白花油、FIA和鋁鹽佐劑，還包括免疫刺激復(fù)合物、免疫分子、脂 質(zhì)體、TLR和NLR配體等佐劑；制備有或無(wú)佐劑的奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型。7、本發(fā)明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗注射劑型可皮下注射，也可以肌肉注 射、乳頭管注射，也可以一種或幾種聯(lián)合，制備有或無(wú)佐劑的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫 苗，分別免疫BALB/c、豚鼠、家兔和奶牛動(dòng)物，觀察過(guò)敏性反應(yīng)、異常毒性、熱源質(zhì)反應(yīng)、一般 毒性。結(jié)果表明奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗制品接種動(dòng)物是安全的。8、本發(fā)明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗有或無(wú)佐劑的滅活疫苗，分別免疫 BALB/c、家兔和奶牛動(dòng)物，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞，觀察奶牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì) 量、體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌數(shù)、抗體效價(jià)、脾細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子變化，通過(guò)量效、時(shí)效、次效測(cè)定抗體和細(xì)胞免疫水平以評(píng)價(jià)免疫原性；進(jìn)一步在2-3歲即將進(jìn)入泌乳期(即產(chǎn)前 25d，懷孕8個(gè)月20d)健康奶牛，免疫劑量是有效抗原劑量(比如1 5X IOltlCFU)的滅活 全菌疫苗，0，28，56天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)，末次免疫后14天用 1000CFU大腸桿菌野生菌株乳區(qū)內(nèi)注射攻毒，間斷采集奶汁、血清、血細(xì)胞及脾細(xì)胞，觀察奶 牛奶產(chǎn)量、奶汁質(zhì)量、體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌數(shù)、抗體效價(jià)、脾細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子等指標(biāo) 評(píng)價(jià)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，制備的不管是皮下或是以肌肉或是乳頭管注射、不管是有佐劑 或是無(wú)佐劑奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗都有產(chǎn)生高效價(jià)抗體滴度，與劑量呈相關(guān)，加佐 劑好于無(wú)佐劑組，在不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)，在奶牛體內(nèi)免疫保護(hù)率85%以上。9、本發(fā)明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗有或無(wú)佐劑的滅活疫苗制品，分別置于 4°C、室溫(20-25) °C和37°C，從外觀、pH、蛋白含量、動(dòng)物免疫原性等指標(biāo)觀察疫苗穩(wěn)定性。 結(jié)果表明，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性良好，有效期2年以上。10、本發(fā)明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗用于不同品種、不同年齡奶牛免疫接 種預(yù)防奶牛乳房炎發(fā)生。綜上所述，該疫苗經(jīng)基因定點(diǎn)缺失的大腸桿菌重組工程菌乳房炎滅活疫苗(稱奶 牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，又稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)，具有代表國(guó)內(nèi)外大腸 桿菌感染所致奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)流行菌株。用奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗優(yōu)勢(shì)菌株，制備 奶牛乳房炎大腸桿菌等株兔抗血清，與現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外臨床分離奶牛乳房炎大腸桿菌代表株免 疫交叉中和達(dá)97%以上，由此選擇奶牛乳房炎大腸桿菌疫苗株具有代表國(guó)內(nèi)外大腸桿菌感 染奶牛乳房炎廣譜流行株特征。建立X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批 和工作種子批庫(kù)，經(jīng)全面鑒定符合疫苗生產(chǎn)的要求。TSB或LB等培養(yǎng)基放大培養(yǎng)工業(yè)化生 產(chǎn)，制備奶牛大腸桿菌乳房炎菌苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取等工藝，制備了純 化奶牛乳房炎大腸桿菌滅活全菌抗原；為奶牛大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗。該疫苗中可 以不含有佐劑，制備無(wú)佐劑的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗。該疫苗中可以含有佐劑，佐 劑為如下的一種①SP01，為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚混勻水包油樣； ②SP02，為2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細(xì)菌鞭毛混勻水包油；③白 花油，為商品化佐劑；④MF59，為商品化佐劑；⑤FIA，為商品化佐劑；⑥鋁鹽，為氫氧化鋁或 磷酸鋁。佐劑也可如上的兩種或多種組合或其它佐劑。制備有佐劑的奶牛大腸桿菌乳房 炎滅活疫苗。該疫苗制備成臨床適用的注射劑型皮下注射劑型、肌肉注射劑型、乳頭管注 射劑型；微針透皮劑型等。該疫苗有或無(wú)佐劑的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，通過(guò)皮下 或肌肉或乳頭管注射，表明該疫苗都能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，皮下注射高于肌肉、乳頭管途 徑；免疫加佐劑好于無(wú)佐劑組，在不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗在奶牛體內(nèi)免疫保護(hù)率90 %以上。該疫苗制品在動(dòng)物體內(nèi)使用安全，無(wú)不良反應(yīng)。該疫苗制品放置2 8°C穩(wěn)定性 良好，有效期暫定2年。該疫苗制品通過(guò)皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮的一種 或幾種聯(lián)合用于不同品種、不同年齡奶牛的免疫接種，可安全、穩(wěn)定、有效預(yù)防大腸桿菌感 染性奶牛乳房炎的發(fā)生。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是選擇我國(guó)奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)大腸桿菌流行菌株，采用同源重組進(jìn) 行大腸桿菌寡糖側(cè)鏈缺失，使其缺乏鳥(niǎo)苷二磷酸半乳糖異構(gòu)酶，篩選共同核心抗原暴露在 外的大腸桿菌突變株作為候選疫苗株、進(jìn)一步通過(guò)滅活全菌為疫苗靶抗原、與加入或不加入疫苗佐劑制備奶牛大腸桿菌重組工程菌滅活菌苗(稱奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，又 稱X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗)注射劑型、微針透皮劑型，為安全、高效、全面有效預(yù)防 大腸桿菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保證，是奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗發(fā)展的一個(gè)重大 突破。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1 篩選并確定奶牛大腸桿菌乳房炎流行優(yōu)勢(shì)菌株作為候選疫苗菌株從覆蓋我國(guó)東西南北中的內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東等30個(gè)省 市地90個(gè)中大型奶牛場(chǎng)采集近3萬(wàn)份臨床奶牛乳房炎奶汁樣品，分離檢定，篩選并確定奶 牛大腸桿菌感染乳房炎優(yōu)勢(shì)流行菌株；1.奶牛乳樣的采集選取出現(xiàn)臨床癥狀(或者懷疑為亞臨床型乳房炎)乳房炎奶 牛，先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時(shí)進(jìn) 行手指擦拭消毒。每個(gè)乳室先擠去頭2 3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣至少 5mL于無(wú)菌乳樣杯中，待檢。2.將乳樣搖勻，分別取適量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯、TSB培養(yǎng)基、鮮血瓊脂、新鮮脫纖維 綿羊血平板、麥康凱瓊脂平板、TSA平板后，置于37°C溫箱培養(yǎng)24 48h。觀察每個(gè)平板中 細(xì)菌生長(zhǎng)的情況，記錄菌落生長(zhǎng)表現(xiàn)。普通瓊脂平板和TSA平板上，37°C，24 72h培養(yǎng)后，可見(jiàn)到光滑、濕潤(rùn)、表面有 光澤、隆起的圓形乳白色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、鏡檢呈直桿狀，單個(gè)或成對(duì)。革蘭 氏陰性，并挑取單個(gè)可疑菌落移植于肉湯和斜面培養(yǎng)基，經(jīng)37°C培養(yǎng)24 48h。營(yíng)養(yǎng)肉湯 中呈渾濁生長(zhǎng)；在麥康凱培養(yǎng)基上，菌落呈圓形、粉紅色、光滑、濕潤(rùn)、表面有光澤、全緣。血 瓊脂上生長(zhǎng)并形成灰白色菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象，但在選擇性羊血培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。大腸桿菌生 化鑒定，氧化酶試驗(yàn)陰性；糖發(fā)酵試驗(yàn)?zāi)芊纸馄咸烟恰⑷樘?、甘露醇、阿拉伯糖、麥芽糖、?糖、棉子糖產(chǎn)酸，不能利用丙二酸鹽、枸櫞酸鹽、山梨醇、側(cè)金盞花醇。甲基紅陽(yáng)性，苯丙氨酸 脫氫酶試驗(yàn)為陰性，硫化氫試驗(yàn)為陰性，脲酶試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原反應(yīng)為陽(yáng)性，明膠液化 反應(yīng)為陰性，凝固酶反應(yīng)為陰性，DNA酶試驗(yàn)陰性，接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性。3.酶切質(zhì)粒圖譜分析將分離0 008、01216、02138、02555等奶牛大腸桿菌乳房炎 菌株提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA大小及酶切片斷符合奶牛乳房炎大腸桿菌特征。4. SDS分析菌體主要蛋白組分將其分離0 008、01216、02138、02555奶牛大腸桿 菌乳房炎菌株進(jìn)行SDS-PAGE，可見(jiàn)呈26-30余條大小不等蛋白條帶，進(jìn)一步免疫印跡符合 奶牛乳房炎大腸桿菌蛋白條帶特征。5.致病性分析將其分離0 008、01216、02138、02555等奶牛金葡菌乳房炎菌株在 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，分離純化各血清型金葡菌菌株分別注入6-18周BALB/c鼠腹腔3 X IO8 個(gè)活菌、1. 5-2歲家兔腹腔IX IO9個(gè)活菌數(shù)、3-4歲奶牛乳管1000個(gè)活菌，可使小鼠、家兔 動(dòng)物發(fā)病，有些動(dòng)物甚至在1周內(nèi)死亡，對(duì)奶牛觀察奶產(chǎn)量與質(zhì)量、體溫、體重、體細(xì)胞數(shù)、 排菌數(shù)等檢測(cè)。對(duì)接種后發(fā)病、死亡動(dòng)物等觀察。進(jìn)行菌落涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查， 觀察所分離菌株為奶牛大腸桿菌乳房炎主要的致病菌。以上通過(guò)選擇性培養(yǎng)基上分離與篩選、生化鑒定、基因分析、BALB/c、家兔、奶牛 動(dòng)物的致病性等評(píng)價(jià)，確定并命名為0 008、01216、02138、02555等大腸桿菌為我國(guó)流行優(yōu) 勢(shì)株，占奶牛乳房炎大腸桿菌90%以上，為候選奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優(yōu)勢(shì)株提供了依據(jù)。實(shí)施例2 構(gòu)建奶牛乳房炎大腸桿菌基因工程優(yōu)勢(shì)菌株及篩選確定疫苗菌株1、采用致死質(zhì)粒同源重組方法，通過(guò)構(gòu)建自殺致死質(zhì)粒pCVD442_galE，運(yùn)用同源 重組常規(guī)方法敲除0 008、01216、02138和02555等大腸桿菌候選優(yōu)勢(shì)菌株的LPS編碼基因 galE以暴露其核心抗原，影響脂多糖合成，而不影響除0抗原之外的其它抗原的免疫原性， 篩選缺乏大腸桿菌鳥(niǎo)苷二磷酸半乳糖異構(gòu)酶突變菌株。2、從中篩選并命名為X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌基因工程 菌株，在體外普通培養(yǎng)基中傳代生長(zhǎng)良好，該菌株免疫Balb/c小鼠、豚鼠具有良好安全性 和免疫原性，初步確定為奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗優(yōu)勢(shì)候選菌株。實(shí)施例3 制備奶牛大腸桿菌乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株免疫血清及檢定從確定具有代表性X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌基因工程菌 株，制備純化菌株抗原，分別用5 X 107CFU/lml劑量皮下免疫家兔(大腸桿菌抗原及抗體陰 性)，免后21天心臟放血，血清抗體效價(jià)達(dá)到1 3200以上，再分別與臨床分離奶牛乳房 炎大腸桿菌毒株、購(gòu)買美國(guó)ATCC和中國(guó)菌種庫(kù)主要奶牛乳房炎大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行免疫 試驗(yàn)，結(jié)果顯示免疫中和交叉率達(dá)97%，由此確定所選用的奶牛X-10、X-89、X-326、X-2138 和X-2555等大腸桿菌基因工程菌(X-大腸桿菌)株優(yōu)勢(shì)疫苗株具有廣泛的代表性。實(shí)施例4 建立奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗株三級(jí)種子批庫(kù)及檢定以確定X-IO乳房炎大腸桿菌優(yōu)勢(shì)疫苗株為例，接種于TSB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24 小時(shí)，收取菌液，建立三級(jí)種子批庫(kù)及全面檢定。1.原始種子批的建立選取X-IO乳房炎大腸桿菌優(yōu)勢(shì)株菌落劃線接種TSA培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，置37°C培養(yǎng)20-24小時(shí)培養(yǎng)，用脫脂牛奶沖下，第二代作為原始種子批庫(kù)，加入 5 %脫脂奶粉分裝于凍存管，凍干后-70 V以下長(zhǎng)期保存。2.主種子批的建立取第二代X-IO大腸桿菌奶牛乳房炎原始種子批菌株接種于 TSB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20-24小時(shí)，第三代作為主種子批庫(kù)，加入5%脫脂奶粉分裝于凍存 管，凍干后-70°C以下長(zhǎng)期保存。3.工作種子批的建立取第三代X-IO大腸桿菌奶牛乳房炎原始種子批菌株接種 于TSB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，第四代作為主種子批庫(kù)，加入50 %的甘油分裝于菌種管 內(nèi)，-70°C保存。4.三級(jí)種子批的檢定通過(guò)對(duì)奶牛乳房炎X-IO大腸桿菌疫苗菌株原始種子批、 主種子批、工作種子批菌株以及傳代30代菌株的外觀、血清型別、PH值、溶解時(shí)間、水分含 量、菌落變異率、形態(tài)與染色、菌株質(zhì)粒圖譜、莢膜多糖、菌株毒性和免疫原性進(jìn)行了全面檢 定。結(jié)果顯示，建立的奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗三級(jí)種子批庫(kù)安全、穩(wěn)定，符合疫苗生產(chǎn)的 要求。實(shí)施例5 規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原液及滅活取X-IO大腸桿菌乳房炎疫苗工作種子批庫(kù)菌株，先平板活化，挑單菌落接種 100ML液體培養(yǎng)基擴(kuò)增，后轉(zhuǎn)入IOL細(xì)菌培養(yǎng)罐的TSB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h ；然后轉(zhuǎn)接于 1000L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)約20h，收獲菌液，取樣作純檢并計(jì)算菌數(shù)；隨后加入終 濃度為0. 4%的甲醛溶液(ν/ν)，37°C，轉(zhuǎn)速150rpm，滅活36_48h。隨機(jī)取樣連傳三代無(wú)細(xì) 菌生長(zhǎng)，用無(wú)熱源的PBS洗菌三次，每次4°C，6500rpm離心15min，要沉淀，用PBS溶解，測(cè)定含量，凍干或液體為純化的滅活全菌疫苗抗原。實(shí)施例6 制備奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗及檢定X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗①將純化X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌抗原 不加佐劑，配制lX1010CFU/lml,5X1010CFU/5ml無(wú)佐劑注射劑型；②將純化X-10大腸 桿菌乳房炎滅活全菌抗原加入氫氧化鋁或磷酸鋁，配制1 X 101(lCFU/0. 5mg(鋁鹽)/lml、 5X1010CFU/2. 5mg(鋁鹽)/5ml有鋁鹽佐劑注射劑型；③將純化X_10大腸桿菌乳房炎滅 活全菌抗原加入等量SPOl佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02 佐劑(2%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、5ug單磷酰脂A)混勻水包油樣，配 制 1 X 10lclCFU+0. 5ml SPOl (或 SP02)/lml、5X 1010+2. 5ml SPOl (或 SP02CFU)/5ml 有 SPOl 或SP02佐劑注射劑型；④將純化X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌抗原加入等量白花油佐 劑混勻油包水樣，配制1X101qCFU+0. 5ml白花油(IFA)/lml、5X 10lclCFU/+2. 5ml白花油 (IFA)/5ml有白花油佐劑注射劑型，以上注射疫苗劑型可為皮下注射、肌肉注射、乳頭管注 射劑型，放2-8 °C備用。實(shí)施例7 本發(fā)明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在動(dòng)物體內(nèi)的免疫效果評(píng)價(jià)1.將本發(fā)明實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗加入或不加入相 應(yīng)佐劑，制備的皮下、肌肉、乳頭管注射疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、SP01、SP02、白花油、IFA、 單磷酰脂A為對(duì)照組，分別免疫6-8周Balb/C小鼠、18月家兔，每組10只，其免疫劑量按 實(shí)施例6疫苗劑量組(抗原1X101QCFU/Iml、抗原5X101QCFU/5ml)，免疫兩次(0，28天)； 末次免疫后14天將各組小鼠、家兔取血、分離血清和免疫細(xì)胞，及通過(guò)ELISA法測(cè)定血清 1 6400，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)都在1 6400以上，采用流式細(xì)胞儀、ELISP0T儀 測(cè)定免疫細(xì)胞與血清中重要細(xì)胞因子、炎性分子、趨化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等 動(dòng)態(tài)變化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法測(cè)定乳汁SlgA抗體效價(jià)都在1 3200以 上。說(shuō)明制備的奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗不管是加入佐劑或沒(méi)加入佐劑均都能產(chǎn)生滿 意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出試驗(yàn)組有佐劑優(yōu)于無(wú)佐劑組、高劑量組高于低劑量組免疫應(yīng) 答效果，而對(duì)陰性照組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗 不管是皮下注射還是肌肉、乳頭管注射劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑血 清抗體效價(jià)高于乳頭管內(nèi)注射劑型，乳管內(nèi)注射的黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于肌肉和皮下免 疫途徑，由此制備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在小鼠、家兔體內(nèi)具有好的免疫應(yīng) 答效果；加佐劑優(yōu)于無(wú)佐劑組，SPOl或SP02佐劑整體優(yōu)于鋁鹽、白花油和IFA佐劑組，且在 不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)。由此，研制的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在小鼠體內(nèi)有 很好的免疫原性。2.將本發(fā)明實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗加入或不加入相 應(yīng)佐劑制備的皮下、肌肉、乳頭管注射疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、SP01、SP02、白花油、IFA、單 磷酰脂A為對(duì)照組，分別按皮下、肌肉、乳頭管注射途徑選擇2-3歲即將進(jìn)入泌乳期(即產(chǎn) 前25d，懷孕8個(gè)月20d)健康(即疫苗抗體陰性，病原體陰性)奶牛，每組10頭；免疫劑量 按實(shí)施例6疫苗劑量組(抗原1 X 101(lCFU/lml、抗原5 X 101(lCFU/5ml)，免疫程序是0，28，56 天各免疫1次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)；末次免疫后14天取血、分離血清和免疫細(xì) 胞，采集、乳汁，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體溫、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及通過(guò)ELISA法測(cè)定 血清抗體效價(jià)25600以上、乳汁抗體效價(jià)達(dá)到1 6400以上，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)都在1 12800以上，說(shuō)明制備的奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗不管是加入佐劑與 沒(méi)有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出試驗(yàn)組有佐劑優(yōu)于無(wú)佐劑組、高劑量 組高于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對(duì)陰性照組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的X-IO大腸桿 菌乳房炎滅活疫苗不管是皮下注射還是肌肉、乳管注射劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng) 答，且注射劑血清抗體效價(jià)高于乳管內(nèi)注射劑型，乳管內(nèi)注射的黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于 肌肉和皮下免疫途徑，由此制備的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)具有好的免疫 應(yīng)答效果；加佐劑優(yōu)于無(wú)佐劑組，SPOU SP02佐劑整體優(yōu)于鋁鹽、白花油、FIA佐劑組，且與 劑量呈正相關(guān)免疫應(yīng)答趨勢(shì)。依上末次免疫14天后，用臨床分離01111、0157大腸桿菌野毒株作為攻毒株，將 1000CFU注入一個(gè)乳區(qū)。攻毒后觀測(cè)臨床癥狀(發(fā)燒、乳腺腫脹)，體溫變化，奶樣質(zhì)量(血 奶、異常塊、奶量減少)、進(jìn)食情況(進(jìn)食減少)及發(fā)病情況，通過(guò)奶樣體溫、排菌數(shù)、體細(xì)胞 數(shù)和血清抗體、奶汁抗體指標(biāo)評(píng)價(jià)保護(hù)率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，研制的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗在奶牛體內(nèi)有良好的保護(hù)率，高劑量組高于低劑量組的保護(hù)率，加佐劑組高于不加佐 劑組保護(hù)率，保護(hù)率達(dá)88%。實(shí)施例8 本發(fā)明奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)的長(zhǎng)效免疫保護(hù)評(píng)價(jià)將本發(fā)明實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活全菌疫苗頸部皮下注射2-3 歲即將進(jìn)入泌乳期(即產(chǎn)前25d，懷孕8個(gè)月20d)健康(即大腸桿菌抗體陰性，病原體陰 性)奶牛，每組20頭；免疫劑量在(抗原5X101(lCFU/5ml)，免疫程序是0，28，56天各免疫1 次(即產(chǎn)前25天，產(chǎn)后3天、31天)，第二年后加強(qiáng)免疫1次，觀察3年(1083天)，其間每 隔3個(gè)月取血、奶汁，觀察奶牛產(chǎn)奶量與質(zhì)量、體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)及通過(guò)ELISA、ELISP0T 測(cè)定抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫的長(zhǎng)效免疫應(yīng)答及保護(hù)效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，研制的奶牛大腸桿菌 乳房炎滅活疫苗具有長(zhǎng)效免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)，第一年免疫3次后，以后每年加強(qiáng)免疫一 次，其保護(hù)率達(dá)86%。實(shí)施例9 本發(fā)明的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗安全性試驗(yàn)1、無(wú)菌、支原體試驗(yàn)將實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗接種硫乙 醇酸鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無(wú)菌生理鹽水做陰 性對(duì)照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。 將奶牛金葡菌乳房炎滅活疫苗分別用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng) 21天，無(wú)菌生理鹽水做陰性對(duì)照，結(jié)果顯示X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗無(wú)支原體生長(zhǎng)。2、溶血性試驗(yàn)選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌3 次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。PBS稀釋X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗(由實(shí)施 例6制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時(shí)后，評(píng)價(jià) 血球溶解以目測(cè)或者上清濃度檢測(cè)為準(zhǔn)，并在570nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，沒(méi)有發(fā)生血 球破裂，無(wú)溶血現(xiàn)象。說(shuō)明X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗中的成分不能使紅細(xì)胞裂解。因 此，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗無(wú)溶血反應(yīng)。3、急性毒性試驗(yàn)取實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗0. 5ml腹腔注 射體重為12 18g Balb/C小鼠，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察小鼠的 活動(dòng)狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，沒(méi)有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行 動(dòng)遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在試驗(yàn)的濃度下對(duì)動(dòng)物是安全的，且14天后處死進(jìn)行大體解剖檢查，未見(jiàn)臟器有病理改變。在體重為 8 IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果取實(shí)施例6制備的X-10大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗肌肉注射15ML，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察行為、體重和存活率 變化。結(jié)果可見(jiàn)，Beagle狗未見(jiàn)毒性反應(yīng)，行為正常，沒(méi)有死亡，與對(duì)照組狗比較無(wú)差異，各 狗體重有所增加，并處死大體解剖未見(jiàn)臟器有明顯的病理改變。因此，奶牛大腸桿菌乳房炎 滅活疫苗無(wú)急性毒性反應(yīng)，使用是安全的。4、過(guò)敏試驗(yàn)研究取實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗皮下接種體重 為250 350g Hartley豚鼠，每個(gè)樣品接種豚鼠5只，每只接種0. 5ml,隔日一次，共3次。 第3次注射后21天，耳靜脈給予相同X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗0. 5ml，并用人血白蛋 白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照。注射后30分鐘及3天 觀察動(dòng)物，陽(yáng)性、陰性對(duì)照均成立，X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗組豚鼠無(wú)死亡，且無(wú)鼻癢、 噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過(guò)敏癥狀。因此，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在 動(dòng)物體內(nèi)無(wú)過(guò)敏反應(yīng)。5、兔熱源質(zhì)試驗(yàn)取預(yù)檢合格的體重為2 3kg家兔3只固定，30分鐘后測(cè) 量體溫，共測(cè)2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0. 2°C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 5°C。將實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗預(yù)熱至38°C，于第2次測(cè) 溫后15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈緩緩注入0. 5ml/只。注射后每隔30分鐘測(cè)量體溫1次， 連測(cè)6次。結(jié)果顯示奶牛X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗給予家兔個(gè)體升溫未超過(guò)0. 2°C， 3只家兔升溫總和未超過(guò)0.4°C，沒(méi)有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的奶牛大腸桿菌乳 房炎滅活疫苗無(wú)熱源質(zhì)。6、免疫病理?yè)p傷試驗(yàn)由實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗通過(guò)小 鼠、家兔和奶牛外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性 細(xì)胞及氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗 免疫接種不管在小動(dòng)物，或是在奶牛體內(nèi)Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒(méi)有免疫器官損傷 的跡象，因此具有安全性。實(shí)施例10 本發(fā)明奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)由實(shí)施例6制備的X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，分別置于2-8 °C、室溫 (20-25°C )、37°C 1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月、36個(gè)月，取樣 觀察外觀、PH值、無(wú)菌、電鏡觀察粒徑、免疫動(dòng)物觀察安全性和效力。結(jié)果顯示奶牛大腸桿 菌乳房炎滅活疫苗放置2-8°C 24個(gè)月內(nèi)均無(wú)變色分層等現(xiàn)象，PH值在7. 0-7. 2之間無(wú)變 化，電鏡觀察粒徑大小保持一致，且注射給Balb/c小鼠表現(xiàn)正常；X-IO大腸桿菌乳房炎滅 活疫苗放置室溫25V 3個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；X-IO大腸桿菌乳房炎滅活疫苗放置室溫 37°C 1個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效果。由結(jié)果說(shuō)明，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗放置2-8°C 理化性質(zhì)、生物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期至少24個(gè)月。
權(quán)利要求
奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的制備方法，其特征是(1)、通過(guò)對(duì)奶牛乳腺炎奶汁樣品分離、鑒定出的奶牛乳房炎大腸桿菌株，確定了我國(guó)大腸桿菌奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株，包括任何適宜于制備奶牛乳房炎大腸桿疫苗生產(chǎn)的當(dāng)前和今后廣泛流行大腸桿菌野生株；(2)、通過(guò)構(gòu)建自殺致死質(zhì)粒pCVD442 galE，運(yùn)用同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌候選優(yōu)勢(shì)菌株的LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而不影響除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選出大腸桿菌重組工程菌株，包括通過(guò)該方法制備的其它突變菌疫苗株，在體外普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，傳代穩(wěn)定、免疫原性良好的奶牛大腸桿菌乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株；(3)、選用奶牛大腸桿菌乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株，制備優(yōu)勢(shì)流行菌株的兔血清，與已有國(guó)內(nèi)外臨床分離奶牛大腸桿菌乳房炎菌代表株免疫交叉中和達(dá)97％以上，由此選用的奶牛乳房炎大腸桿菌優(yōu)勢(shì)疫苗株具有代表國(guó)內(nèi)外流行株；(4)、選用奶牛大腸桿菌乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株，建立奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種子批、工作種子批庫(kù)，菌種分裝保存；進(jìn)一步通過(guò)理化性質(zhì)、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析，表明建立的大腸桿菌疫苗菌株三級(jí)種子批庫(kù)符合疫苗生產(chǎn)用要求；(5)、通過(guò)奶牛大腸桿菌苗工作種子批庫(kù)，進(jìn)行放大培養(yǎng)，制備奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗原液，經(jīng)滅活、離心分離、生化提取制備了純化大腸桿菌滅活全菌，抗原純度達(dá)95％；通過(guò)對(duì)溫度、時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得了規(guī)模化生產(chǎn)滅活全菌抗原原液；進(jìn)一步進(jìn)行血清型別、理化性質(zhì)、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鑒定；(6)、用純化滅活全菌抗原原液，制備有或無(wú)佐劑的奶牛大腸桿菌滅活疫苗注射劑型，可用于不同品種、不同年齡奶牛通過(guò)皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮等免疫接種，也可以一種或幾種聯(lián)合免疫；奶牛大腸桿菌乳房 炎滅活疫苗制品放置2～8℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的制備方法，其特征是我國(guó) 大腸桿菌奶牛乳腺炎疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株是由內(nèi)蒙古、重慶、廣州、黑龍江、蘭州、河北、山東 等東西南北中30個(gè)省市90個(gè)中大型奶牛場(chǎng)、近3萬(wàn)頭奶牛乳腺炎奶汁樣品，分離、鑒定奶 牛乳房炎大腸桿菌株，確定的我國(guó)大腸桿菌0 008、01216、02138、02555菌株為奶牛乳腺炎 疫苗候選優(yōu)勢(shì)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的制備方法，其特征是 奶牛大腸桿菌乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株為X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大腸桿菌重組工程菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的制備方法，其特征是選用 奶牛大腸桿菌乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株，建立奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗原始種子批、主種 子批、工作種子批庫(kù)的方法選用X-IO大腸桿菌株為代表的優(yōu)勢(shì)疫苗株，接種于TSB等培養(yǎng) 基中，35-36°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后劃線接種TSA瓊脂和5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取符 合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)混合接種TSB半固體、液體培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基若干、置35-36°C培 養(yǎng)20-24小時(shí)，斜面培養(yǎng)基細(xì)菌用脫脂牛奶沖下，第二代建立了奶牛大腸桿菌乳房炎滅活 疫苗原始種子批、第三代建立主種子批、第四代建立工作種子批庫(kù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的制備方法，其特征是通過(guò) 奶牛大腸桿菌苗工作種子批庫(kù)，進(jìn)行放大培養(yǎng)，獲得了規(guī)?；a(chǎn)滅活全菌抗原原液的方 法是通過(guò)奶牛X-IO大腸桿菌苗工作種子批株，從IOL到1000L發(fā)酵放大培養(yǎng)，培養(yǎng)基是TSB，制備了 X-IO奶牛大腸桿菌乳房炎疫苗原液，經(jīng)甲醛滅活、離心分離、生化提取制備了 純化大腸桿菌滅活全菌，抗原純度達(dá)95% ；通過(guò)對(duì)溫度、時(shí)間、接種量等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲 得了規(guī)?；a(chǎn)滅活全菌抗原原液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗的制備方法，其特征是疫苗 佐劑可以是SP01、SP02、MF59、白花油、FIA、鋁鹽、免疫刺激復(fù)合物、細(xì)胞因子、脂質(zhì)體等當(dāng)中 的任意一種或多種，或無(wú)佐劑。
7.射，表明該疫苗 都能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，皮下注射高于肌肉、乳頭管途徑；免疫加佐劑好于無(wú)佐劑組，在 不同動(dòng)物有一致免疫應(yīng)答趨勢(shì)，奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗在奶牛體內(nèi)免疫保護(hù)率90% 以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的奶牛大腸桿菌乳房炎滅活疫苗，其特征是該疫苗制品 通過(guò)皮下注射、肌肉注射、乳頭管注射、微針透皮的一種或幾種聯(lián)合用于不同品種、不同年 齡奶牛的免疫接種，可安全、穩(wěn)定、有效預(yù)防大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奶牛大腸桿菌乳腺炎滅活疫苗及其制備方法，疫苗是臨床分離野毒株經(jīng)基因定點(diǎn)缺失LPS編碼基因galE以暴露其核心抗原，而不影響除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，篩選出大腸桿菌重組工程菌株乳房炎滅活疫苗，具有代表大腸桿菌感染所致奶牛乳房炎優(yōu)勢(shì)疫苗菌株，進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵規(guī)?；a(chǎn)菌液、滅活、純化等工藝，經(jīng)此形成滅活全菌抗原，加入或不加入SP01、SP02、白花油、FIA、鋁鹽、MF59、免疫刺激復(fù)合物、脂質(zhì)體、免疫細(xì)胞因子等佐劑，該方法制備的疫苗劑型，通過(guò)皮下、肌肉、奶頭乳管注射、微針透皮等免疫接種奶牛后，可有效預(yù)防大腸桿菌感染性奶牛乳房炎的發(fā)生。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101991846SQ20101055005
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者劉永祥, 孫藝萍, 李敏, 楊定興, 楊秀蘭, 王鋮, 郝國(guó)成, 高嘯 申請(qǐng)人:赤峰博恩藥業(yè)有限公司