專利名稱：α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種酶法生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮 苷的方法。背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)異槲皮苷(Isoquercitrin, Quercetin-3-glucose)是聲丁分子中α -L-鼠 李糖基水解后生成的次生苷，在抗氧化、降血壓、抗炎、抗癌和抑制血小板聚集等方面具 有與蘆丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)類似甚至更高效的生物活性和生物利用度，在 延緩人體老化和防治疾病方面具有重要作用。相關(guān)藥理實驗結(jié)果表明，異槲皮苷具有生 津止渴、清熱解暑、降壓強心及延年益壽的作用，還可有效地用于防治糖尿病、高血壓、冠 心病、抑郁癥及神經(jīng)衰弱等疾病(CN101152201; CN101103121; Phytomedicine, 2009, 16: 761 767; Phytotherapy Research, 2008, 22: 1552 1556; European Journal of Pharmacology, 2005，522: 108 115;中草藥,2009，40(4): 618 620)。因此，異槲皮苷 是目前藥學(xué)界的熱點新藥化合物，一直也是國際上各大醫(yī)藥食品公司競相開發(fā)的高級食品 添加劑、輔助藥物或藥物有效成分。異槲皮苷是蘆丁的次生苷，幾乎不溶于水，微溶于沸水，溶于堿溶液顯深黃色，分 子式為C21H2tlO11,分子量為448. 38。異槲皮苷的制備方法主要有以下兩種提取法和水解法。提取法通常是指從植物或植物提取物中采用溶劑萃取法提純異槲皮苷，如 CN00808993公開的從生物類黃酮中回收異槲皮素方法，即從生物類黃酮漿(回收類黃酮的 母液殘余物)中采用乙酸甲酯和水的混合溶劑提取，但由于類黃酮漿中含有槲皮素、異槲 皮素以及其他類似物，單純采用溶劑萃取法難以低成本制備異槲皮苷。盡管蘆丁在植物 資源中的分布廣泛(如在槐花中蘆丁含量最高可達28%)，然而其次生苷異槲皮苷在自然界 中的分布較少，其含量僅有幾萬分之一甚至是十萬分之幾(犬連輕工童學(xué)腐學(xué)痕，2007, 26(2): 112 115)，因此直接從自然界植物中提取難以制備異槲皮苷。由于本身結(jié)構(gòu)式的多個活潑酚羥基，采用傳統(tǒng)方式化學(xué)合成異槲皮苷的成本居高 不下，因而以蘆丁等低成本糖苷為原料采用水解法制備在工藝可行性方面具有相對優(yōu)勢， 其水解反應(yīng)過程常使用化學(xué)催化或酶催化水解法。(1)化學(xué)法水解文獻報道最多，是由于蘆丁苷鍵(鼠李糖苷鍵和葡萄糖苷鍵)為半 縮醛結(jié)構(gòu)，對酸不穩(wěn)定，對堿較穩(wěn)定，易被酸催化水解，主要采用鹽酸、硫酸等無機酸作催化 劑，水解反應(yīng)機理是苷鍵原子先被質(zhì)子化，然后苷鍵斷裂形成糖基正離子或半椅型的中間 體，該中間體再與水結(jié)合形成糖，并釋放催化劑質(zhì)子。但是酸催化水解法的水解溫度較高， 使用的酸對設(shè)備腐蝕嚴重，并產(chǎn)生大量的酸性廢水，對環(huán)境造成污染。水解方式除前述常規(guī) 水解方法外，還有加壓水解法，如CN1817876公開的用蘆丁制備槲皮素和異槲皮苷的方法， 在高壓反應(yīng)釜中投入蘆丁漿液，加熱至沸，采用加壓水解獲得水解產(chǎn)物槲皮素和異槲皮苷， 但蘆丁的水解過程中槲皮素和異槲皮苷共存，必須對水解產(chǎn)物采用分離手段才能獲得異槲皮苷。(2)酶催化水解法主要以糖苷酶為催化劑，如CN03133636公開的酶法水解蘆丁 制備異槲皮苷和槲皮素的方法，以槐米為高溫好氧菌或曲霉菌或羅倫隱球酵母菌的發(fā)酵 產(chǎn)酶誘導(dǎo)物，液態(tài)或固態(tài)法產(chǎn)糖苷酶，通過調(diào)控反應(yīng)條件水解蘆丁產(chǎn)異槲皮苷和槲皮素的 混合物，但未實現(xiàn)異槲皮苷的定向轉(zhuǎn)化；CN1685053公開從植物生物質(zhì)提取和沉淀蘆丁，采 用柚苷酶轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮苷和槲皮素。此外，采用鼠李糖苷酶水解蘆丁制備異槲皮 苷的報道大多集中在該酶的酶學(xué)性質(zhì)、基因重組等基礎(chǔ)研究UrcAims of Biochemistry and Biophysics, 2003，415: 235^244； Enzyme and Microbial Technology, 2007，40: 1181 1187;大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2007，26 (2): 112 115; Process Biochemistry, 2010, 45: 1226 1235)，尚未有采用鼠李糖苷酶生物催化水解蘆丁高選擇性定向制備異槲 皮苷的報道。綜上，上述水解法均未能實現(xiàn)蘆丁定向水解制備異槲皮苷?？紤]到水解反應(yīng) 的效率和對環(huán)境友好，采用酶法制備異槲皮苷更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，以自然界分布廣 泛、來源豐富的蘆丁為原料，經(jīng)糖苷酶催化水解反應(yīng)制備異槲皮苷，建立生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向 合成異槲皮苷的酶促水解工藝是今后規(guī)模化制備異槲皮苷的唯一選擇。因此，本專利首次應(yīng)用α-L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁分子中的鼠李糖，實現(xiàn)異 槲皮苷的定向生物合成。該方法具有條件溫和，反應(yīng)產(chǎn)物較單一，產(chǎn)物得率高，環(huán)境友好等 優(yōu)點，從而可以克服傳統(tǒng)的糖苷水解反應(yīng)需要在高溫高壓下，由酸或堿催化完成，對設(shè)備要 求高，且對環(huán)境造成污染的缺點；此外，定向生物合成異槲皮苷可以克服以往酶促水解產(chǎn) 物多樣性問題，易于工業(yè)化生產(chǎn)高純度異槲皮苷，為今后大規(guī)模工業(yè)化生物合成異槲皮苷 的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為推動其在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中的廣泛應(yīng)用具有十分重要的意 義。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題針對現(xiàn)有技術(shù)中所述的不足，本發(fā)明提供了一種α-L-鼠李糖苷酶催化 水解蘆丁定向生物合成異槲皮苷的方法。該方法可以高效地實現(xiàn)定向水解蘆丁分子中的 α -L-鼠李糖苷鍵，為酶法制備高純度異槲皮苷的工業(yè)化應(yīng)用提供了新工藝。技術(shù)方案α -L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用。α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用，將α-L-鼠李糖 苷酶溶液按0. Γ50 g/L的加入量加入濃度為0.0廣0.30 g/L的蘆丁底物溶液中，pH 5 9， 進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度2(T70°C，反應(yīng)時間廣60h，反應(yīng)結(jié)束，獲得含水解產(chǎn)物異槲 皮苷的轉(zhuǎn)化液。還包括異槲皮苷的提取純化步驟，將上述獲得的轉(zhuǎn)化液濃縮，調(diào)節(jié)其PH至 6-8，異槲皮苷沉淀析出，復(fù)溶后，重結(jié)晶，獲得異槲皮苷。α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用，配制作固定化酶 用的0.廣10%膠體溶液，向膠體溶液中按0.廣50 g/L的比例加入α-L-鼠李糖苷酶，混 合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化0. 5 12h，制成大小均勻的球狀或方形固定化顆粒，洗滌 后備用；將固定化α -L-鼠李糖苷酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為0. 0Γ0. 30 g/ L、pH 5、的蘆丁底物溶液，經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度2(T7(TC，反應(yīng)時間 廣72h，反應(yīng)結(jié)束，獲得含水解產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化液。還包括異槲皮苷的提取純化步驟，將 獲得的轉(zhuǎn)化液濃縮，調(diào)節(jié)其PH至6-8，異槲皮苷沉淀析出，復(fù)溶后，重結(jié)晶，獲得異槲皮苷。所述膠體為海藻酸鈉、卡拉膠或明膠。
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有益效果
(1)以α-L-鼠李糖苷酶的粗酶制劑或固定化酶制劑用于催化水解蘆丁定向生物合成 異槲皮苷，不僅催化劑來源廣泛、制備容易、成本低廉，而且酶制劑穩(wěn)定性高、易于保存、催 化效率和專一性高。因此，使用α-L-鼠李糖苷酶可大幅度降低槲皮素的生產(chǎn)成本，酶催化 轉(zhuǎn)化率高，且產(chǎn)物專一。(2)采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案得到的異槲皮苷由于在極性溶劑中的溶解度低于 底物蘆丁，可以通過常規(guī)的減壓濃縮和調(diào)節(jié)PH輕易地從酶促轉(zhuǎn)化體系中沉淀分離，剩余的 底物蘆丁可以繼續(xù)酶促水解。因而，整個酶促反應(yīng)工藝基本上無廢棄物產(chǎn)生，無環(huán)境污染， 催化劑價格低廉，具有非常良好的工業(yè)化應(yīng)用前景，可以滿足迅速發(fā)展的醫(yī)藥工業(yè)和日化 工業(yè)的需要。四

圖1為α-L-鼠李糖苷酶催化蘆丁定向生物合成異槲皮苷的反應(yīng)流程示意圖； 圖2為a-L-鼠李糖苷酶催化蘆丁定向生物合成產(chǎn)物異槲皮苷的核磁共振譜圖譜: [1H-WR ( 300 MHz, DMS0_d6 ) δ 12.64 ( 1Η, s，5_0H)，7.53 (1H, d, J = 2. 0 Hz, 2' -H), 7. 59 ( 1H, dd, J = 2.0,8.8 Hz, 6' -H) ,6. 89 (1H, d, J = 8. 8 Hz, 5' -H), 6. 40 (1H, d, J = 2. 0 Hz，8-H)，6. 19 ( 1H, d, J = 2. 0 Hz，6_H)，5. 4 ( 1H, d, J = 7. 6 Hz, 1" _ H )；
圖3為a -L-鼠李糖苷酶催化蘆丁定向生物合成產(chǎn)物異槲皮苷的核磁共振譜圖譜 13C-NMR (DMS0-d6，300 MHz) δ 156.3 ( C~2 ) ,133. 3 ( C_3 ) ,177.4 ( C_4)、 161.2 (C-5)、98.6 (C_6)、164.1 (C_7)、93. 5 (C_8)、156.3 (C_9)、104.0 (C-IO), 121. 6 (C-I' ) ,115. 2 (C-2 ' ) ,144. 8 ( C_3 ' ) ,148. 4 ( C_4 ' ) ,116. 2 (C_5 ' ) ,121. 1 (C-6' ), 100. 7 ( C-I" ) ,74. 0 (C-2" )，76. 4 (C_3〃 ) ,69. 9 (C_4〃)，77.5(C_5〃)， 60. 9 (C-6〃)。據(jù)圖2、3鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為槲皮素-3-0-i3_D -葡萄吡喃糖苷，即異槲皮苷， Isoquercitrin]0五具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。本發(fā)明實施例中使用同時檢測蘆丁和異槲皮苷的測定方法為高效液相色譜法，色 譜條件Alltima C18 (250 mmX 4. 6 mm，5 μ m)，流動相0. 02% 磷酸-乙腈(80 20，ν/ν)；檢 測波長360 nm ；流速1. 0 mL/min ；進樣量20 μ L。其中，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率計算方法為
權(quán)利要求
α L 鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用。
2.α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用，其特征在于將 α-L-鼠李糖苷酶溶液按0.廣50 g/L的加入量加入濃度為0.0廣0.30 g/L的蘆丁底物溶 液中，PH 5 9，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度2(T70°C，反應(yīng)時間廣60h，反應(yīng)結(jié)束，獲得含水 解產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng) 用，其特征在于還包括異槲皮苷的提取純化步驟，將權(quán)利要求2獲得的轉(zhuǎn)化液濃縮，調(diào)節(jié)其 PH至6-8，異槲皮苷沉淀析出，復(fù)溶后，重結(jié)晶，獲得異槲皮苷。
4.α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用，其特征在于配制作 固定化酶用的0.廣10%膠體溶液，向膠體溶液中按0. Γ50 g/L的比例加入α-L-鼠李糖苷 酶，混合均勻后，滴入交聯(lián)劑溶液中固化0. 5 12h，制成大小均勻的球狀或方形固定化顆粒， 洗滌后備用；將固定化α-L-鼠李糖苷酶裝填于柱狀反應(yīng)器，用泵輸送濃度為0.0廣0. 30 g/L、pH 5、的蘆丁底物溶液，經(jīng)過固定床，進行酶促水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度2(T70°C，反應(yīng)時 間廣72h，反應(yīng)結(jié)束，獲得含水解產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng) 用，其特征在于所述膠體為海藻酸鈉、卡拉膠或明膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng) 用，其特征在于還包括異槲皮苷的提取純化步驟，將權(quán)利要求4或5獲得的轉(zhuǎn)化液濃縮，調(diào) 節(jié)其PH至6-8，異槲皮苷沉淀析出，復(fù)溶后，重結(jié)晶，獲得異槲皮苷。
全文摘要
α-L-鼠李糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷中的應(yīng)用。以α-L-鼠李糖苷酶的粗酶制劑或固定化酶制劑用于催化水解蘆丁定向生物合成異槲皮苷，不僅催化劑來源廣泛、制備容易、成本低廉，而且酶制劑穩(wěn)定性高、易于保存、催化效率和專一性高。因此，使用α-L-鼠李糖苷酶可大幅度降低槲皮素的生產(chǎn)成本，酶催化轉(zhuǎn)化率高，且產(chǎn)物專一。
文檔編號C12P17/06GK101985639SQ201010545588
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者吳福安, 孫國霞, 安亞雄, 王俊, 馬延龍 申請人:江蘇科技大學(xué)