專(zhuān)利名稱(chēng)：快速檢測(cè)單純皰疹病毒ⅱ型的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引起人類(lèi)多種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種快速檢測(cè) 單純皰疹病毒II型熒光定量PCR試劑盒，適用于單純皰疹病毒II型的定性定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(Herpse simplex virus，HSV)是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康、引起人類(lèi) 多種疾病的常見(jiàn)病原體。HSV有HSV2和HSV2兩個(gè)亞型，兩亞型的核苷酸同源性達(dá)50%，而 感染方式和臨床表現(xiàn)卻不相同。HSV2主要通過(guò)性接觸而感染，常潛伏在骶神經(jīng)根區(qū)，可引起生殖器皰疹和新生兒 皰疹，并與女性外陰癌和宮頸癌的發(fā)生有關(guān)；HSV2導(dǎo)致的生殖器皰疹容易復(fù)發(fā)，其復(fù)發(fā)比 HSVl率高5-15倍，是引起人們性心理障礙的主要原因之一，可顯著降低感染者的生活質(zhì) 量；HSV2是人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)性傳播的重要協(xié)同輔助因素之一，其感染使HIV感染 的危險(xiǎn)性提高三倍；孕婦感染HSV2后可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒先天異常和新生兒疾病等，嚴(yán) 重影響人類(lèi)優(yōu)生優(yōu)育。因此準(zhǔn)確及時(shí)地診斷和區(qū)分HSV2與HSV2對(duì)指導(dǎo)臨床治療、評(píng)估疾 病的發(fā)展和預(yù)后具有重大意義。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR) 技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析(Incetigation of HSV-1, HSV-2, CMV, HHV-6 and HHV-8 DNA BY real-time PCRin surgical resection materials of eplepsy patients with mesial temporallobe sclerosis[J]. Journal of the Neurological Sciences.2008,264 151-156 ；Assessment of bluetongue viraemia in sheep by real-time PCR and correlation with viral infectivity. [J]· Journal of the NeurologicalSciences, Available online 10 May 2010)禾口定量檢測(cè) (Quantitativecharacterization of cell transduction by HSV-I amplicons using flowcytometry and real-time PCR[J]. Journal of the Neurological Sciences2009, 159 :160—166 ；Development of a novel TaqMan real-time PCR assayfordetecting rubella virus RNA. [J]. Journal of the NeurologicalSciences2010,168 :267_271)等 方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法，國(guó)內(nèi)目前已有關(guān)于丙肝、 乙肝、支原體、衣原體、艾滋病、結(jié)核定量檢測(cè)的試劑盒上市。臨床檢測(cè)上傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和血清學(xué)方法具有靈敏度低、特異性差、假陽(yáng)性、耗時(shí)費(fèi) 力等缺點(diǎn)；常規(guī)PCR法雖然有簡(jiǎn)便、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)，但是有不能精確定量和PCR后處理產(chǎn) 生污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性等問(wèn)題；因此亟待開(kāi)發(fā)精確、靈敏、快速、無(wú)污染的臨床檢驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種快速檢測(cè)單純皰疹 病毒II型的熒光定量PCR試劑盒。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一、PCR 試劑盒該試劑盒包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板 PMD18-T-HSV2和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；1、DNA 提取液在pH7. 4Tris-EDTA 緩沖液(pH7. 610mM Tris. HCL, pH8. 0 ImM EDTA)中，按照 1 100比例加入NP-40混勻后完成配制。將提取液II分裝至5ml凍存管(有蓋透明管) 內(nèi)。分裝量5ml/管。2、熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒II型特異性引物對(duì)和熒光探針1)單純皰疹病毒II型正向引物為5' -GCTTCCTCATCGCGTACCAG-3‘，反向引物為5' -TCCTGCTCCCGCATGTACTC-3‘。2)熒光探針序列為 5' -CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG-3‘，熒光探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記 Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾。3、HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2是含有單純皰疹病毒II型高度保守基因-糖 蛋白B基因的79個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的PMD18-T載體，該載體可在大腸桿菌DH5 α
中增殖。4、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品該陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水，用于陰性對(duì)照。二、PCR試劑盒的制備和檢測(cè)方法PCR試劑盒的制備和檢測(cè)方法包括下列步驟①配制DNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2 ；④配制陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品；⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；⑥判斷未知樣本的陰陽(yáng)性；應(yīng)用DNA提取液提取未知檢測(cè)樣本得到DNA，后再取HSV2陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品分別加入裝有熒光定量PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，然后置于PCR熒光定量?jī)x 中進(jìn)行反應(yīng)；其中，以陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線作 為陰性對(duì)照，以陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線判斷陽(yáng)性樣本的濃度。從而判斷未知樣本的陰陽(yáng) 性及濃度。本試劑盒的工作原理在本發(fā)明提供的快速定量檢測(cè)單純皰疹病毒II型熒光定量PCR試劑盒中，有標(biāo)記 了熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端 報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒(méi) 有熒光信號(hào)的變化。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸， Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對(duì)探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩 基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)單純皰疹病毒II型的定 量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過(guò)程中， 熒光量的積累超過(guò)基底熒光量的循環(huán)個(gè)數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小， 起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成 標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供的檢測(cè)單純皰疹病毒II型熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)單純皰疹病 毒II型檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、退 火溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用 于單純皰疹病毒II型定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了檢測(cè)單純皰疹病毒II型 熒光定量PCR方法，并研制出檢測(cè)單純皰疹病毒II型熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈 敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10拷貝，可以滿足快速診斷單純皰疹病毒II型的要求。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、定量準(zhǔn)確；2、檢測(cè)速度快，僅1. 5小時(shí)，加上樣品DNA的提取制備，共僅需2小時(shí)；3、特異性好，靈敏度高；4、可鑒定區(qū)別檢測(cè)單純皰疹病毒II型；5、使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高。本試劑盒可對(duì)單純皰疹病毒II型進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)，并可替代一直沿用的 傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克 等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社， 2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。一、關(guān)于制備和檢測(cè)方法的實(shí)施例1、試劑盒組成與配制①配制DNA提取液DNA提取液組成提取液I 配制 0. OlM PBS (28. 94g Na2HPO4 · 12H20, 2. 6g KH2PO4 ·2Η20 加入 1000ml 超凈水混勻，調(diào)ρΗ到7. 4)。提取液II 在 ρΗ7· 4 Tris-EDTA 緩沖液(ρΗ7· 610 mM Tris-HCL，ρΗ8· 0 ImMEDTA) 中，按照1 100比例加入NP-40混勻后完成配制。將提取液II分裝至5ml凍存管(有蓋 透明管)內(nèi)。分裝量5ml/管。②配制熒光定量PCR反應(yīng)液a、熒光 PCR IOXBuffer 組成500mM KClUOOmM Tris-HCl (PH9. 025°C ) U. 0% Triton X-IOO ；
b、熒光定量PCR反應(yīng)液PCR IOXbuffer 5. 0 μ 1，正向引物和反向引物 各 1. 5 μ 1 (10 μ mol/L)，熒光探針 1·0μ1(5μ mol/L)，MgCl2 5 μ 1 (25mmol/L)，dNTPs 1· 0 μ 1 (10mmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ 1 (5U/ μ 1)，無(wú)菌雙蒸水 29. 6 μ 1。③配制HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2 濃度為IO9拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板 PMD18-T-HSV2。④將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板系列稀釋為IO8拷貝/ml、107拷貝/ml、106拷貝/ml、105拷貝/ ml、IO4 拷貝 /ml、IO3 拷貝 /ml。⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品該陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。二、關(guān)于試劑盒的應(yīng)用實(shí)施例1、使用試劑盒快速檢測(cè)單純皰疹病毒II型①在標(biāo)本試管中加入Iml無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中， IOOOOg離心lOmin，再重復(fù)洗滌1次。沉淀直接加50μ1 DNA提取液充分混勻，沸水浴 IOmin, IOOOOg離心2min,取上清液5 μ 1做PCR反應(yīng)。②分別取熒光定量PCR反應(yīng)液各45 μ 1，取第①步所得HSV2DNA和第②步稀釋的 HSV2陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各5 μ 1，并設(shè)陰性對(duì)照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè) 儀上平行做P C R檢測(cè)。循環(huán)條件為9 5 °C預(yù)變性300 s ； 9 5 °C 10 s，5 8 °C 4 0 s，擴(kuò)增4 0個(gè)循 環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，所用熒光為FAM，其吸收波長(zhǎng) 494nm,發(fā)射波長(zhǎng)522nm。③通過(guò)比較待測(cè)樣品和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值Ct值，對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)
進(jìn)行定量。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為 HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板IO8拷貝/ml、IO7拷貝/ml、IO6拷貝/ml、IO5拷貝/ml、IO4拷貝/ml、IO3 拷貝 /ml 的 Ct 值分別為 17. 92，21. 64，24. 83，28. 248，31. 09，34. 82 ；陰性對(duì)照為 40 ；反復(fù)重復(fù)試驗(yàn)3次，得到Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P > 0. 05，數(shù)據(jù)差異無(wú)顯著意義，說(shuō) 明其不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。從上述實(shí)例可以說(shuō)明，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光定 量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需2個(gè)小時(shí)就能完成，而傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法約需1周左 右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。
權(quán)利要求
一種快速檢測(cè)單純皰疹病毒II型的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于包括DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18 T HSV2和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒II型特異性引物對(duì)和熒光探針；正向引物為5′ GCTTCCTCATCGCGTACCAG 3′，反向引物為5′ TCCTGCTCCCGCATGTACTC 3′；熒光探針序列為5′ CCTCCTCAGCAACACGCTCGCCG 3′，熒光探針5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)標(biāo)記Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾，HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18 T HSV2是含有單純皰疹病毒II型高度保守基因 糖蛋白B基因的79個(gè)堿基對(duì)的核苷酸片段構(gòu)成的PMD18 T載體，該載體在大腸桿菌DH5α中增殖。
2.按權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于包括下列步驟①配制DNA提取液；②配制熒光定量PCR反應(yīng)液；③配制HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2；④配制陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品；⑤配制陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；⑥判斷未知樣本的陰陽(yáng)性。
3.按權(quán)利要求2所述的PCR試劑盒的制備方法，其特征在于步驟③ HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2包含的GB基因的核苷酸序列為 GCTTCCTCATCGCGTACCAGCCCCTCCTCAGCAACACGCTCGCCGAGCTGTACGTGCGGGAGTACATGCGGGAGCAGGA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)單純皰疹病毒II型的熒光定量PCR試劑盒，涉及一種引起人類(lèi)多種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，適用于單純皰疹病毒II型定性定量檢測(cè)。本發(fā)明由DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、HSV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板PMD18-T-HSV2、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；熒光定量PCR反應(yīng)液含有單純皰疹病毒II型特異性引物對(duì)和熒光探針。本發(fā)明定量準(zhǔn)確；檢測(cè)速度快；特異性好，靈敏度高；可鑒定區(qū)別檢測(cè)單純皰疹病毒II型；使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高。本試劑盒可對(duì)單純皰疹病毒II型進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101979666SQ20101053364
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者唐景峰, 王業(yè)富, 王維旭, 趙友云 申請(qǐng)人:武漢百泰基因工程有限公司