專(zhuān)利名稱(chēng)：辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌檢測(cè)用引物及探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)涉及辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌檢測(cè)用引物及探 針。
背景技術(shù)：
辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)是世界性番爺及 辣椒病害，是重要進(jìn)境植物檢疫性有害生物，主要侵染番茄及辣椒等多種番茄屬及辣椒屬 植物，染病植株嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡及絕產(chǎn)。該病可通過(guò)植株及種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。該病 目前在歐洲、亞洲、非洲、美洲及大洋洲等國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生。近年來(lái)我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展 很快，辣椒遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)念l率及數(shù)量也大幅度增加，因此該病傳播及擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)日益增大。本研究選擇辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病Rhs基因序列設(shè)計(jì)一條熒光標(biāo)記探針和一對(duì)引物， 建立了辣椒斑點(diǎn)病菌的熒光PCR檢測(cè)方法，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否有辣椒斑 點(diǎn)病菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物及探針 序列。本發(fā)明通過(guò)分析已報(bào)道辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Rhs基因序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)引 物和熒光探針。所述的引物對(duì)由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表XCV-F好 XCV-R所示；所述探針核苷酸序列如序列表XCV-P所示，該探針在5 ‘端標(biāo)記有FAM熒光染 料，在3'端采用了 BHQ淬滅基團(tuán)。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增有關(guān)。即將報(bào)告熒 光染料標(biāo)記在探針的5'端，而3'端標(biāo)記了淬滅基團(tuán)，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報(bào)告熒 光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告熒光染料 信號(hào)增強(qiáng)。當(dāng)探針完整的情況下，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被熒光淬滅基團(tuán)淬滅。在進(jìn)行 退火的過(guò)程中，探針及引物先與目標(biāo)基因結(jié)合，當(dāng)引物延伸至熒光標(biāo)記探針的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)， TaqDNA聚合酶發(fā)揮其5'外切酶活性將探針切斷，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光 信號(hào)。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累，即熒光分子的數(shù)目與PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物呈1 1的關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的檢測(cè)。本發(fā)明還進(jìn)一步給出了應(yīng)用上述引物和探針的熒光PCR檢測(cè)方法，其以樣品菌液 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)^ ο具體地說(shuō)本發(fā)明以樣品菌液為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，即在20 μ L反應(yīng)體系 中力口入 8 μ L 超純水，10 μ L2 XPremix Ex Taq , 0· 5 μ L 引物 XCV-F (20 μ mol/L)，0· 5 μ L 弓| ^ XCV-R(20 μ mol/L) ,0. 5 μ L TaciMan 探針 XCV-P (20 μ mol/L)，0. 5 μ L 菌液。Premix Ex Taq 購(gòu)自Takara公司。
其中，上述反應(yīng)條件可以是第一個(gè)循環(huán)為95°C 3min ；隨后40個(gè)循環(huán)，92°C 5s, 60°C 30s。當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物對(duì)或者其擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)其他類(lèi)型的探針， 以適用不同方法的熒光PCR檢測(cè)。進(jìn)一步，還可以將本發(fā)明引物、探針以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明根據(jù)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Rhs基因序列設(shè)計(jì)引物及探針，該探針特異性 好，用于熒光PCR檢測(cè)靈敏性高。本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高，其能夠快速簡(jiǎn)單地 判斷樣品是否有辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌，為進(jìn)出口安全提供了保證。


圖1是實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的結(jié)果；圖2是本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1引物及探針的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Rhs基因序列，采用探針設(shè)計(jì)軟件Express 2. 0設(shè)計(jì)引 物及探針，引物序列為XCV-F (正向)5 ‘ -GGATGGGCAGCGTATCTTTC-3 ‘XCV-R (反向)5 ‘ -CAAACAGCATTTCCACCTTGAA-3 ‘所述探針的序列為XCV-P 5' -CCTGAAGCGAAGCTCTGCCAAGTCG-3‘，該探針的5'端用報(bào)告熒光染料標(biāo)記，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。實(shí)施例2總DNA的提取1)采集適量幼嫩葉片，用液氮研成粉末，0.4g裝入1.5ml離心管中(_20°C預(yù)冷)2)預(yù)熱1. 5 X CTAB到95°C，加Iml到裝有葉片粉末的離心管中，混勻(防止凍融)。3)立即置于65°C水浴30min，每5min，上下顛倒1次，12000g離心5min。4)吸取上清液約600 μ 1，加入等體積(600 μ 1)氯仿/異戊醇(24 1)，上下顛倒 數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止，12000g離心5分鐘。5)取450 μ 1上清液于一新1. 5ml離心管，加入Iml 95%乙醇和45 μ 1 IOM NH4AC, 混勻，室溫放置IOmin。6) 12000g離心lOmin，去上清液，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥約30min。7)加入50μ1 1/10ΤΕ或無(wú)菌水(含20μ g RNase)，置于4°C過(guò)夜，待DNA溶解后，檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。實(shí)施例3Real_time PCR擴(kuò)增方法的建立1、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系以菌液為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，即在20 μ L反應(yīng)體系中加入8 μ L超純水， 10 μ L 2 X PremixEx Taq , 0· 5 μ L 引物 XCV-F (20 μ mol/L)，0· 5 μ L 引物 XCV-R (20 μ mol/ L)，0. 5 μ L TaqMan 探針 XCV-P (20 μ mol/L)，0. 5 μ L 菌液。
2、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件將樣品管放入Roche公司的LightCycler1. 0熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)第一個(gè)循環(huán)為95°C 3min ；隨后40個(gè)循環(huán)，92°C 5s,60°C 30s。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù) 據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。實(shí)施例4辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Real-time PCR方法的特異性確定以發(fā)病后顯癥及未顯癥的辣椒葉片總DNA為模板，以健康辣椒為對(duì)照，通過(guò)實(shí)時(shí) 熒光PCR檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。試驗(yàn)結(jié)果以發(fā)病后顯癥及未顯癥的辣椒葉片的總DNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)可觀 察到明顯的熒光強(qiáng)度變化，而健康對(duì)照的熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例5靈敏度實(shí)驗(yàn)用超純水分別稀釋細(xì)菌菌液，進(jìn)行相對(duì)靈敏度檢測(cè)，在20 μ L反應(yīng)體系中，分別 加入 0. 5 μ L 如下濃度的稀釋菌液1. 8 X 109cfu/mL, 1. 8 X 108cfu/mL, 1· 8 X 107cfu/mL, 1. 8X 106cfu/mL, 1. 8X 105cfu/mL, 1. 8X 104cfu/mL, 1. 8X 103cfu/mL, 1. 8X 102cfu/mL, 1. 8 X IO1CfuAiL, 1. 8X 10°cfu/mL。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，最低檢測(cè)限是9個(gè)細(xì)菌。
權(quán)利要求
1.一種辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌檢測(cè)用引物，其核苷酸序列為 XCV-F 5 ‘ -GGATGGGCAGCGTATCTTTC-3‘XCV-R 5' -CAAACAGCATTTCCACCTTGAA-3‘。
2.一種與權(quán)利要求1所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列為XCV-P: 5 ‘ -CCTGAAGCGAAGCTCTGCCAAGTCG-3 ‘，該探針一端標(biāo)記有熒光染料，另一端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，該探針5’端標(biāo)記有FAM熒光染料，3’采用 了 BHQ淬滅基團(tuán)。
4.一種檢測(cè)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的方法，該方法以樣品菌液為模板，利用權(quán)利要求1 所述的引物以及權(quán)利要求2或3所述的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù) 據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)過(guò)程中的退火溫度為 60 "C。
6.含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其還包括權(quán)利要求2或3所述的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌檢測(cè)用引物及探針，所述引物的核苷酸序列如序列表XCV-F&XCV-R所示，所述探針的核苷酸序列如序列表XCV-P所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測(cè)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的方法，該方法以樣品菌液為模板，利用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明探針特異性好，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102140499SQ201010528778
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者朱水芳, 董明明, 趙文軍, 陳巖, 陳洪俊 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院