專利名稱：大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌harpinZ_PsgA1蛋白的表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)菌信號(hào)因子hrpZPsgA1基因的克隆及其高效表達(dá)產(chǎn)物的純化，以及該純化蛋白harpinZPsgA1促進(jìn)植物生長(zhǎng)及抗病方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是一種其種子含有豐富的蛋白質(zhì)的豆科植物，其種子呈橢圓形、球形，顏色有黃色、淡綠色、黑色等，故又有黃豆、青豆、黑豆之稱，是豆科植物中最富有營(yíng)養(yǎng)而又易于消化的食物，是蛋白質(zhì)最豐富最廉價(jià)的來(lái)源，在今天世界上許多地方是人和動(dòng)物的主要食物。大豆具有多種用途，最常用來(lái)做各種豆制品、榨取豆油、釀造醬油和提取蛋白質(zhì)，而豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜飼料，是最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。高等植物過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitive response ;HR)是植物受到病原細(xì)菌侵染，發(fā)生非親和性反應(yīng)時(shí)，在病原菌入侵點(diǎn)周圍植物組織局部快速死亡形成枯斑，是植物對(duì)病原菌抗性的一種普遍表現(xiàn)形式。hrp 基因(hypersensitive reaction and pathogencitygene)是一類決定病原菌對(duì)寄主植物致病性和誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)的基因。hrp基因是由多個(gè)hrp位點(diǎn)組成的基因簇，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并具有至少四方面的功能:基因調(diào)控、蛋白質(zhì)泌出和編碼HR反 應(yīng)激發(fā)子，以及參與細(xì)菌纖毛(pilus)的合成。在hrp基因所編碼的HR反應(yīng)激發(fā)子中，harpin是一類非特異性蛋白質(zhì)激發(fā)子，該蛋白質(zhì)富含甘氨酸，不含半胱氨酸，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物煙草上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，并且過(guò)敏反應(yīng)可以被真核生物代謝抑制劑抑制，是目前研究得較為深入的一類細(xì)菌分泌蛋白。Wei(1992)首次從梨火疫(E.amylovora)中分離得到一種能引起過(guò)敏反應(yīng)的蛋白激發(fā)子HrpN,隨后在丁香假單胞菌和青枯假單胞菌中也分離到了相應(yīng)的harpin類蛋白。以往研究表明，harpin可以通過(guò)啟動(dòng)多種信號(hào)途徑來(lái)誘導(dǎo)植物獲得抗性，harpin蛋白可以通過(guò)啟動(dòng)至少三條信號(hào)通路即:水楊酸(SA)信號(hào)通路、茉莉酸(JA)/乙烯(ET)信號(hào)通路和脫落酸(ABA)信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)植物獲得多種有益表型，如促進(jìn)生物生長(zhǎng)，使植物增強(qiáng)對(duì)病原菌和害蟲(chóng)的抗性，作為新型微生物蛋白農(nóng)藥的代表具有廣泛的應(yīng)用前景。大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病是我國(guó)，尤其是北方，大豆產(chǎn)區(qū)的一種主要病害，給我國(guó)的大豆生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失。大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病主要危害大豆的幼苗、葉片、葉柄、莖及豆莢。幼苗染病子葉生半圓形或近圓形褐色斑。葉片染病初生褪綠不規(guī)則形小斑點(diǎn)，水潰狀，擴(kuò)大后呈多角形或不規(guī)則形，大小約3 4_，病斑中間深褐色至黑褐色，外圍具一圈窄的褪綠暈環(huán)，病斑融合后成枯死斑塊。莖部染病初呈暗褐色水潰狀長(zhǎng)條形，擴(kuò)展后為不規(guī)則狀，稍凹陷。莢和豆粒染病生暗褐色條斑。大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病的致病菌為丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.glycinea),其也是世界范圍內(nèi)重要的植物病原細(xì)菌。因此，有獲取可有效提高植株對(duì)丁香假單胞菌大豆致病變種的抗性，促進(jìn)植株生長(zhǎng)的harpin類蛋白及其相關(guān)的生物制品的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的harpin類蛋白，表達(dá)所述蛋白的重組載體及其構(gòu)建的工程菌。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的:在本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼具有harpin蛋白功能的氨基酸序列的核苷酸序列hrpZPsgA1，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，其特征在于，所述載體含有第一方面所述的核苷酸序列，優(yōu)選地，所述載體為pET41a(+) -hrpZPsgA1重組載體。在本發(fā)明的第三方面，提供了第二方面所述的pET41a(+)-hrpZPsgA1重組載體的構(gòu)建方法，其由以下方法構(gòu)建:(I)將大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Al菌株在28°C條件下于KB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，之后提取Al菌株基因組DNA，用5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點(diǎn)的引物對(duì)hrpZPsgA1_Pl和hrpZPsgA1-P2以Al菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:hrpZPsgA1-Pl:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC BamHl (SEQ ID NO:3),hrpZPsgA1-P2:5' -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG EcoRl (SEQ ID NO:4)；反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min, 94°C變性lmin,56°C退火lmin,72°C延伸90s,循環(huán)35次，72°C延伸IOminJf PCR產(chǎn)物與pMD18_T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中；

(2)以重組質(zhì)粒pMD18-T-hrpZPsgA1為模板，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達(dá)載體pET41a(+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a(+)上的還原型谷胱甘肽GST標(biāo)簽融合，進(jìn)而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) _hrpZPsgA1。在本發(fā)明的第四方面，提供了含有第二方面所述載體的重組細(xì)胞，優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1。在本發(fā)明的第五方面，提供了第四方面中所述的重組大腸桿菌BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1的構(gòu)建方法，其包括將重組質(zhì)粒ET41a(+)_hrpZPsgA1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 中，獲得重組大腸桿菌 BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1。在本發(fā)明的第六方面，提供了第一方面所述的核苷酸序列所編碼的蛋白harpinZPsgA1，其序列為 SEQ ID NO:2。在本發(fā)明的第七方面，提供了包含第四方面所述的重組細(xì)胞或第六方面所述的蛋白的生物制品。在本發(fā)明的第八方面，提供了第七方面所述的生物制品在植物病害防治中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述植物病害為煙草花葉病毒引起的植物病害。本發(fā)明中使用的縮略語(yǔ):LB:細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaC110g/L，PH7.0 ；KB:假單胞菌培養(yǎng)基，胰蛋白胨 10g/L+ 甘油 10g/L+K2HP04l.5g/L+MgS04.7Η201.5g/L ；Km50:50μ g/ml 的卡那霉素；IPTG:異丙基硫代-β -半乳糖苷；PMSF:蛋白酶抑制劑苯甲基黃酰氟。有益效果1.本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病Al菌株的hrpZPsgA1基因序列及其所編碼的蛋白質(zhì)，采用基因工程方法利用GST融合表達(dá)harpin蛋白，顯著提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量。并通過(guò)GSTrap FF對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純蛋白濃度約為lmg/ml。2.本發(fā)明所獲得harpinZPsgA1富含甘氨酸，不含半胱氨酸，可以在非寄主植物煙草上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。3.本發(fā)明所獲得harpinZPsgA1處理煙草，可以促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，顯著提高煙草對(duì)煙草花葉病毒病的抗性，以上結(jié)論證明harpinZPsgA1具有開(kāi)發(fā)成生物源農(nóng)藥的應(yīng)用價(jià)值。


圖1.重組質(zhì)粒pET41a(+)_hrpZPsgA1PCR及酶切驗(yàn)證:A重組質(zhì)粒pET41a(+) -hrpZPsgA1 的 PCR 擴(kuò)增，其中 Ml 為 DNA marker λ -HindIII ；Μ2 為 DNAmarker DL2000 ；1 為 pET41a (+) _hrpZPsgA1 ;2 為 pET41a (+)-hrpZPsgSl ;B 重組質(zhì)粒pET41a(+)-hrpZPsgA1 的酶切驗(yàn)證，其中 Ml 為 DNA marker DL2000 ；1 為 hrpZPsgA1 ；2 為hrpZPsgSl ；3為清水對(duì)照。圖2.harpinZPsgA1的表達(dá)及純化:其中M為蛋白marker ；1為harpinZPsgA1粗提蛋白；2為純化的harpinZPsgA1蛋白。圖3.harpinZPsgA1 的生物活性檢測(cè):其中 I 為 BL21 ；2 為 BL21/pET41a (+) ；3 為 PBS緩沖液；4 為 harpinZPsgA1。圖4.harpinZPsgA1對(duì)煙草種子的促生作用，其中A為不同濃度的harpinZPsgA1對(duì)煙草種子的促生作用；B為 harpinZPsgA1處理煙草種子16天后根長(zhǎng)差異顯著性分析。圖5.harpinZPsgA1誘導(dǎo)煙草抵抗煙草花葉病毒(TMV)侵染。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式
進(jìn)一步描述本發(fā)明，由技術(shù)常識(shí)可知，本發(fā)明也可通過(guò)其它的不脫離本發(fā)明技術(shù)特征的方案來(lái)描述，因此所有在本發(fā)明范圍內(nèi)或等同本發(fā)明范圍內(nèi)的改變均被本發(fā)明包含。實(shí)施例1.hrpZPsgA1基因的克隆將大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringaepv.glycinea)Al菌株(保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期為2012年10月22日，保藏號(hào)為CGMCC N0.6700)在28°C條件下于KB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，提取Al菌株基因組DNA，根據(jù)GenBank中登錄號(hào)為L(zhǎng)41862的hrpZ序列，設(shè)計(jì)完整開(kāi)放閱讀框(ORF)引物，在5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點(diǎn)；hrpZPsgA1-Pl:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC ；hrpZPsgA1-P2:5’ -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG。以Al菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，94°C變性 lmin，56°C退火 lmin，72°C延伸 90s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切驗(yàn)證得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取重組質(zhì)粒DNA并測(cè)序。序列分析采用DNAStar軟件，同源性比對(duì)在GenBank (http://www.ncb1.nlm.gov)中通過(guò)Blast程序進(jìn)行比對(duì)。
實(shí)施例2.harpinZPsgA1蛋白的表達(dá)及純化以測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1為模板，PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達(dá)載體pET41a (+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a (+)上的還原型谷胱甘肽GST標(biāo)簽融合，進(jìn)而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) -hrpZPsgA1。將重組質(zhì)粒和pET41a(+)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定出陽(yáng)性重組菌株。重組菌株BL21/pET41a(+)-hrpZPsgA1 在 LB 液體培養(yǎng)基(km50 μ g/ml)中 37 V(200rpm/min)振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按照1%的比例轉(zhuǎn)接到km50的液體LB中，37°C振蕩培養(yǎng)約2-3h，至0D600=0.6 0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)2_3h。取誘導(dǎo)的菌液離心收集菌體，用PBS (磷酸緩沖液)洗三次，重溶于1/20原菌體培養(yǎng)體積的磷酸緩沖液中，向菌體懸浮液中加入終濃度為100 μ g/ml的溶菌酶，終濃度為0.1mM的蛋白酶抑制劑PMSF,經(jīng)超聲波破碎后離心取上清即為粗提蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。使用GSTrap FF對(duì) 標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，具體操作參見(jiàn)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，純蛋白濃度約為lmg/ml。以上獲得的純化harpinZPsgA1可以在促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物抗病方面得到應(yīng)用。實(shí)施例3:大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Al菌株hrpZPsgA1基因的克隆與測(cè)序大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Al菌株首先在KB固體培養(yǎng)基上篩選，該菌株能分泌熒光色素，并能在紫外光下檢測(cè)到熒光。將選取的單克隆菌落，于28°C條件下在KB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24h，用于提取基因組DNA。根據(jù)Genbank中登錄號(hào)為L(zhǎng)41862的hrpZ序列，設(shè)計(jì)完整開(kāi)放閱讀框(ORF)引物，在5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點(diǎn)；hrpZPsgA1-Pl:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC ；hrpZPsgA1-P2:5’ -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG。以Al菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，94°C變性 lmin，56°C退火 lmin，72°C延伸 90s，循環(huán) 35 次，72°C延伸 IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物與 pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切驗(yàn)證得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取重組質(zhì)粒DNA送到南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-hrpZPsgA1序列測(cè)定結(jié)果顯示，hrpZPsgA1基因大小為1026bp，編碼341個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)富含甘氨酸(13.19%)，不含半胱氨酸。實(shí)施例4:harpinZPsgA1蛋白的表達(dá)及純化l.hrpZPsgA1基因工程表達(dá)菌株的構(gòu)建以測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1為模板，PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達(dá)載體pET41a (+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a (+)上的還原型谷胱甘肽GST標(biāo)簽融合，進(jìn)而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) -hrpZPsgA1。將重組質(zhì)粒和pET41a(+)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后經(jīng)質(zhì)粒PCR及酶切鑒定出陽(yáng)性菌株(圖1)。2.harpinZPsgA1 蛋白的表達(dá)(I)活化原種:重組菌株BL21/pET41a (+) _hrpZPsgA1接種于LB液體培養(yǎng)基(km50y g/ml)中37°C (200rpm/min)振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按照1%的比例轉(zhuǎn)接到km50的液體LB中，37°C振蕩培養(yǎng)約2-3h，至0D600=0.6 0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)2-3h。(2)破碎細(xì)胞:收集菌液8000rpm/min，4°C離心IOmin收集菌體，用PBS (磷酸緩沖液)洗三次，重溶于1/20原菌體培養(yǎng)體積的磷酸緩沖液中，向菌體懸浮液中加入終濃度為100 μ g/ml的溶菌酶，終濃度為0.1mM的蛋白酶抑制劑PMSF。10000rpm/min, 4°C離心15min,收集上清，即為harpinZPsgA1的粗提蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白大小為62kDa，harpinZPsgA1大小為35kDa, GST標(biāo)簽大小為27kDa (圖2)。3.harpinZPsgA1 的純化使用GSTrap FF對(duì)標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)顯示的方法，純化之前,用0.45 μ m濾膜過(guò)濾harpinZPsgA1粗提蛋白，去除粗提蛋白中一些細(xì)胞碎片或其它雜質(zhì)，以免阻塞純化柱，純化時(shí)使用蠕動(dòng)泵上樣。純化的樣品經(jīng)超濾柱超濾、濃縮，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，純蛋白于-70V保存。4:harpinZPsgA1蛋白 的生物活性檢測(cè)用無(wú)頭的注射器向煙草葉背面細(xì)胞間隙注射harpinZPsgA1粗提液，同時(shí)以BL21、BL21/pET41a(+)和清水處理為對(duì)照，36h內(nèi)觀察葉片HR發(fā)展情況(圖3)。實(shí)施例5:harpinZPsgA1蛋白質(zhì)的應(yīng)用舉例1.harpinZPsgA1促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)將純化的harpinZPsgA1稀釋后浸泡煙早種子，冋時(shí)以清水為對(duì)照。12h后吸出蛋白液，加入30%的NaClO表面消毒5min，滅菌水清洗三次后倒置于滅菌的濾紙上，待種子吸干水后用滅菌牙簽點(diǎn)入含MS培養(yǎng)基的方形培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中，垂直培養(yǎng),每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。20d后觀察，測(cè)定根長(zhǎng)和鮮重，應(yīng)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)得出50-200 μ g/ml的harpinZPsgA1對(duì)煙草有明顯的促生作用(圖4A和圖4B)，100 μ g/ml的harpinZPsgA1與清水對(duì)照組存在顯著性差異。2.harpinZPsgA1誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒使用100 μ g/ml純化的harpinZPsgA1預(yù)先噴霧處理煙草中部葉片，以清水噴霧處理為對(duì)照。6h后在處理葉片上摩擦接種煙草花葉病毒。3天后，我們觀察病斑的數(shù)目及直徑。結(jié)果顯示，經(jīng)harpinZPsgA1處理后的煙草葉片，其上形成的病斑數(shù)要明顯少于清水處理組，病斑抑制率可達(dá)60%以上。(圖5)。申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，等效替換以及具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種編碼具有harpin蛋白功能的氨基酸序列的核苷酸序列hrpZPsgA1，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，優(yōu)選地，所述載體為pET41a(+)-hrpZPsgA1重組載體。
3.如權(quán)利要求2所述的載體的構(gòu)建方法，其由以下方法構(gòu)建: (1)將大豆細(xì)菌性 斑點(diǎn)病菌Al菌株在28°C條件下于KB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，之后提取Al菌株基因組DNAj 5’端分別引入BamHl和EcoRl酶切位點(diǎn)的引物對(duì)hrpZPsgA1_Pl和hrpZPsgA1-P2以Al菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:hrpZPsgA1-P 1:5’ -GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC BamHl (SEQ ID NO:3),hrpZPsgA1-P2:5’ -GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG EcoRl (SEQID NO:4)； 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸90s，循環(huán)35次，72°C延伸lOmin，將PCR產(chǎn)物與pMD18_T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T_hrpZPsgA1并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中； (2)以重組質(zhì)粒pMD18-T-hrpZPsgA1為模板，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后經(jīng)BamHl和EcoRl雙酶切后連接到表達(dá)載體pET41a(+)上，使得hrpZPsgA1基因與pET41a(+)上的還原型谷胱甘肽GST標(biāo)簽融合，進(jìn)而得到重組質(zhì)粒pET41a (+) _hrpZPsgA1。
4.一種含有權(quán)利要求2所述載體的重組細(xì)胞，優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌BL21 /pET41 a (+) -hrpZPsgA1。
5.如權(quán)利要求4中所述的重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，其包括將重組質(zhì)粒ET41a(+) -hrpZPsgA1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，獲得重組大腸桿菌BL21/pET41a (+) -hrpZPsgA1。
6.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列所編碼的蛋白harpinZPsgA1，其序列為SEQID NO:2。
7.包含如權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞或如權(quán)利要求6所述的蛋白的生物制品。
8.如權(quán)利要求7所述的生物制品在植物病害防治中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述植物病害為由煙草花葉病毒引起的植物病害。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1菌株hrpZPsgA1基因。該基因可調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育并使植物獲得廣譜抗病性。本發(fā)明采用GST融合表達(dá)harpinZPsgA1蛋白，可以顯著提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量。所述蛋白可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)，有效防治由煙草花葉病毒引起的植物病害。
文檔編號(hào)C12N15/31GK103205439SQ20121043433
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者高學(xué)文, 伍輝軍, 沈波, 張巖 申請(qǐng)人:無(wú)錫亞克生物科技有限公司