專利名稱：管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，尤其是涉及一種管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白及其 制備方法。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)是由N-乙酰葡糖胺單體以β-1，4_糖苷鍵連接起來的多聚物，主要由昆 蟲、真菌、甲殼類動物和其他海洋生物產(chǎn)生。目前，已發(fā)現(xiàn)在自然界中存在3種幾丁質(zhì)晶體 類型，即α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)和Y-幾丁質(zhì)。在生物圈中，每年產(chǎn)生數(shù)億噸的幾丁質(zhì)， 是自然界中含量僅次于纖維素的大分子物質(zhì)，也是海洋中產(chǎn)量最大的大分子物質(zhì)，因此幾 丁質(zhì)是開發(fā)前景廣闊的能源物質(zhì)?，F(xiàn)階段對幾丁質(zhì)的利用只能通過強酸強堿處理，既浪 費資源，又污染環(huán)境，將生物酶類應(yīng)用于生產(chǎn)過程中，將極大地解決該難題。在幾丁質(zhì)酶 降解幾丁質(zhì)的過程中，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白起著不可忽略的作用，它不但可以結(jié)合幾丁質(zhì)，使 其結(jié)構(gòu)變松散，還可以增強幾丁質(zhì)酶活性，大大提高降解效率(Chamoy，L.，Nicolai, M.， Ravaux, J. , Quennedey, B. ,Gail,F. and Delachambre J. (2001). A Novel chitin-binding protein from the vestimentiferan Riftia pachyptila interacts specifically with β -chitin. J Biol Chem 276 (11)，8051-8058)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因。本發(fā)明的第二個目的是提供管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。本發(fā)明的第三個目的是提供所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的 制備方法。本發(fā)明所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因為管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpA基因、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpB基 因、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpC基因或管狀蠕蟲Ridgeia piscesae 幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpD基因。所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpA基因的分子類型為DNA，序 列特征長度為564bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpA基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 1 1 ATGTCGAAGC TTCTCGCAGC CCTTGTGGCA CTTAGCATCG CCTACTCCGT GCAAGGGTGC61 TCGGATTCGT GCGTCGGCAG ACAGAACGGC CGCTGCTATC CTTCGGCGTG TGGTCCGTGC121 AACTATTACT TCAAGTGTCA ACGTACGATC GTTGTCGAGC AATACTGTAG AGCGTCATCG181 TACTGCTACC TCAACGGACG ATGCCGACCA TGTGGTGACT CTTGCGAGAG AAAAAGGGAT241 GGCGTCTACC CATCAGTGAA CCGGGCCCGA CCCTACTACT ACCAGTGCGA AGCCGGACAA301 CTGTACTACC GCGAGTGCCA GCCCTTCCAG ATCTTCAACG CGTGGACCAG GAAATGCGAA361 TGCTTCGAGG GCGCCTGTCT GCACGGAAAC GGATGGAGAT CTTCCTTCTG CCGAGGCAAG
421 GGATGGCGTG TGTTCTGCAG CGGTGGTTTC GCCAGGTATT ACAGGCAATG CCCTCGACCC481 CGACCTCACG TGTGCTGTCA CACCTACACG TGCGTGTCCA CCTGCACCTC GTACTATGGA541 CGTGGTCACT GCTGCAGAGG ATAG。所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpB基因的分子類型為DNA ’序 列特征長度為582bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpB基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 2 1ATGTCGAAGCTTATCATTGCCCTGGCGGTTCTTTCCGCCTGCATCGCCGTCCAAGCCCGC
61GGATGGGAGGGATGTTCTCAGGACAAATGCGACGGCAGACGTACCGGCAGGAGATACCAG
121TCTCTCTGCGCCCCTGTCAGCGTCTACTACAGATGTCGCCACAGTCGCCCCGTCTACGAC
181AACTGCCGTGAGCGCAACTATTGCGTCGTCAACGGCCGATGCTGCCGATGCGGTGACACC
241TGTGAGGGCAAATGCGACGGCGTCTACCCGTCCGTGAACCGACCCCGTCCCGCCTACTAC
301CAGTGTGACGGAGGAGAGCTGTACTACCGCACGTGCCAGCCCTTCCAGATCTTCAACCCC
361TGGACCAAGCAATGCGAGTGCTACGAGGGTTCGTGTCTCCATGGCAACGGGTACAGGGCG
421TCCTTCTGCCGCGGCAAGGAATGGCGCGTGTACTGCCGGGCTGGATTCCCCCAGTTCTAC
481GAGCGCTGTCCCCGACCCAGGCCCTACGTGTGCTGCAAGACTTACACCTGCATCTCCACG
541TGCAGCGTGTTCCAGGGCAGAAACGGATGTTGCCACGCCTAG。 所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpC基因的分子類型為DNA ；序 列特征長度為591bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpC基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 3 1ATGGCGAAGTTTTTCATCGCATTGTTGGTGCTCGTCGCTGTATATGCAACTGAAGCACTC
61CCTGGTAACGGTTACGAAGGTTGTTTCAACGGCTACAACTACGATTGCTGCAGGCGTCGT
121AGACCCAACTTCTGCTACCCGTCGCTGGTGAAGCCACTGCCTTACTACTACCGATGTGTC
181GGCAGGAGAGTTGTGTACGGCAGATGTGAGACGCACCTTTGCGTCACAGTAAAGGGAAAT
241TGCGGATCGTGCAGTGATCGTTGTCGCTACACTCGTCATTCACACTATTACTACTCGAGC
301TACTTCTACGGTCGCTACTACTACCGATGCAACCGCGGAGCACTGAACTACCGCTCGTGT
361GGACTCAACCAGTCTTACTATCCGGGACGCGGCCGTTGCGGCTGCAGAGAGAATTACTGT
421GAGAGGCACAACGGCTGGCAGTCGACCGTTTGCAACGGATGCGGAAGCTACGTCTTCTGC
481AGATATGGACGTCCCATTCGCTACAGGAGATGCCCCTGGAGCAGACGCCACTACGACTGT
541CATCGCCATCGTTGTGTCAGCCATTGCAACGGTTGCTGTGGCCATCGATAA0 所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpD基因的分子類型為DNA ；序 列特征長度為453bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpD基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 4 1ATGCAGAAGTTGGTCTTCATAGTGGTAGCAATCGTCATGGCCTTGGCGAGTTGTACCTCC
61GCTAGGAAGAAAAAACCGTGCGTGGAGTCGTGCGTGGGCCGACCGGACGGCGAGTACCAA
121GCATCCTGCACCTACGACTGTCGCTTCTTCGTCAAGTGTGTCTTCGGCTTCTCCTTCCTG
181TTGAAATGCCGCGAGGGACATTTCTATGACGTCGACGTGAGAGACTGTGTCAAAGGATGT
241CCGACTGGACCACGCGGAATCCTCGACTGCTACGACCGCCCTGACGGCCACTGGCAGCAT
301TGCTGCTACTGCGACTTGTACGCCACTCGTGCGAGCAGGGGTATGTTCTTCCACCGCCGC
361TGTGAGCCGGGCGGTCCGGTCTGGCACGATGACAAACACAAGTGTCTCTGGACGTCGGGA
421 ACATGTCCCG GGGTACACCG ATACTACGCT TAA。本發(fā)明所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的核苷酸序列可采 用以下方法獲得提取管狀蠕蟲Ridgeia piscesae的RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一 步以 cDNA 為模板，分別以合成序列 SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12，SEQID No. 13，SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 15 和 SEQ ID No. 16 作為引物，經(jīng) PCR 擴增 得到了 SEQID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的序列。然后在昆蟲細胞 high5中進行重組表達，生物學方法證明cbpA、CbpB、CbpC和cbpD基因編碼的多肽(SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8)具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。所述SEQIDNo.9 GGATCCGGTGCTCGGATTCGTGCGTC
所述SEQIDNo.10CTCGAGCTATCCTCTGCAGCAGTGAC
所述SEQIDNo.11GGATCCCCCGCGGATGGGAGGGATGT
所述SEQIDNo.12CTCGAGCTAGGCGTGGCAACATCCGT
所述SEQIDNo.13GGATCCCACTCCCTGGTAACGGTTAC
所述SEQIDNo.14TCTAGATTATCGATGGCCACAGCAAC
所述SEQIDNo.15GGATCCCTAGGAAGAAAAAACCGTGC
所述SEQIDNo.16CTCGAGTTAAGCGTAGTATCGGTGTA
所述SEQIDNo.5
SDSCVGRQNG GVYPSVNRAR GffRVFCSGGF
NYYFKCQRTI LYYRECQPFQ RPHVCCHTYT
VVEQYCRASS IFNAffTRKCE CVSTCTSYYG
1 MSKLLAALVA LSIAYSVQGC 61 YCYLNGRCRP CGDSCERKRD 121 CFEGACLHGN GffRSSFCRGK 181 RGHCCRG ； 所述 SEQ ID No. 6 1 MSKLIIALAV LSACIAVQAR 61 NCRERNYCVV NGRCCROiDT 121 WTKQCECYEG SCLHGNGYRA 181 CSVFQGRNGC CHA ； 所述 SEQ ID No. 7 1 MAKFFIALLV LVAVYATEAL 61 GRRVVYGRCE THLCVTVKGN 121 GLNQSYYPGR GRCGCRENYC 181 HRHRCVSHCN GCCGHR ； 所述 SEQ ID No. 8
1 MQKLVFIVVA IVMALASCTS ARKKKPCVES CVGRPDGEYQ ASCTYDCRFF VKCVFGFSFL 61 LKCREGHFYD VDVRDCVKGC PTGPRGILDC YDRPDGHWQH CCYCDLYATR ASRGMFFHRR 121 CEPGGPVffHD DKHKCLffTSG TCPGVHRYYA。
本發(fā)明所述的管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白為管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpA、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpB、管狀蠕 蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpC或管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋 白 CbpD0
GffEGCSQDKC CEGKCDGVYP SFCRGKEffRV
PGNGYEGCFN CGSCSDRCRY ERHNGffQSTV
RCYPSACGPC PYYYQCEAGQ ARYYRQCPRP
DGRRTGRRYQ SVNRPRPAYY YCRAGFPQFY
GYNYDCCRRR TRHSHYYYSS CNGCGSYVFC
SLCAPVSVYY QCDGGELYYR ERCPRPRPYV
RPNFCYPSLV YFYGRYYYRC RYGRPIRYRR
RCRHSRPVYD TCQPFQIFNP CCKTYTCIST
KPLPYYYRCV NRGALNYRSC CPffSRRHYDC
8
所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpA的分子類型為蛋白質(zhì) ’序 列特征長度為187aa，類型為氨基酸；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 CbpA的序列如下所示，記為SEQ ID No. 5 1 MSKLLAALVA LSIAYSVQGC SDSCVGRQNG RCYPSACGPC NYYFKCQRTI VVEQYCRASS61 YCYLNGRCRP CGDSCERKRD GVYPSVNRAR PYYYQCEAGQ LYYRECQPFQ IFNAffTRKCE121 CFEGACLHGN GffRSSFCRGK GffRVFCSGGF ARYYRQCPRP RPHVCCHTYT CVSTCTSYYG181 RGHCCRG。所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpB的分子類型為蛋白質(zhì)；序 列特征長度為193aa，類型為氨基酸；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 CbpB的序列如下所示，記為SEQ ID No. 6 1 MSKLIIALAV LSACIAVQAR GffEGCSQDKC DGRRTGRRYQ SLCAPVSVYY RCRHSRPVYD61 NCRERNYCVV NGRCCROiDT CEGKCDGVYP SVNRPRPAYY QCDGGELYYR TCQPFQIFNP121 WTKQCECYEG SCLHGNGYRA SFCRGKEffRV YCRAGFPQFY ERCPRPRPYV CCKTYTCIST181 CSVFQGRNGC CHA。所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpC的分子類型為蛋白質(zhì)；序 列特征長度為196aa，類型為氨基酸；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 CbpC的序列如下所示，記為SEQ ID No. 7 1 MAKFFIALLV LVAVYATEAL PGNGYEGCFN GYNYDCCRRR RPNFCYPSLV KPLPYYYRCV61 GRRVVYGRCE THLCVTVKGN CGSCSDRCRY TRHSHYYYSS YFYGRYYYRC NRGALNYRSC121 GLNQSYYPGR GRCGCRENYC ERHNGffQSTV CNGCGSYVFC RYGRPIRYRR CPffSRRHYDC181 HRHRCVSHCN GCCGHR。所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpD的分子類型為蛋白質(zhì)；序 列特征長度為150aa，類型為氨基酸；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 CbpD的序列如下所示，記為SEQ ID No. 8 1 MQKLVFIVVA IVMALASCTS ARKKKPCVES CVGRPDGEYQ ASCTYDCRFF VKCVFGFSFL61 LKCREGHFYD VDVRDCVKGC PTGPRGILDC YDRPDGHWQH CCYCDLYATR ASRGMFFHRR121 CEPGGPVffHD DKHKCLffTSG TCPGVHRYYA。這些蛋白具有SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8 所示氨基 酸序列的多肽；或?qū)EQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8氨基酸序列 經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列相同功能的多肽。本發(fā)明所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的制備方法，包括以下步 驟1)管狀蠕蟲 Ridgeia piscesae RNA 的提??；2)管狀蠕蟲 Ridgeia piscesae cDNA 反轉(zhuǎn)錄；3)管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的PCR擴增和序列分析；4)管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的表達。本發(fā)明通過提取管狀蠕蟲Ridgeia piscesae的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄，從中克隆和鑒 定了 4個幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因cbpA、cbpB, cbpC和cbpD，并在昆蟲細胞high5中進行重組表達，進一步對重組蛋白進行了性質(zhì)測定，為該蛋白的實際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明通過同源重組表達4種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，可以克服管狀蠕蟲不易采集、分 離純化過程復雜繁瑣等不足，為該蛋白在生物、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠 定基石出。


圖1為管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白重組表達的western blot 檢測圖譜。在圖1中，1 重組載體pIZ-FLAG-CbpA在high5中的表達；2 重組載體 pIZ-FLAG-CbpB在high5中的表達；3 重組載體pIZ_FLAG_CbpC在high5中的表達；4 重組 載體pIZ-FLAG-CbpD在high5中的表達。圖2為管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白親和性質(zhì)分析western blot 檢測圖譜。在圖2中，1 重組載體pIZ-FLAG-CbpA在high5中的表達；2 重組CbpA與α-幾 丁質(zhì)親和實驗檢測；3 重組CbpA與β -幾丁質(zhì)親和實驗檢測；4 重組載體pIZ-FLAG-CbpB 在high5中的表達；5 重組CbpB與α -幾丁質(zhì)親和實驗檢測；6 重組CbpB與β -幾丁質(zhì) 親和實驗檢測；7 重組載體pIZ-FLAG-CbpC在high5中的表達；8 重組CbpC與α -幾丁質(zhì) 親和實驗檢測；9 重組CbpC與β -幾丁質(zhì)親和實驗檢測；10 重組載體pIZ-FLAG-CbpD在 high5中的表達；11 重組CbpD與α-幾丁質(zhì)親和實驗檢測；12 重組CbpD與β-幾丁質(zhì)親 和實驗檢測。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如分子克隆實驗室手冊(薩姆布魯克，拉塞爾(著)，黃培堂(譯)，《分子克隆實驗指南》， 科學出版社，2002年，第三版.)中所述的實驗條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的 條件。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是1.管狀蠕蟲 Ridgeia piscesae RNA 的提取取IOOmg 管狀蠕蟲 Ridgeia piscesae 組織樣品，加入 ImL TRI Reagent (MRC 公 司)，用電動勻漿機徹底分散組織，室溫靜置5min裂解細胞；加入0. 2mL氯仿，劇烈振蕩 15s，室溫靜置IOmin ；4°C，12000g離心15min ；將上層液體轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入 0. 5mL異丙醇，混勻，室溫放置IOmin ；4°C，12000g離心IOmin ；倒去液體，加入ImL 75%乙 醇漂洗；4°C，7500g離心5min ；倒去液體，RNA沉淀稍加干燥后溶于適量的DEPC處理過的水 中；用紫外分光光度計測量總RNA在OD23tl, OD26tl, OD28tl的吸光度，判定總RNA的濃度與純度。2.管狀蠕蟲 Ridgeia piscesae cDNA 反轉(zhuǎn)錄在0. 5mL離心管制備cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包括2 μ g總RNA，1 μ L 01igo(dT)20 (50 yM),lyL dNTP(lOmM)，用 DEPC 處理過的 H2O 將總體積補至 13yL ；反應(yīng) 體系65°C處理5min，立即放入冰浴中Imin ；稍離心，加入下列組分4 μ L5 X First-Strand Buffer,1 μ LDTT(0. 1Μ)，1 μ L RNase Inhibitor (40U/μ L)(TaKaRa 公司)禾口 1 μ L SuperScript III reverse transcriptase (200U/ μ L) (Invitrogen 公司)；反應(yīng)體系輕弓單混勻，稍離心；50°C溫育60min ；70°C處理15min終止反應(yīng)。3.管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的PCR擴增和序列分析以管狀蠕蟲Ridgeia piscesae cDNA為模板，用引物AF和AR、BF和BR、CF和CR、 DF和DR分別擴增幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因cbpA、cbpB, cbpC和cbpD基因(不含有信號肽)。AF GGATCCGGTGCTCGGATTCGTGCGTC(SEQID No 9)；AR CTCGAGCTATCCTCTGCAGCAGTGAC (SEQ ID No. 10)。BF GGATCCCCCGCGGATGGGAGGGATGT(SEQ ID No. 11)；BR CTCGAGCTAGGCGTGGCAACATCCGT(SEQ ID No. 12)。CF GGATCCCACTCCCTGGTAACGGTTAC(SEQ ID No. 13)；CR TCTAGATTATCGATGGCCACAGCAAC(SEQ ID No. 14)。DF GGATCCCTAGGAAGAAAAAACCGTGC(SEQ ID No. 15)；DR CTCGAGTTAAGCGTAGTATCGGTGTA(SEQ ID No. 16)。劃線部分GGATCC代表BamH I酶切位點，CTCGAG代表Xho I酶切位點，TCTAGA代 表XbaI酶切位點。在50 μ L的反應(yīng)體系中含2 μ L模板，1 μ L引物AF (或BF、CF、DF) (10 μ Μ)，1 μ L引 物 AR (或 BR、CR、DR) (10 μ Μ)，4 μ LdNTP (各 2. 5mM)，10 μ L 5 X Primer STAR Buffer, 1 μ L Primer STAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ L) (TaKARa 公司)，用 H2O 將總體積補至 50 μ L。 PCR反應(yīng)條件為98°C 10s、68°C lmin、68°C 7min (30cycles) ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與 T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO中，挑取有插入DNA片段的陽性克隆測序。根據(jù)得到的核苷酸序列推導出的CbpA、CbpB, CbpC和CbpD的氨基酸序列，分別含 有187、193、196和150個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQID No. 7、SEQ ID No. 8。4.管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的表達將含有cbpA、cbpB、cbpC和cbpD基因的質(zhì)粒用各自引物所帶酶切位點的限制性內(nèi) 切酶進行酶切，膠回收cbpA、cbpB, cbpC和cbpD基因片段，同時將質(zhì)粒ρΙΖ-FLAG也用相同 的酶進行酶切。將兩者連接過夜(12 16h)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α 中，提取質(zhì)粒，測序驗證。復蘇昆蟲細胞high5，按IO6細胞/孔接種至6孔細胞培養(yǎng)板，并預(yù)加Iml SFX 培養(yǎng)基(Hyclone公司)，27°C培養(yǎng)過夜。將重組表達質(zhì)粒pIZ-FLAG_CbpA/B/C/D分別與 200 μ 1 SFX培養(yǎng)基混勻制備A液；取200 μ 1 SFX培養(yǎng)基與4μ1 cell fectin轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen公司)混勻制備B液；再將A、B兩種液體混合制備C液，置27°C培養(yǎng)箱中預(yù) 熱30min。將復蘇培養(yǎng)過夜的昆蟲細胞high5中的培養(yǎng)基去除，并用SFX培養(yǎng)基洗一次；在 C液中加入400 μ 1 SFX培養(yǎng)基，混勻，然后加入到細胞培養(yǎng)板中；27°c培養(yǎng)5h，更換SFX培 養(yǎng)基；培養(yǎng) 60h 后，用 Lysis buffer (20mM Tris-HCl (pH 7. 4), IOOmM KCl,2mM EDTA,0. 1% NP40,10% Glycerol, 0. 5mM PMSF, 3mM DTT)裂解培養(yǎng)細胞制備蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳 后進行western blot檢測。結(jié)果表明管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在昆蟲 細胞high5中得到了重組表達(圖1)。5.管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白親和性質(zhì)分析按照步驟4分別制備管狀蠕蟲Ridgeia piscesae 4種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白重組表達樣品；分別將制備的蛋白樣品與等量α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)混勻，置垂直混合器，于4°C 結(jié)合4h ；用100倍體積的Lysis Buffer對結(jié)合混合物進行漂洗，去除非特異性結(jié)合；加入 100 μ 1 2 X SDS 上樣 buffer (20mM Tris-HCl pH8. 2,2mM EDTA,2% SDS, 10% β-巰基乙醇， 16%甘油，0.05%溴酚藍)，混勻后進行SDS-PAGE電泳；進一步進行western blot檢測。結(jié) 果顯示四種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白均為α-幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(圖2)。
權(quán)利要求
管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因，其特征在于為管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpA基因、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpB基因、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpC基因或管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpD基因。
2.如權(quán)利要求1所述的管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因，其特征在于，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbp基因的分子類型為DNA，序列 特征長度為564bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpA基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 1 1ATGTCGAAGCTTCTCGCAGCCCTTGTGGCACTTAGCATCGCCTACTCCGTGCAAGGGTGC61TCGGATTCGTGCGTCGGCAGACAGAACGGCCGCTGCTATCCTTCGGCGTGTGGTCCGTGC121AACTATTACTTCAAGTGTCAACGTACGATCGTTGTCGAGCAATACTGTAGAGCGTCATCG181TACTGCTACCTCAACGGACGATGCCGACCATGTGGTGACTCTTGCGAGAGAAAAAGGGAT241GGCGTCTACCCATCAGTGAACCGGGCCCGACCCTACTACTACCAGTGCGAAGCCGGACAA301CTGTACTACCGCGAGTGCCAGCCCTTCCAGATCTTCAACGCGTGGACCAGGAAATGCGAA361TGCTTCGAGGGCGCCTGTCTGCACGGAAACGGATGGAGATCTTCCTTCTGCCGAGGCAAG421GGATGGCGTGTGTTCTGCAGCGGTGGTTTCGCCAGGTATTACAGGCAATGCCCTCGACCC481CGACCTCACGTGTGCTGTCACACCTACACGTGCGTGTCCACCTGCACCTCGTACTATGGA541CGTGGTCACTGCTGCAGAGGATAG ；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpB基因的分子類型為DNA，序 列特征長度為582bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpB基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 2 1 ATGTCGAAGC TTATCATTGC CCTGGCGGTT CTTTCCGCCT GCATCGCCGT CCAAGCCCGC 61 GGATGGGAGG GATGTTCTCA GGACAAATGC GACGGCAGAC GTACCGGCAG GAGATACCAG 121 TCTCTCTGCG CCCCTGTCAG CGTCTACTAC AGATGTCGCC ACAGTCGCCC CGTCTACGAC 181 AACTGCCGTG AGCGCAACTA TTGCGTCGTC AACGGCCGAT GCTGCCGATG CGGTGACACC 241 TGTGAGGGCA AATGCGACGG CGTCTACCCG TCCGTGAACC GACCCCGTCC CGCCTACTAC 301 CAGTGTGACG GAGGAGAGCT GTACTACCGC ACGTGCCAGC CCTTCCAGAT CTTCAACCCC 361 TGGACCAAGC AATGCGAGTG CTACGAGGGT TCGTGTCTCC ATGGCAACGG GTACAGGGCG 421 TCCTTCTGCC GCGGCAAGGA ATGGCGCGTG TACTGCCGGG CTGGATTCCC CCAGTTCTAC 481 GAGCGCTGTC CCCGACCCAG GCCCTACGTG TGCTGCAAGA CTTACACCTG CATCTCCACG 541 TGCAGCGTGT TCCAGGGCAG AAACGGATGT TGCCACGCCT AG ；所述管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpC基因的分子類型為DNA，序列 特征長度為591bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpC基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 3 1 ATGGCGAAGT TTTTCATCGC ATTGTTGGTG CTCGTCGCTG TATATGCAAC TGAAGCACTC 61 CCTGGTAACG GTTACGAAGG TTGTTTCAAC GGCTACAACT ACGATTGCTG CAGGCGTCGT 121 AGACCCAACT TCTGCTACCC GTCGCTGGTG AAGCCACTGC CTTACTACTA CCGATGTGTC 181 GGCAGGAGAG TTGTGTACGG CAGATGTGAG ACGCACCTTT GCGTCACAGT AAAGGGAAAT`241TGCGGATCGTGCAGTGATCGTTGTCGCTACACTCGTCATTCACACTATTACTACTCGAGC`301TACTTCTACGGTCGCTACTACTACCGATGCAACCGCGGAGCACTGAACTACCGCTCGTGT`361GGACTCAACCAGTCTTACTATCCGGGACGCGGCCGTTGCGGCTGCAGAGAGAATTACTGT`421GAGAGGCACAACGGCTGGCAGTCGACCGTTTGCAACGGATGCGGAAGCTACGTCTTCTGC`481AGATATGGACGTCCCATTCGCTACAGGAGATGCCCCTGGAGCAGACGCCACTACGACTGT`541CATCGCCATCGTTGTGTCAGCCATTGCAACGGTTGCTGTGGCCATCGATAA；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpD基因的分子類型為DNA，序 列特征長度為453bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白cbpD基因的序列如下所示，記為SEQ ID No. 4 1 ATGCAGAAGT TGGTCTTCAT AGTGGTAGCA ATCGTCATGG CCTTGGCGAG 61 GCTAGGAAGA AAAAACCGTG CGTGGAGTCG TGCGTGGGCC GACCGGACGG 121 GCATCCTGCA CCTACGACTG TCGCTTCTTC GTCAAGTGTG TCTTCGGCTT 181 TTGAAATGCC GCGAGGGACA TTTCTATGAC GTCGACGTGA GAGACTGTGT 241 CCGACTGGAC CACGCGGAAT CCTCGACTGC TACGACCGCC CTGACGGCCA 301 TGCTGCTACT GCGACTTGTA CGCCACTCGT GCGAGCAGGG GTATGTTCTT 361 TGTGAGCCGG GCGGTCCGGT CTGGCACGAT GACAAACACA AGTGTCTCTG 421 ACATGTCCCG GGGTACACCG ATACTACGCT TAA。
3.如權(quán)利要求1所述的管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因，其特征在于 所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的核苷酸序列采用以下方法獲得提取管狀蠕蟲Ridgeia piscesae的RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一步以cDNA為 模板，分別以合成序列 SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12，SEQ IDNo. 13，SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 15 和 SEQ ID No. 16 作為引物，經(jīng) PCR 擴增得到了 SEQ IDNo. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 的序列；然后在昆蟲細胞 high5 中進 行重組表達，生物學方法證明cbpA、cbpB、cbpC和cbpD基因編碼的多肽SEQ ID No. 5、SEQ IDNo. 6、SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性；所述SEQIDNo.9 GGATCCGGTGCTCGGATTCGTGCGTC所述SEQIDNo.10CTCGAGCTATCCTCTGCAGCAGTGAC所述SEQIDNo.11GGATCCCCCGCGGATGGGAGGGATGT所述SEQIDNo.12CTCGAGCTAGGCGTGGCAACATCCGT所述SEQIDNo.13GGATCCCACTCCCTGGTAACGGTTAC所述SEQIDNo.14TCTAGATTATCGATGGCCACAGCAAC所述SEQIDNo.15GGATCCCTAGGAAGAAAAAACCGTGC所述SEQIDNo.16CTCGAGTTAAGCGTAGTATCGGTGTA所述SEQIDNo.5 `1 MSKLLAALVA LSIAYSVQGC SDSCVGRQNG RCYPSACGPC NYYFKCQRTI VVEQYCRASS 61 YCYLNGRCRP CGDSCERKRD GVYPSVNRAR PYYYQCEAGQ LYYRECQPFQ IFNAffTRKCE 121 CFEGACLHGN GffRSSFCRGK GffRVFCSGGF ARYYRQCPRP RPHVCCHTYT CVSTCTSYYG 181 RGHCCRG ； 所述 SEQ ID No. 6 TTGTACCTCC CGAGTACCAA CTCCTTCCTG CAAAGGATGT CTGGCAGCAT CCACCGCCGC GACGTCGGGA(1 MSKLIIALAV LSACIAVQAR GffEGCSQDKC DGRRTGRRYQ SLCAPVSVYY RCRHSRPVYD 61 NCRERNYCVV NGRCCROiDT CEGKCDGVYP SVNRPRPAYY QCDGGELYYR TCQPFQIFNP 121 WTKQCECYEG SCLHGNGYRA SFCRGKEffRV YCRAGFPQFY ERCPRPRPYV CCKTYTCIST 181 CSVFQGRNGC CHA ； 所述 SEQ ID No. 7 (1 MAKFFIALLV LVAVYATEAL PGNGYEGCFN GYNYDCCRRR RPNFCYPSLV KPLPYYYRCV 61 GRRVVYGRCE THLCVTVKGN CGSCSDRCRY TRHSHYYYSS YFYGRYYYRC NRGALNYRSC 121 GLNQSYYPGR GRCGCRENYC ERHNGffQSTV CNGCGSYVFC RYGRPIRYRR CPffSRRHYDC 181 HRHRCVSHCN GCCGHR ； 所述 SEQ ID No. 8 (1 MQKLVFIVVA IVMALASCTS ARKKKPCVES CVGRPDGEYQ ASCTYDCRFF VKCVFGFSFL 61 LKCREGHFYD VDVRDCVKGC PTGPRGILDC YDRPDGHWQH CCYCDLYATR ASRGMFFHRR 121 CEPGGPVffHD DKHKCLffTSG TCPGVHRYYA。
4.管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，其特征在于為管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpA、管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpB、管狀蠕 蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpC或管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 CbpD。
5.如權(quán)利要求4所述的管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，其特征在于， 所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpA的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特征長度為187aa，類型為氨基酸，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpA的 序列如下所示，記為SEQ ID No. 5 (1 MSKLLAALVA LSIAYSVQGC SDSCVGRQNG RCYPSACGPC NYYFKCQRTI VVEQYCRASS 61 YCYLNGRCRP CGDSCERKRD GVYPSVNRAR PYYYQCEAGQ LYYRECQPFQ IFNAffTRKCE 121 CFEGACLHGN GffRSSFCRGK GffRVFCSGGF ARYYRQCPRP RPHVCCHTYT CVSTCTSYYG 181 RGHCCRG ；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpB的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特 征長度為193aa，類型為氨基酸，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpB的 序列如下所示，記為SEQ ID No. 6 (1 MSKLIIALAV LSACIAVQAR GffEGCSQDKC DGRRTGRRYQ SLCAPVSVYY RCRHSRPVYD 61 NCRERNYCVV NGRCCRCOTT CEGKCDGVYP SVNRPRPAYY QCDGGELYYR TCQPFQIFNP 121 WTKQCECYEG SCLHGNGYRA SFCRGKEffRV YCRAGFPQFY ERCPRPRPYV CCKTYTCIST 181 CSVFQGRNGC CHA ；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpC的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特 征長度為196aa，類型為氨基酸，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpC的 序列如下所示，記為SEQ ID No. 7 (1 MAKFFIALLV LVAVYATEAL PGNGYEGCFN GYNYDCCRRR RPNFCYPSLV KPLPYYYRCV 61 GRRVVYGRCE THLCVTVKGN CGSCSDRCRY TRHSHYYYSS YFYGRYYYRC NRGALNYRSC 121 GLNQSYYPGR GRCGCRENYC ERHNGffQSTV CNGCGSYVFC RYGRPIRYRR CPffSRRHYDC 181 HRHRCVSHCN GCCGHR ；所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpD的分子類型為蛋白質(zhì)，序列特 征長度為150aa，類型為氨基酸，所述管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CbpD的 序列如下所示，記為SEQ ID No. 8 [1 MQKLVFIVVA IVMALASCTS ARKKKPCVES CVGRPDGEYQ ASCTYDCRFF VKCVFGFSFL 61 LKCREGHFYD VDVRDCVKGC PTGPRGILDC YDRPDGHWQH CCYCDLYATR ASRGMFFHRR 121 CEPGGPVffHD DKHKCLffTSG TCPGVHRYYA。
6.如權(quán)利要求4所述的管狀蠕蟲Ridgeia piscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的制備方法，其特 征在于包括以下步驟1)管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae RNA的提取；2)管狀蠕蟲Ridgeia piscesae cDNA 反轉(zhuǎn)錄；3)管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的PCR擴增和序列分析；4)管狀蠕蟲Ridgeiapiscesae幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的表達。
全文摘要
管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白及其制備方法，涉及一種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因為cbpA、cbpB、cbpC或cbpD基因。獲得管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的核苷酸序列的方法提取管狀蠕蟲的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以合成序列作為引物，經(jīng)PCR擴增，在昆蟲細胞high5中重組表達，證明cbpA、cbpB、cbpC和cbpD基因編碼的多肽具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。制備時，管狀蠕蟲RNA的提取；管狀蠕蟲cDNA反轉(zhuǎn)錄；管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的PCR擴增和序列分析；管狀蠕蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的表達。
文檔編號C12N15/12GK101979571SQ201010515388
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者徐洵, 邊曉芳, 鄢秀敏, 閆鑫富, 阮靈偉 申請人:國家海洋局第三海洋研究所