專利名稱：一種篩選抗hsv-1藥物的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物篩選領(lǐng)域，具體涉及一種篩選抗HSV-1藥物的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒I型(HSV-1)為有包膜的DNA病毒，是危害人類健康的常見病原體， 且容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染和潛伏感染。HSV-1感染部位廣泛，能引起口唇皰疹、生殖器皰疹、腦 炎、角膜炎等，并與宮頸癌和唇癌有關(guān)。HSV-1具有神經(jīng)毒性，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)、破壞神 經(jīng)細(xì)胞。目前，治療由HSV-1引起的上述疾病的有效藥物主要為阿昔洛韋(ACV)，其吸收差， 且根據(jù)國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心病例報(bào)告顯示，其引起的急性腎功能損害和血尿問題突 出。因此，篩選更多抑制該病毒的藥物非常必要?，F(xiàn)有技術(shù)中公知的主要篩藥體系仍為傳統(tǒng)的動(dòng)物模型篩藥體系和細(xì)胞模型篩藥 體系，存在實(shí)驗(yàn)周期較長，實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜等缺點(diǎn)，難以迅速將潛在藥物篩選出來，不能滿 足藥物研發(fā)初期高通量快速篩選藥物的要求。堿性核酸酶是由HSV-1基因組中UL12基因編碼的，已經(jīng)被報(bào)道有5’ 3’的核酸 外切酶和核酸內(nèi)切酶活性，因其反應(yīng)的最適PH值較高，所以被認(rèn)為是堿性核酸酶。在HSV-1 的復(fù)制中起著重要的作用，有研究證實(shí)堿性核酸酶能正確修復(fù)DNA復(fù)制過程中的斷裂和缺 口，并能使處于復(fù)制狀態(tài)的病毒基因組易于包裝。該編碼基因被敲除后HSV-1突變體復(fù)制 幾乎停止，說明堿性核酸酶為病毒體內(nèi)繁殖所必須。還有實(shí)驗(yàn)證明，在非容納細(xì)胞中產(chǎn)生的 UL12基因組缺陷病毒，由于有異?；蚪M而很難感染新的細(xì)胞。上述研究證明堿性核酸酶 在病毒的復(fù)制及其感染過程中是非常關(guān)鍵的，這為堿性核酸酶成為一種新的抗皰疹病毒藥 物篩選靶點(diǎn)提供了證據(jù)。也就是說，能夠抑制堿性核酸酶活性的物質(zhì)也具有抑制HSV-1的作用，進(jìn)而推測 這些物質(zhì)具有治療由HSV-1引起的各種疾病的作用。因此，篩選治療這些疾病的潛在藥物 可以通過檢測其能否抑制堿性核酸酶活性來實(shí)現(xiàn)。然而，UL12基因片段長，GC含量高，難以通過常規(guī)的PCR方法方便、準(zhǔn)確地獲得全 序列的UL12基因片段，進(jìn)而獲得大量有活性的堿性核酸酶，目前也未見市售品出現(xiàn)，因此 以堿性核酸酶作為篩藥體系關(guān)鍵成分制備快速篩藥系統(tǒng)難以適應(yīng)臨床大量應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了 一種方便快捷地篩選大量抗HSV-1 藥物的方法。因此，本發(fā)明目的之一是提供一種用于篩選抗HSV-1藥物的試劑盒，包含HSV-1堿 性核酸酶、堿性緩沖液、MgCl2和核酸。上述試劑盒內(nèi)各成分濃度優(yōu)選如下HSV_1堿性核酸酶濃度為0. 5 0. 7mg/ml、堿 性緩沖液濃度為40 60mM、MgCl2濃度為2 4mM、核酸濃度為1. 4 1. 6 y g/ml。上述試劑盒內(nèi)各成分濃度進(jìn)一步優(yōu)選如下HSV-1堿性核酸酶濃度為0. 64mg/ml、堿性緩沖液濃度為50mM、MgCl2濃度為3mM和核酸濃度為1. 516 u g/ml。為了克服現(xiàn)有技術(shù)難以方便獲得大量有活性的堿性核酸酶的缺陷，本發(fā)明試劑盒 中HSV-1堿性核酸酶是用如下方法得到的其步驟如下(1)擴(kuò)增目的基因提取HSV-1病毒基因組作為模板，以SEQ ID NO :1 2所示 的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-1的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C 變性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin ；膠回收并純化擴(kuò)增的 UL12基因片段；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶將步驟⑴獲得的UL12基因片段與表達(dá)質(zhì)粒連接， 獲得重組質(zhì)粒；(3)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，涂布在含有適當(dāng)抗生 素的平板上；培養(yǎng)重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子使其生長至對(duì)數(shù)期；加入異丙基2b-D2硫代 半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)；離心收集菌體；(4)變性a，用含有變性劑的洗滌液兩次洗滌步驟(3)得到的菌體；b，冷凍超聲破 碎細(xì)胞，離心收集沉淀；c，用含有不同變性劑的多種洗滌液分別洗滌沉淀，離心，收集沉淀； d，用含有高濃度變性劑的洗滌液超聲洗滌沉淀，得到蛋白溶液；(5)復(fù)性用鹽酸胍濃度逐步減小的復(fù)性液復(fù)性步驟(4)得到的蛋白溶液，獲得活 性蛋白。上述HSV-1堿性核酸酶的方法步驟(1)還優(yōu)選包括如下步驟將T載體與得到的 UL12基因片段連接形成重組T載體，以該重組T載體為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的 核苷酸序列作為引物擴(kuò)增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的HSV-1的UL12基因片段， 擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C 72°C退火延伸2min 30s，31個(gè)循環(huán)， 72°C延伸lOmin ；膠回收并純化擴(kuò)增的UL12基因片段。本方法中退火、變性溫度均優(yōu)選為 68 °C。上述得到HSV-1堿性核酸酶的方法步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒為pET系列質(zhì)粒，優(yōu)選為 pET32a-UL12 或者 pET28a_UL12 質(zhì)粒。上述得到HSV-1堿性核酸酶的方法步驟(3)中大腸桿菌為E. coli BL12菌株或者 為 E. coli Rosetta 菌株。上述得到HSV-1堿性核酸酶的方法中步驟⑷采用的變性方法為用洗滌液A兩次洗滌步驟(3)獲得的菌體；冷凍超聲破碎菌體，離心收集沉淀；用 洗滌液B、C、D依次洗滌、離心、收集沉淀；用洗滌液E溶解沉淀，獲得蛋白溶液；所述的洗滌液A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl 的溶液；洗 滌液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl、1 % NP-40 (乳化劑 NP40 系列) 的溶液；洗滌液 C:包含 50mMTris-HCl[pH8.0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液D 包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmM NaCl、0. 5% TritonX-100、1. 5M鹽酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液E 包含100mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM3 -巰基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和 4 6M 鹽酸胍的溶液。洗滌液E中鹽酸胍濃度優(yōu)選為4M。上述得到HSV-1堿性核酸酶的方法步驟(5)中的復(fù)性液為包含 50mMTris-HCl[pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘油、1 %甘氨酸和鹽酸胍濃度遞減的溶液，鹽酸胍濃度依次為4M、3M、2M、1M和0M。本發(fā)明試劑盒中堿性緩沖液為Tris-HCl緩沖液，核酸為環(huán)狀DNA或者線性DNA， 環(huán)狀DNA可以是pcDNA3. 0質(zhì)粒，線性DNA可以是單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段 UL12。本發(fā)明試劑盒中堿性緩沖液的pH值優(yōu)選為8. 5 9. 5，進(jìn)一步優(yōu)選為9. 0。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種用上述試劑盒篩選抗HSV-1藥物的方法，往上述試 劑盒中加入待測藥物，反應(yīng)5 60分鐘后，檢測所述試劑盒內(nèi)的核酸降解程度。上述待測 藥物濃度優(yōu)選為150 1200ii g/ml。本發(fā)明的有益效果克服傳統(tǒng)篩藥體系的缺點(diǎn)，操作簡單，成本低，可用于快速高 通量篩選抗HSV-1的潛在藥物。


圖1實(shí)施例1步驟(1)擴(kuò)增UL12基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道M:DNA Marker DL2000 ；泳道 1 :UL12 基因。圖2進(jìn)一步擴(kuò)增UL12基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為DL2，000DNA Marker,作為標(biāo)記；泳道2為用EcoR I/Hind III切割純化重組pMD19T載體；泳道3為 用 EcoR I/Hind III 切割純化 pET28a_UL12 ；泳道 4 是空載質(zhì)粒 pET28a(+)，用 EcoR 1/ Hind III處理后作為對(duì)照；泳道5為沒有酶切處理的pET28a-UL12 ；泳道6為人-Hind III digest DNA Marker,作為標(biāo)記。圖3進(jìn)一步擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段送大連 寶公司測序的彩色波形圖。圖3a中第259 1個(gè)堿基對(duì)應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸 序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第1 259個(gè)堿基，且為互補(bǔ)堿基； 圖3b中第663 1個(gè)堿基對(duì)應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示的 HSV-117毒株基因序列中第178 835個(gè)堿基，且為互補(bǔ)堿基；圖3c中1 703個(gè)堿基對(duì) 應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第 774 1476個(gè)堿基；圖3d中第1 436個(gè)堿基對(duì)應(yīng)已在GenBank上公布的核苷酸序列如 SEQ ID NO 4所示的HSV-117毒株基因序列中第1447 1881個(gè)堿基。圖4進(jìn)一步擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段序列與 核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的標(biāo)準(zhǔn)國際株序列對(duì)比結(jié)果。每一小組為3列，第一列為 GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ IDN0 4所示的HSV-117毒株基因序列的UL12基因序 列，即國際標(biāo)準(zhǔn)UL12基因序列，第二列為本發(fā)明擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所 示的UL12基因序列，即實(shí)測UL12基因序列，第三列為第一列和第二列的共有序列圖5不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響結(jié)果圖。泳道3至泳道8對(duì)應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)間為 10h，8h，6h，4h，3h，0h。泳道2和泳道10作為對(duì)照，未添加IPTG，表達(dá)時(shí)間10h。蛋白質(zhì)分 子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，在泳道1和泳道9，作為標(biāo)記。圖6不同洗滌液變性處理后，堿性核酸酶存在形式鑒定圖。泳道1是用變性劑A 和變性劑C處理后的上清液；泳道2是經(jīng)過變性劑A和變性劑B處理后的上清液；泳道3是 用變性劑A、B、C、D和E，且變性劑E中鹽酸胍的濃度為4M ；泳道4是用變性劑A、B、C、D和 E，且變性劑E中鹽酸胍的濃度為6M ；泳道5是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)；泳道6是經(jīng)過變性劑A和變性劑B處理后的沉淀；泳道7是用變性劑A和變性劑C處理后的沉淀。圖7堿性核酸酶活力測定的結(jié)果圖。E. coli BL21和E. coli Rosetta產(chǎn)生的重 組融合蛋白AN對(duì)pcDNA3. 0質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)的結(jié)果。泳道M 入Hind III digest DNA Marker ；泳道1 :pcDNA3. 0對(duì)照；E. coli Rosetta表達(dá)的堿性核酸酶與pcDNA3. 0反應(yīng)于 37°C孵育 5min (泳道 2)，20min (泳道 4)，40min (泳道 6)，60min (泳道 8) ；E. coli BL21 表 達(dá)的堿性核酸酶與pcDNA3. 0反應(yīng)于37°C孵育5min (泳道3)，20min (泳道5)，40min (泳道 7)，60min (泳道 9)。圖85種藥物檢測結(jié)果圖。大豆苷元位于泳道1，黃芪總苷位于泳道2，綠原酸位于 泳道3，苦參堿位于泳道4，氧化苦參堿位于泳道5，泳道6沒有添加試劑盒反應(yīng)體系，泳道7 僅有DNA底物作為對(duì)照，泳道8為人-HindiII digest DNA Marker,作為標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料和儀器以下實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料和儀器，除特別說明，均為市售購買。(1)材料標(biāo)準(zhǔn)單純皰疹病毒I型(HSV-1) SM44株，購自中國生物制品檢定所；Vero細(xì)胞購于四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)生部移植工程與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；E.coli BL12(DE3)plysS 菌株、E. coli Rosetta(DE3)、原核表達(dá)載體 pET32a(+)、 pET28a (+)，購自 Novagen 公司；高保真Taq 酶、T4 DNA 連接酶、DL2, 000DNA Marker、A -Hind III digestDNAMarker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII、E. coli JM109 菌株、pMD19-T 載體、dNTPs、LA Taq 酶、GC buffer, EDTA、NP-40、TritonX-100，購于大連 TaKaRa 公司；核酸測序由大連TaKaRa公司完成；異丙基硫代-0 -D半乳糖苷(IPTG)、鹽酸胍，為美國AMRESC0產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自美國OMEGA公司；核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物，由上海Sangon Biotech公司合成；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司、LB培養(yǎng)基，購自英國0X0ID公司；XTT，購自 Bio Basic ING 公司苯甲基磺酰氟(PMSF)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)，購自Sigma公司；黃氏總苷、苦參堿、氧化苦參堿、大豆總苷、牛蒡子苷，購自四川省維克奇生物技術(shù) 有限公司；阿昔洛韋，購于武漢華龍生物制藥有限公司。ddH20、MgCl2、乙醇、PBS 緩沖液、Tris-HCl 緩沖液、NaCl、甘油、甘氨酸、SDS-PAGE 和瓊脂糖凝膠電泳的各種常規(guī)試劑。(2)儀器PCR儀，購自美國Thermo公司；紫外可見分光光度計(jì)，購自美國Bio-Rad公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱為青島海爾的產(chǎn)品；
超濾管，購自美國MILLIP0RE公司；離心機(jī)，購自德國Eppendorf公司；超聲細(xì)胞破碎儀。實(shí)施例1獲得HSV-1堿性核酸酶⑴擴(kuò)增UL12基因片段提取病毒基因組用DMEM培養(yǎng)vero細(xì)胞，接種HSV-1待細(xì)胞病變，即CPE達(dá)到 +++ ++++，收獲細(xì)胞，用病毒DNA抽提試劑盒抽提HSV-1全基因組；引物設(shè)計(jì)依據(jù)GenBank公布的UL12基因片段的核苷酸序列，用PRIMER5. 0軟件 設(shè)計(jì)引物，引物序列如SEQ ID NO :1 2所示；擴(kuò)增目的基因以提取得到的HSV-1全基因組為模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物對(duì)為引物，擴(kuò)增目的基因UL12基因片段反應(yīng)體1 模板1 U 1核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示引物1 P 1核苷酸序列如SEQ IDNO 2所示引物1 P 1GC buffer12. 5u 1dNTP2u 1LAtaq 酶0. 25 u 1ddH207. 25 u 1反應(yīng)條件96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68°C退火延伸2min30s 31個(gè)循環(huán)， 72°C延伸 lOmin。產(chǎn)物回收0. 8%常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn) 物。凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的DNA片段為1881bp，與已知UL12基因片段大小相 同。(結(jié)果見圖1)(2)進(jìn)一步擴(kuò)增UL12基因片段制備模板在T4DNA連接酶作用下將步驟(1)得到的UL12基因片段與pMD_19T載 體連接，構(gòu)建成重組PMD19T載體。擴(kuò)增目的基因以步驟(1)得到的連接有UL12基因片段的重組pMD19T載體為模
板，以核苷酸序列如SEQ IDN01 --2所示引物對(duì)為引物擴(kuò)增目的基因UL12基因片段
反應(yīng)體系
模板1 u 1
核苷酸序列如SEQIDNO:1所示引物1 u 1
核苷酸序列如SEQIDNO:2所示引物1 U 1
GC buffer12. 5u 1
dNTP2u 1
LAtaq 酶0. 25u 1
ddH207. 25u 1
反應(yīng)條件96 °C預(yù)變性3min，95 °C變性40s，68 °C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，
872°C延伸 lOmin。產(chǎn)物回收0. 8%常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，以膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn) 物。結(jié)果檢測將膠回收得到的UL12基因片段與pMD-19T載體連接，構(gòu)建成重組 PMD19T載體，瓊脂糖凝膠電泳并測序檢驗(yàn)擴(kuò)增得到的UL12基因片段。結(jié)果如圖2、圖3和圖4。圖2顯示凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的DNA片段為 1881bp，與已知UL12基因片段大小相同。圖3為核苷酸序列測序的彩色波形圖，證明通過本 發(fā)明方法擴(kuò)增得到了核苷酸序列如SEQ IDN0:3所示的UL12基因片段。圖4為本發(fā)明擴(kuò)增 得到的核苷酸序列如SEQID NO 3所示的UL12基因片段序列與核苷酸序列如SEQ ID NO 4 所示的標(biāo)準(zhǔn)國際株UL12基因片段序列對(duì)比結(jié)果，從圖4可知，核苷酸序列如SEQ ID NO :3所 示的UL12實(shí)測序列核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的UL12標(biāo)準(zhǔn)國際株序列=1866/1881 =99. 20%，也就是說，本發(fā)明擴(kuò)增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的UL12基因片 段與核苷酸序列如SEQID NO :4所示的標(biāo)準(zhǔn)國際株序列的同源性為99. 20%，證明本發(fā)明準(zhǔn) 確地?cái)U(kuò)增了 UL12基因片段。(3)堿性核酸酶的表達(dá)1)重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建將步驟(1)或者步驟(2)得到的UL12基因片段在EcoRI、HindHI內(nèi)切酶作用下 與pET28a(+)質(zhì)粒或者pET32a(+)連接形成pET28a_UL 12重組表達(dá)質(zhì)?；蛘遬ET32a_UL12 重組表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，控制堿性核酸酶的表達(dá)，并包含 有2個(gè)His標(biāo)簽，可以用來純化蛋白。2)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(1)得到的pET28a_UL12重組表達(dá)質(zhì)粒通過CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)于含有50 u g/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)板上，220r/min振搖過夜；挑取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌克??；將大腸桿菌克隆直接接種到50ml含有50 u g/ml卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C 搖瓶培養(yǎng)，直到0D6(1(1值為0. 4 0. 6 ；加入終濃度為0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C搖瓶1 10小時(shí)后，離心收集菌體。3)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(1)得到的pET32a_UL12重組表達(dá)質(zhì)粒通過CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至E. coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)于含有30 u g/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)板上，220r/min振搖過 夜培養(yǎng)；挑取獲得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌克?。粚⒋竽c桿菌克隆直接接種到50ml含有30 u g/ml氨芐青霉素和34 u g/ml的氯霉 素的LB培養(yǎng)基中，在37 °C搖瓶培養(yǎng)，直到0D600值為0. 4 0. 6 ；加入終濃度為0. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37°C搖瓶1 10h后，離心收集菌體。圖5的電泳圖顯示，泳道3 8中目標(biāo)蛋白條帶依次減弱，也就是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的 減少，其表達(dá)蛋白的含量逐漸降低。因此，確定最優(yōu)的誘導(dǎo)時(shí)間為10h。(4)堿性核酸酶的變性、復(fù)性和活力測定(1)變性
將步驟3中(2)或者(3)所得菌體用5ml洗滌液A(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl)洗兩次；4°C下，收集細(xì)菌在冰浴上經(jīng)過4min超聲處理，破碎細(xì)胞，得到菌液；4°C下，用 5ml 洗滌液 B(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmMNaClU % NP-40, 即乳化劑NP40系列)的超聲洗滌菌液；4°C下，12000rpm 離心 15min，收集沉淀；4 °C 下，用 5ml 洗滌液 C(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、100mMNaCl、3 % TritonX-lOOUmM PMSF，即甲基磺酰氟)的洗滌液C超聲洗滌沉淀；12000rpm 離心 15min，收集沉淀；4°C 下，用 5ml 洗滌液 D(50mM Tris-HCl [pH8. 0] ,2mM EDTA、100mMNaCl、0. 5 % TritonX-lOOU. 5M鹽酸胍和ImM PMSF)超聲洗滌沉淀；12000rpm 離心 15min，收集沉淀；用5ml 洗滌液 E (4M 或者 6M 鹽酸胍、lOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mMEDTA、lOOmM NaClUOmM 3巰基乙醇、和ImM PMSF)洗滌沉淀；收集上清在-80°C保存，蛋白質(zhì)濃度用Bio-Rad分光光度計(jì)進(jìn)行測量。變性最優(yōu)條件如圖6所示，當(dāng)洗滌液E中的鹽酸胍濃度為4M時(shí)，處理后的沉淀幾 乎沒有目標(biāo)蛋白，目標(biāo)蛋白溶于洗滌液，非常有利于復(fù)性。(2)復(fù)性取lml 變性得到的蛋白溶液，用復(fù)性液(50mMTris-HCl[pH8. 0]、2mMEDTA、50mM NaCl、5%甘油、甘氨酸和濃度遞減的鹽酸胍，鹽酸胍的濃度依次為4M、3M、2M、1M和 0M)將其稀釋到0. 1-lmg/ml，在透析袋中復(fù)性，復(fù)性時(shí)間為24h，最后用超濾管(4500rpm， 10min,4°C )離心收集復(fù)性蛋白溶液，放置-20°C冰箱保存。(3)活力檢測取復(fù)性得到的復(fù)性蛋白溶液稀釋為0. 12mg/ml，用pcDNA3. 0質(zhì)粒或者線性UL12基 因片段作為底物，進(jìn)行酶活性測定。反應(yīng)體系為6. 5u 1 200mM Tris-HCl [pH 9. 0]1. 5u 1 50mM MgCl22 ill pcDNA3. 0 質(zhì)粒15 ill ddH2010 ill復(fù)性蛋白溶液反應(yīng)條件37°C，5/20/40/60min。反應(yīng)相應(yīng)時(shí)間后取出5iU反應(yīng)液，用liil 6 X Loading Buffer終止反應(yīng)，做 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。其中環(huán)狀DNA用于檢測藥物對(duì)單純皰疹病毒I型堿性核酸內(nèi)切酶的抑制作用，線 性DNA用于檢測藥物對(duì)單純皰疹病毒I型堿性核酸外切酶的抑制作用。結(jié)果如圖7所示，本發(fā)明得到的堿性核酸酶可以有效的降解核酸，酶活性比較高， 且反應(yīng)時(shí)間為60min時(shí)，降解效果最好。實(shí)施例2篩選抗HSV-1藥物及驗(yàn)證試驗(yàn)
(1)篩選抑制堿性核酸酶的藥物制備待測藥物取每個(gè)待檢測的藥物在20%乙醇中溶解，形成不同濃度溶液， 綠原酸300iig/ml、苦參堿1.2mg/ml、黃芩苷1. 2mg/ml、氧化苦參堿1. 2mg/ml、大豆苷元 300y g/ml。制備篩藥體系取實(shí)施例1獲得的堿性核酸酶制備成為0. 64mg/ml的溶液；制備 50mM Tris-HCl 緩沖液[pH 9. 0]；制備 3mM MgCl2溶液；制備 1. 516 u g/ml pcDNA3. 0溶液作 為底物。各成分的體積分別為堿性核酸酶溶液:12u 1 ；Tris-HCl緩沖液6. 25 u 1 ；MgCl2 溶液1. 5 ill ；pcDNA3. 0 溶液1. 0 ill。篩選取4. OiU待測藥物的溶液，與篩藥體系中Tris-HCl緩沖液、MgCl2溶液、 pcDNA3. 0溶液混合，加入堿性核酸酶溶液，于37°C孵育45min。在0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳 中檢測pcDNA3. 0降解程度。結(jié)果如圖8所示，黃芩苷、苦參堿、氧化苦參堿和大豆總苷可以有效抑制堿性核酸 酶活性。(2)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)藥物的細(xì)胞毒件試騎將Vero細(xì)胞接種到96孔板，用RPMI 1640生長液培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層，將每一 個(gè)待檢藥物(綠原酸、苦參堿、黃芩苷、氧化苦參堿、大豆苷元、牛蒡子苷)用培養(yǎng)基配置成 1200 u g/ml的母液，在1. 5ml EP管中倍比稀釋3次，每一次稀釋保留1000 yl在1. 5mlEP 管內(nèi)，最小的稀釋倍數(shù)為1 8，每種藥物有4個(gè)不同濃度；96孔板分為8個(gè)區(qū)域，6個(gè)區(qū)域用于檢測6種藥物，剩余兩個(gè)區(qū)域?yàn)榭瞻讓?duì)照和陰 性對(duì)照。每個(gè)區(qū)域12個(gè)孔，每3個(gè)孔濃度相同。將96孔板中的培養(yǎng)液倒掉，加入相應(yīng)藥物200 u 1，在37°C，C02環(huán)境中培養(yǎng)3天。每孔加入20111的乂17溶液(制備方法取21^ XTT溶于無菌水中，終濃度為 lmg/ml，再加入20 u 1 (0. lmol/L的PMS溶液)，37°C、C02環(huán)境孵育6h后，用酶標(biāo)儀(波長 為450nm)測定吸光度0D值，測量重復(fù)三次。毒性百分比通過與陰性對(duì)照比較得到。按照 Reed-Muench方法計(jì)算得到最大無毒濃度(MNTC)。結(jié)果如表1所示表權(quán)利要求
一種用于篩選抗單純皰疹病毒I型藥物的試劑盒，其特征在于包含獨(dú)立包裝的單純皰疹病毒I型堿性核酸酶、堿性緩沖液、MgCl2和核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述單純皰疹病毒I型堿性核酸酶濃 度為0. 5 0. 7mg/ml、堿性緩沖液濃度為40 60mM、MgCl2濃度為2 4mM、核酸濃度為 1. 4 1. 6 y g/ml0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述單純皰疹病毒I型堿性核酸酶濃 度為0. 64mg/ml、堿性緩沖液濃度為50mM、MgCl2濃度為3mM、核酸濃度為1. 516ug/ml0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述單純皰疹病毒I型堿性核酸酶是 以如下方法得到的(1)擴(kuò)增目的基因提取單純皰疹病毒I型病毒基因組作為模板，以SEQID NO :1 2 所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-1的UL12基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?6°C預(yù)變性3min， 95°C變性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin ；膠回收擴(kuò)增的 UL12基因片段；(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒將獲得的UL12基因片段與表達(dá)質(zhì)粒連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；(3)誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(2)獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；培養(yǎng)含有重組表達(dá)質(zhì)粒 的大腸桿菌使其復(fù)制至處于對(duì)數(shù)期；加入異丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)；離心收 集菌體；(4)變性破碎步驟(3)獲得的菌體，離心收集沉淀，用包含變性劑的洗滌液洗滌沉淀， 獲得蛋白溶液；(5)復(fù)性用復(fù)性液復(fù)性步驟(4)獲得的蛋白溶液，獲得活性蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸 酶的方法步驟(1)擴(kuò)增目的基因的方法為提取單純皰疹病毒I型病毒基因組作為模板， 以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物擴(kuò)增HSV-1的UL12基因片段，擴(kuò)增程序 為96°C預(yù)變性3min，95°C變性40s，68 °C 72°C退火延伸2min30s，31個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin ；膠回收擴(kuò)增的UL12基因片段；將擴(kuò)增得到的UL12基因片段與T載體連接形成重組 T載體，再以該重組T載體為模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作為引物進(jìn)一步 擴(kuò)增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12目的基因片段，擴(kuò)增條件不變。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸 酶的方法中退火、變性溫度為68°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸 酶的方法步驟(2)中表達(dá)質(zhì)粒為pET系列質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸酶 的方法中表達(dá)質(zhì)粒為pET32a-UL12或者pET28a_UL12質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸 酶的方法步驟(3)中大腸桿菌為E. coli BL12菌株或者為E. coli Rosetta菌株。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸 酶的方法中步驟(4)采用的變性方法為用洗滌液A兩次洗滌步驟(3)獲得的菌體；冷凍超聲破碎菌體，離心收集沉淀；用洗滌 液B、C、D依次洗滌、離心、收集沉淀；用洗滌液E溶解沉淀，獲得蛋白溶液；所述的洗滌液 A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl 的溶液；洗滌 液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl、1 % NP_40(乳化劑 NP40 系列) 的溶液；洗滌液 C:包含 50mMTris-HCl[pH8.0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液D 包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmM NaCl.O. 5% TritonX-100、1. 5M鹽酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗滌液E 包含lOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaClUOmM 3 -巰基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和 4 6M 鹽酸胍的溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述洗滌液E中鹽酸胍濃度為4M。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述得到單純皰疹病毒I型堿性核酸 酶的方法步驟(5)中的復(fù)性液為包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘 油、甘氨酸和鹽酸胍濃度遞減的溶液，鹽酸胍濃度依次為4M、3M、2M、1M和0M。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述堿性緩沖液為Tris-HCl緩沖液， 核酸為環(huán)狀DNA或者線性DNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，所述的環(huán)狀DNA為pcDNA3.0質(zhì)粒，線性DNA為編 碼單純皰疹病毒I型堿性核酸酶基因片段UL12。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述堿性緩沖液的PH值為8.5 9. 5。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于所述堿性緩沖液的pH值為9.0。
17.一種利用權(quán)利要求1所述的試劑盒篩選抗單純皰疹病毒I型藥物的方法，其特征在 于將待測藥物與所述試劑盒中的試劑混合，反應(yīng)5 60分鐘，檢測核酸降解程度。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的篩選抗單純皰疹病毒I型藥物的方法，其特征在于所述 待測藥物濃度為150 u g/ml-1200 u g/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于篩選抗單純皰疹病毒I型藥物的試劑盒，其包含了單純皰疹病毒I型堿性核酸酶、堿性緩沖液、MgCl2和核酸。還提供了一種用于篩選抗單純皰疹病毒I型藥物的方法，步驟為在所述試劑盒中加入待測藥物，反應(yīng)5～60分鐘后，檢測核酸降解程度。本發(fā)明提供的篩選抗單純皰疹病毒I型藥物的方法克服了傳統(tǒng)篩藥方法復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速、簡便、低成本篩藥。
文檔編號(hào)C12N9/22GK101974613SQ201010508269
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者何婷, 曾南, 李學(xué)東, 陳恬, 陳洪宇 申請(qǐng)人:成都醫(yī)學(xué)院