專利名稱：編碼glb0基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼glbO基因的核苷酸序列，及用棒狀細(xì)菌(coryneform bacteria)經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中棒狀細(xì)菌中g(shù)lbO基因是增強(qiáng)的。
現(xiàn)有技術(shù)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，用于人的藥物及制藥工業(yè)，但尤為用于動物營養(yǎng)。
已知L-氨基酸可通過棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于L-氨基酸的極其重要性，不斷進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵技術(shù)，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分，如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形成的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法，可獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌菌株改良，其通過擴(kuò)增各個(gè)L-賴氨酸生物合成基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。此方面的綜述文章見Kinoshita(“谷氨酸細(xì)菌”，工業(yè)微生物的生物學(xué)，Demain和Soloman編輯，BenjaminCummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(生物技術(shù)2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技術(shù)的關(guān)鍵回顧15，73-103(1995))，及Sahm等(紐約科學(xué)協(xié)會年報(bào)782，25-39(1996))。
發(fā)明目的本發(fā)明人目的在于為改良L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)而提供新措施。
發(fā)明詳述下文提及的L-氨基酸或氨基酸指選自如下一組的一或多種氨基酸，包括其鹽，所述的組包括L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，和L-精氨酸。尤為優(yōu)選L-賴氨酸。
當(dāng)下文提及L-賴氨酸或賴氨酸時(shí)，不僅指堿，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了分離自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
其中所述多肽優(yōu)選呈現(xiàn)類血紅蛋白活性。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其優(yōu)選是在棒狀細(xì)菌中能復(fù)制的重組DNA。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，其是一種RNA。
本發(fā)明還提供了一種如上述的多核苷酸，其中其優(yōu)選包含一種能復(fù)制的DNA，所述DNA含有(i)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)匹配于(i)序列的至少一個(gè)序列，或
(iii)與互補(bǔ)于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(iv)(i)中有功能的中性有義突變。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明多核苷酸的一種載體，和作為宿主細(xì)胞的棒狀細(xì)菌，其含有所述載體或其glbO基因是增強(qiáng)的。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其基本上含有一多核苷酸序列，其可通過用含有所述多核苷酸序列的相應(yīng)于SEQ ID NO1或其片段的探針雜交相應(yīng)的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述文庫包括具有相應(yīng)于SEQ ID NO1的多核苷酸序列的完整基因。
含有本發(fā)明序列的多核苷酸序列適用作RNA，cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼類血紅蛋白(haemoglobin-like protein，glbO)的全長cDNA，以及分離與類血紅蛋白的基因具有高度相似性的cDNA或基因。
含有本發(fā)明序列的多核苷酸序列還適用作引物以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼類血紅蛋白的DNA或基因。
作為探針或引物的所述寡核苷酸包括至少30個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)，特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。具有至少40個(gè)或50個(gè)核苷酸的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其中RNA或DNA可被修飾或未被修飾。
“多肽”應(yīng)理解為包括經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特別是具有類血紅蛋白活性的多肽，以及與SEQ ID NO2的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ ID NO2的多肽至少80％，特別是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-賴氨基酸的發(fā)酵方法，在該棒狀細(xì)菌中編碼glbO基因的核苷酸序列被增強(qiáng)，尤其是被過表達(dá)。
文中術(shù)語“增強(qiáng)”是指微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或用強(qiáng)啟動子或編碼高活性相應(yīng)酶的基因，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸。所述微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬，在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
棒桿菌屬特別是谷氨酸棒桿菌的合適菌株，例如是已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC 17965黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020和從中獲得的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體或菌株，如谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463
谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5715。
谷氨酸棒桿菌的編碼類血紅蛋白的新glbO基因得以分離。
為分離谷氨酸棒桿菌的glbO基因或其它基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(VerlagChemie，Weinhein，德國，1990)，或Sambrook等所著手冊分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。一個(gè)熟知的基因文庫是由Kohara等(細(xì)胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的大腸桿菌K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學(xué)，252，255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCosI(Wahl等，1987，美國科學(xué)院院報(bào)84，2160-2164)，在大腸桿菌K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。
Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326，1992)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。
使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因19259～268)也可在大腸桿菌產(chǎn)生谷氨酸棒桿菌的基因文庫。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個(gè)例子是菌株DH5αMCR，如Grant等(美國科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645～4649)所述。借助于粘?？寺〉拈LDNA片段隨后可用適于測序的通用載體亞克隆并測序，如Sanger等(美國科學(xué)院院報(bào)745463-5467，1977)所述。
以此方式獲得的谷氨酸棒桿菌的編碼glbO基因的新DNA序列如SEQ ID NO1所示，其是本發(fā)明的一部分。用前述方法從此DNA序列中也已推導(dǎo)出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得glbO基因產(chǎn)物的氨基酸序列在SEQ ID NO2示出。
通過遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生自SEQ ID NO1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。蛋白質(zhì)中氨基酸的保守取代，如用丙氨酸取代甘氨酸，或用谷氨酸取代天冬氨酸，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)活性的根本改變，即是中性的。另外已知蛋白質(zhì)N和/或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至穩(wěn)定其功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169751-757(1987))，O’Regan等(基因77237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學(xué)3240-247(1994))，Hochuli等(生物/技術(shù)61321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學(xué)的教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ ID NO1的氨基酸序列和編碼這些氨基酸序列的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15個(gè)核苷酸的長度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)，以及Liebl等(國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志(1991)41255～260)。本領(lǐng)域技術(shù)人員用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的指導(dǎo)參見Gait的手冊寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，海德堡，德國，1994)。
發(fā)現(xiàn)在glbO基因過表達(dá)后，棒狀細(xì)菌以改良方式生產(chǎn)氨基酸，尤其L-賴氨酸。
為獲得過表達(dá)，可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以同樣方式作用。通過可誘導(dǎo)啟動子，在L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增強(qiáng)表達(dá)也是可能的。延長mRNA壽命的措施也可改良表達(dá)。另外，通過防止酶蛋白的降解也可提高酶活性。基因或基因構(gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴(kuò)增?；蛘?，通過改變營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，EP 0 472 869，US4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))，Reischeid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學(xué)綜述60512-538(1996)及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，本發(fā)明的glbO基因已借助于質(zhì)粒被過表達(dá)。
適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是那些在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒。許多已知質(zhì)粒載體例，如pZ1(Menkel等，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(1989)64，549-554)，pEKEx1(Eikamanns等，基因102，93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107，69-74，(1991))，是基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519，pBL1或pGA1的。其它質(zhì)粒載體，例如那些基于pCG4(US-A 4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)信息66，119-124(1990))，或pAG1(US-A 5,158,891)的質(zhì)粒載體，可以相同方式使用。
其它適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體是那些可以用來通過整合入染色體中而進(jìn)行基因擴(kuò)增的載體，例如Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))所述用于復(fù)制或擴(kuò)增hom-thrB操縱子的質(zhì)粒載體。在這種方法中，將所述完整基因克隆入一個(gè)質(zhì)粒載體中，所述載體能在宿主中復(fù)制(典型是大腸桿菌)，但在谷氨酸棒桿菌中不能復(fù)制?？商峒暗妮d體，例如是，pSUP301(Simon等，生物/技術(shù)1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美國)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物的化學(xué)雜志26932678-84；US-A 5487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，荷蘭；Bernard等，分子生物學(xué)雜志，234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志1734510-4516)。然后通過接合或轉(zhuǎn)化，將含有被擴(kuò)增的基因的質(zhì)粒載體移至所需谷氨酸棒桿菌菌株中。接合方法例如Schafer等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，756-759(1994))所述。轉(zhuǎn)化方法例如Thierbach等，(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技術(shù)7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物學(xué)通信123，343-347(1994))所述。在通過“交換”同源重組后，所得菌株含有至少兩個(gè)拷貝的所述基因。
本發(fā)明因此還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-賴氨酸的方法，其中使用用一種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的一個(gè)菌株，而且所述質(zhì)粒載體攜帶編碼類血紅蛋白的基因的核苷酸序列。
另外，不僅擴(kuò)增glbO基因，而且所需L-氨基酸的生物合成途徑的基因，如特定生物合成途徑，糖酵解，檸檬酸循環(huán)或氨基酸輸出的一或多種酶的過表達(dá)，對氨基酸尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)可以是有益的。
為生產(chǎn)L-賴氨酸，例如，除了增強(qiáng)glbO基因之外，還可以同時(shí)增強(qiáng)尤其過表達(dá)一或多個(gè)選自以下一組的基因·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0 197335)·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)·編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)·編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)
·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細(xì)菌學(xué)雜志174，6076-6086)·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)。
除擴(kuò)增glbO基因之外，同時(shí)弱化尤其降低以下基因表達(dá)對氨基酸尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，和/或·編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE199 51 975.79)。
除過表達(dá)glbO基因之外，抑制非所需的二級反應(yīng)對L-氨基酸，特別是L-賴氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦英國，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)或非連續(xù)通過分批法，或補(bǔ)料分批法或重復(fù)補(bǔ)料分批法培養(yǎng)，以生產(chǎn)氨基酸尤其L-賴氨酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術(shù)學(xué)1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須充分符合特殊菌株的要求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細(xì)菌學(xué)會的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊”(華盛頓D.C..USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪，如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇，如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機(jī)化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當(dāng)補(bǔ)加。
可以適當(dāng)加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值?？古菽瓌├缰舅峋垡叶减タ捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-賴氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍內(nèi)達(dá)到。
本發(fā)明因此提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)將生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌發(fā)酵，該細(xì)菌中至少編碼類血紅蛋白的glbO基因被增強(qiáng)，尤其是被過表達(dá)，b)積累培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的L-氨基酸，c)分離所述L-氨基酸。
L-賴氨酸可以通過陰離子交換層析，隨后茚三酮衍生進(jìn)行分析，如Spackman等(分析化學(xué)30，(1958)，1190)所述。
本發(fā)明的目的是通過發(fā)酵方法用于生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳細(xì)闡述。實(shí)施例1產(chǎn)生谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸烊鏣auch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編號27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編號1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Joua，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編號251301)的粘粒載體Super Cosl(Wahl等，(1987)美國科學(xué)院院報(bào)842160-2164)的DNA用限制性內(nèi)切酶XbaI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI編號27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。
粘粒DNA然后用限制性的內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編號27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶。編號27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編號200217)包裝進(jìn)噬菌體中。
將細(xì)菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液混合而感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒文庫的感染和滴定，細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox.1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。實(shí)施例2glbO基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導(dǎo)分離各個(gè)菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau 3AI，編號27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酶酶(Roche分子生物化學(xué)，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編號1758250)將DNA片段去磷酸化。經(jīng)凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。
將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech，F(xiàn)reiburg，德國)孵育過夜。然后將連接混合物電穿孔進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學(xué)院院報(bào)874645-4649)(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)，并在含有50μg/ml zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。
重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進(jìn)行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學(xué)院院報(bào)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)。在購自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism 377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(29∶1)(產(chǎn)品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中，進(jìn)行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始序列數(shù)據(jù)然后用Staden軟件包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個(gè)序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助編碼區(qū)分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，對該核苷酸序列的分析顯示一393堿基對的開放閱讀框架，其被稱為glbO基因。glbO基因編碼一個(gè)131個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。實(shí)施例3制備增強(qiáng)谷氨酸棒桿菌中g(shù)lbO基因的穿梭載體pEC-K18mob2glbOexp3.1大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-K18mob2的構(gòu)建根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體。此載體含有質(zhì)粒pGA1的包括復(fù)制效應(yīng)子per的復(fù)制區(qū)rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，細(xì)菌學(xué)雜志179，1525-1532(1997))，具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5的aph(3’)-IIa基因(Beck等，(1982)，基因19，327-336)，質(zhì)粒pMB1的復(fù)制區(qū)oriV(Sutcliffe，冷泉港關(guān)于定量生物學(xué)的座談會43，77-90(1979))，包括lac啟動子和一個(gè)多克隆位點(diǎn)(mcs)的lacZα基因片段(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))和質(zhì)粒RP4的mob區(qū)域(Simon等，生物/技術(shù)1784-791(1983))。然后將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆。實(shí)用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，美國華盛頓DC)。
通過將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于已經(jīng)補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，N.Y.)。使用Qiagen的QIAprepSpin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII酶切，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)鑒定。所得質(zhì)粒稱為pEC-K18mob2，并示于

圖1。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2000年1月20日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德國)谷氨酸棒桿菌菌株DSM 5715/pEC-K18mob2，保藏號DSM 132453.2大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-K18mob2中g(shù)lbO的克隆所用載體是實(shí)施例3.1中所述的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-K18mob2。此質(zhì)粒的DNA用限制性內(nèi)切酶Ecl136II充分酶切，然后用蝦堿性磷酸酶(Roche診斷試劑GmbH，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，產(chǎn)品號1758250)去磷酸化。
使用Eikmanns等所述方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA(微生物學(xué)1401817-1828(1994))?；趯?shí)施例2中獲得的谷氨酸棒桿菌glbO基因的序列，選擇以下寡核苷酸進(jìn)行PCRglb-exp1，SEQ ID NO3所示，5’GGT CGG TGA GAT AAT CAG 3’glb-exp2，SEQ ID NO4所示，5’TGG CAG AAG TTA AGC GTG 3’通過ARK科學(xué)公司GmbH生物系統(tǒng)(Darmstadt，德國)合成所述引物，而且通過Innis等所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR反應(yīng)(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)，使用得自Roche DiagnosticsGmbH的Pwo聚合酶(德國曼海姆)。通過聚合酶鏈反應(yīng)，所述引物使攜帶glbO基因的一個(gè)936kb的DNA片段得以擴(kuò)增。
將以此方式獲得的glbO片段與制備的pEC-K18mob2載體混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4 DNA連接酶，編號27-0870-04)處理此混合物。將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方法，第一卷，IRL出版社，Oxford，華盛頓DC，美國)。通過在含25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)1190)上鋪板轉(zhuǎn)化混合物，選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在37℃孵育過夜后，選擇重組單個(gè)克隆。根據(jù)廠商指導(dǎo)，用Qiaprep Spin微量制備試劑盒〔產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國〕從一個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和EcoRI/PstI酶切，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒。通過測序檢測擴(kuò)增的DNA片段的DNA序列。所得質(zhì)粒被稱為pEC-K18mob2glbOexp，示于圖2。實(shí)施例4 用質(zhì)粒pEC-K18mob2glbOexp轉(zhuǎn)化菌株DSM5715
用如Liebl等所述(FEMS微生物學(xué)通信53，299-303(1989))的電穿孔法，用質(zhì)粒pEC-K18mob2glbOexp轉(zhuǎn)化菌株DSM5715。在補(bǔ)加25mg/l卡那霉素的由18.5g/l腦心浸液肉汁，0.5M山梨醇，5g/l細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，2.5g/l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂組成的LBHIS瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。在33℃孵育2天。
通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物學(xué)144，915-927)從一個(gè)轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI和EcoRI/PstI酶切，隨后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒。所得菌株的純培養(yǎng)物被稱為DSM5715/p EC-K18mob2glbOexp。實(shí)施例5 生產(chǎn)賴氨酸將實(shí)施例4中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pEC-K18mob2glbOexp在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃，在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含25mg/l卡那霉素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。從此瓊脂板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl 2.5g/lBacto-胨 10g/lBacto-酵母提取物 10g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時(shí)。從此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.05。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
72小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
試驗(yàn)結(jié)果示于表1。表1
附圖的簡要說明圖1質(zhì)粒pEC-K18mob2圖。
圖2質(zhì)粒pEC-K18mob2glbOexp圖。
縮寫和名稱如下定義。所述堿基對數(shù)字是在測定重復(fù)性的框架內(nèi)所得的近似值。
perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因。
oriV源自pMB1的類ColE1。
rep谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒編碼的復(fù)制區(qū)。
RP4mobRP4遷移位點(diǎn)。
LacZ-alpha來自大腸桿菌的lacZ基因片段。
Kan卡那霉素抗性基因。
glbO來自谷氨酸棒桿菌的glbO基因。
EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點(diǎn)。
HindIII限制酶HindIII的酶切位點(diǎn)。
PstI限制酶PstI的酶切位點(diǎn)。
Ec1136II限制酶Ec1136II的酶切位點(diǎn)。
序列表<110>德古薩股份公司<120>編碼glbo基因的新核苷酸序列<130>990218 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>840<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(186)..(578)<400>1atggtggttt taccggcgcc atttggacca agtacggccc agtgcgaccc ttgcggaatt 60gagagggaga tatcgtcgag aagcaatttc tcgccgcgcc gcacggtgac gccggccatg 120ttgagtgcta gttcgcgcat gggtaacacc ttactggcgt aaggccaggg cttagactgg 180taccc atg aca acc tca gaa aat ttt tat gat tct gtg ggc ggc gag gaa 230Met Thr Thr Ser Glu Asn Phe Tyr Asp Ser Val Gly Gly Glu Glu1 5 10 15acg ttt tcc ctc atc gtc cac cgt ttt tat gaa cag gtc ccc aac gac278Thr Phe Ser Leu Ile Val His Arg Phe Tyr Glu Gln Val Pro Asn Asp20 25 30gat att tta ggc ccg atg tat ccg ccg gat gat ttt gag ggc gcc gag326Asp Ile Leu Gly Pro Met Tyr Pro Pro Asp Asp Phe Glu Gly Ala Glu35 40 45cag cgt cta aag atg ttc ctc agc cag tac tgg ggc ggc ccg aag gat374Gln Arg Leu Lys Met Phe Leu Ser Gln Tyr Trp Gly Gly Pro Lys Asp50 55 60tat cag gag cag cgt gga cac cct cgt ctg cgc atg cgt cac gtc aat422Tyr Gln Glu Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Met Arg His Val Asn65 70 75tac ccc atc ggc gtc acc gca gcg gag cgt tgg ctg cag ctc atg tcc470Tyr Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Glu Arg Trp Leu Gln Leu Met Ser80 85 90 95aat gca ctc gac ggc gtg gat ttg acc gcg gag cag cgt gaa gcg att518Asn Ala Leu Asp Gly Val Asp Leu Thr Ala Glu Gln Arg Glu Ala Ile100 105 110tgg gag cat atg gtg cgc gcg gcc gat atg ctg atc aat tcc aac ccc566Trp Glu His Met Val Arg Ala Ala Asp Met Leu Ile Asn Ser Asn Pro115 120 125gat ccg cac gct taacttctgc caaaaagtcg ttttgaccat aagctaagcg618Asp Pro His Ala130attgtgaatc gaattgcaga aatcgcacgc agtttcggcg tgctgggctt cagcgctttc 678ggcggcccca ccgcgcacct cggatatttc cgcacggaat tcgtggagcg gcggcgctgg 738ctggatgatc gccaatattc cgagatcgta gcgctcagcc aactacttcc cggacctgga 798tcgtcgcagg tcggtatgat gctgggctac caccgcgccg gt 840<210>2<211>131<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Met Thr Thr Ser Glu Asn Phe Tyr Asp Ser Val Gly Gly Glu Glu Thr1 5 10 15Phe Ser Leu Ile Val His Arg Phe Tyr Glu Gln Val Pro Asn Asp Asp20 25 30Ile Leu Gly Pro Met Tyr Pro Pro Asp Asp Phe Glu Gly Ala Glu Gln35 40 45Arg Leu Lys Met Phe Leu Ser Gln Tyr Trp Gly Gly Pro Lys Asp Tyr50 55 60Gln Glu Gln Arg Gly His Pro Arg Leu Arg Met Arg His Val Asn Tyr65 70 75 80Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Glu Arg Trp Leu Gln Leu Met Ser Asn85 90 95Ala Leu Asp Gly Val Asp Leu Thr Ala Glu Gln Arg Glu Ala Ile Trp100 105 110Glu His Met Val Arg Ala Ala Asp Met Leu Ile Asn Ser Asn Pro Asp115 120 125Pro His Ala130<210>3<211>18<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><223>glb-exp1<400>3ggtcggtgag ataatcag18<210>4<211>18<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><223>glb-exp2<400>4tggcagaagt taagcgtg18
PCT/RO/134表關(guān)于微生物保藏的說明(PCT細(xì)則13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)
權(quán)利要求
1.來自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，和d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。其中所述多肽優(yōu)選地具有類血紅蛋白的活性。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的優(yōu)選地為重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的能復(fù)制的DNA，含有(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)匹配于(i)序列的至少一個(gè)序列，或(iii)與互補(bǔ)于(i)或(ii)序列的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(iv)(i)中有功能的中性有義突變。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸序列，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
6.含有權(quán)利要求1的多核苷酸序列的載體。
7.含有權(quán)利要求6的載體的棒狀細(xì)菌。
8.經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)將生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵，該細(xì)菌中至少編碼類血紅蛋白的基因被增強(qiáng)，尤其是過表達(dá)。b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的L-氨基酸，及c)分離L-氨基酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所用細(xì)菌中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因也被增強(qiáng)。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所用細(xì)菌中降低L-氨基酸生成的代謝途徑至少被部分抑制。
11.權(quán)利要求8的方法，其中使用經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且所述質(zhì)粒載體攜帶編碼類血紅蛋白的基因的核苷酸序列。
12.權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的方法，其中使用生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀細(xì)菌。
13.權(quán)利要求9的方法，其中選自下組的一個(gè)或多個(gè)基因被同時(shí)增強(qiáng)，尤其是過表達(dá)或擴(kuò)增編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因，編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因，編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，編碼3-磷酸甘油酸激酶pgk基因，編碼賴氨酸輸出的lysE基因。
14.權(quán)利要求10的方法，其中L-賴氨酸是通過發(fā)酵如下細(xì)菌產(chǎn)生的，該細(xì)菌中選自下組一個(gè)或多個(gè)基因被同時(shí)弱化編碼磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的pck基因，編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因，編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因。
15.前述權(quán)利要求所述任一項(xiàng)方法，其中使用谷氨酸棒桿菌的微生物。
16.權(quán)利要求1的多核苷酸序列作為引物以通過聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生編碼glbO基因產(chǎn)物的基因DNA的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1的多核苷酸序列作為雜交探針的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明還提供了經(jīng)增強(qiáng)編碼類血紅蛋白的glbO基因而發(fā)酵制備L－氨基酸的方法，及上述多核苷酸作為引物或雜交探針的應(yīng)用。
文檔編號C12P13/08GK1432066SQ01810385
公開日2003年7月23日 申請日期2001年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月2日
發(fā)明者貝蒂娜·莫克爾, 阿希姆·馬克思, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請人:德古薩股份公司