專利名稱：ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的抗體及其制備方法，具體是一種ppGalNAC-T20 抗原及其多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
UDP-半乳糖酰胺N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-Ts)是0_型糖蛋白糖鏈合成反應(yīng)的第一步起始糖基轉(zhuǎn)移酶，它能將N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)肽鏈的 絲氨酸或蘇氨酸殘基上。人體中的PPGalNAc-Ts家族中己有19個成員被報道研究，它們 在人體組織中的分布和對體外多肽底物的糖基化修飾的專一性上都存在著不同程度的差 異。ppGalNAc-Ts可作為腫瘤標(biāo)志物，例如在神經(jīng)母細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞株中特異性高表達(dá)的 ppGalNAC-T13，它可以作為脊髓發(fā)生神經(jīng)母細(xì)胞瘤的早期診斷標(biāo)志。另外，ppGalNAc-T6 可以作為乳腺癌的免疫組化檢測標(biāo)志。最新研究結(jié)果表明，ppGalNAc-TH調(diào)控死亡受體 Apo2L/TRAIL的糖基化修飾，過表達(dá)ppGalNAc_T14能顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。ppGalNAc-Ts 除具有糖基轉(zhuǎn)移酶功能之外，還具有潛在的重要臨床診斷意義。因此，獲得ppGalNAc-Ts家 族各個成員的抗體，對精確定位其在組織和細(xì)胞中的分布有著重要意義，從而更真實的反 映它們的生物學(xué)功能。然而ppGalNAc-Ts家族成員間的同源性較高，不同成員間的同源性 可達(dá)40% 70%，因此保證其抗體的特異性至關(guān)重要。ppGalNAc-Ts家族成員均為II型膜蛋白，N端有一個4 22個氨基酸的胞漿區(qū)， 繼以一個15 25個氨基酸的穿膜區(qū)，通過一個長短不一的莖區(qū)與C端伸入高爾基體內(nèi)大 約450個氨基酸的催化區(qū)相連接。ppGalNAC-T20從一級結(jié)構(gòu)分析屬于UDP-半乳糖酰胺 多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族成員，它與ppGalNac-TIO在氨基酸水平上具有70. 7% 的相似性。雖然只在腦和睪丸組織中檢測到表達(dá)量較低的ppGalNAC-T20mRNA，但鑒于其存 在部位的特殊性，可以推測其在機(jī)體分化、發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，N Berois et al.等采用多肽合成的方法制 備 ppGalNAc-T13 抗體(N Berois et al. , ppGalNAc-T13 :A New Molecular Marker of BoneMarrow Involvement in Neuroblastoma, Clinical Chemistry,2006,52 :1701 1712)，該方法一般需要合成15個左右的肽段，這樣比較容易保證抗體的特異性。但 是，由于多肽的分子量相對較小，免疫原性較差，得到抗體比較困難，通常需將其與 MAP(multipleantigenic peptide)或KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)，但是這樣提高了成本。一 般用來制備抗體的抗原肽需10 20mg，純度85%以上，這種級別的多肽合成價格為120元 /氨基酸，偶聯(lián)基團(tuán)MAP的價格也在1000元以上，較低的免疫原性和高昂的成本，限制了合 成多肽用于抗體制備方法的應(yīng)用。目前尚未有與PpGalNAc-T20抗體制備相關(guān)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種ppGalNAC-T20抗原及其 多克隆抗體的制備方法。本發(fā)明制備的抗體不和與PpGalNAc-T20具有最高同源性的ppGalNAc-T10發(fā)生交叉反應(yīng)，更不與ppGalNAc-Ts家族其它成員發(fā)生交叉反應(yīng)；本發(fā)明通 過簡單的分子克隆實驗制備出所需的抗原蛋白，且該抗原蛋白與GST融合表達(dá)，易于純化; 本發(fā)明克服了合成多肽方法免疫原性差、價格昂貴等缺點。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種ppGalNAC-T20抗原，該抗原為蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明還涉及一種如上所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體制備方法，包括 如下步驟步驟一，以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體 制備方法制備抗血清；步驟二，純化抗血清，即得。本發(fā)明還涉及一種如上所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體制備方法，包括 如下步驟步驟一，克隆如SEQ ID N0:1所示的核酸片段；步驟二，利用步驟一所得核酸片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂 解，純化，得蛋白質(zhì)；步驟三，以步驟二所得蛋白質(zhì)為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清， 純化抗血清，即得。步驟一中，所述克隆，所用引物對具體為如SEQ ID NO :3所示的上游引物和SEQ IDN0:4所示的下游引物。步驟二中，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。步驟二中，所述重組質(zhì)粒使用的質(zhì)粒為PGEX-5X-1。步驟二中，篩選所述重組質(zhì)粒的過程為將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a 中，使用含有100 u g/ml氨芐青霉素的LB平板，37°C下培養(yǎng)12h，挑取單菌落后搖菌，提取質(zhì) 粒并測序，測序正確的即為所需重組質(zhì)粒。步驟二中，所述培養(yǎng)具體為，1L培養(yǎng)基的組成為蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCllOg，余量為水；培養(yǎng)溫度為37°C ；培養(yǎng)至大腸桿菌BL21 (DE3)的0D值為0. 8 1. 2。步驟二中，所述誘導(dǎo)為加入IPTG，使其終濃度為0. ImM 0. 5mM，溫度26°C下培 養(yǎng)3h 6h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明得到的多克隆抗體是用 ppGalNAc-T20的莖區(qū)一段蛋白作為抗原得到的；本發(fā)明制備的抗體不和與ppGalNAC-T20 具有最高同源性的ppGalNAc-TIO發(fā)生交叉反應(yīng)，更不與ppGalNAc-Ts家族其它成員發(fā)生交 叉反應(yīng)；本發(fā)明通過簡單的分子克隆實驗制備出所需的抗原蛋白，且該抗原蛋白與GST融 合表達(dá)，易于純化；本發(fā)明克服了合成多肽方法免疫原性差、價格昂貴等缺點；本發(fā)明得到 的抗體不僅可以用于檢測變性后的ppGalNAC-T20蛋白，還可以用于檢測具有活性的天然 構(gòu)象的ppGalNAc-T20蛋白。本發(fā)明中所涉及的菌株大腸桿菌DH5 a、大腸桿菌BL21 (DE3)已在《汪玲玲，楊輯， 黃誠之，王海洪；大腸桿菌holo-ACP的過表達(dá)、分離純化及長鏈脂酰ACP的合成，微生物學(xué)報，2008，48 (7) :963 969》文獻(xiàn)中公開。本發(fā)明涉及的菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取 得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號航星商務(wù)樓1號樓606室。


圖1為GST-short T20融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖；圖2為GST-short T20融合蛋白純化電泳圖；圖3為ppGalNAc_T20抗體純化電泳圖；圖4為ppGalNAC-T20抗體與其它ppGalNAc-T的交叉特異性檢測圖；圖5為檢測ppGalNAc_T20抗體對不同濃度的GST-short T20蛋白的效價的 WesternBlotting 結(jié)果圖；圖6為檢測ppGalNAc-T20抗體對在293T細(xì)胞中表達(dá)的不同濃度的 FLAG-ppGalNAc-T20 蛋白的效價的 Western Blotting 結(jié)果圖；圖7為用ppGalNAC-T20抗體通過免疫組化法檢測C57小鼠睪丸組織中 ppGalNAc-T20蛋白表達(dá)分布結(jié)果圖；圖8為用ppGalNAC-T20抗體通過免疫共沉淀法檢測MLTC-1小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤 細(xì)胞裂解液的Western Blotting結(jié)果圖。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為 前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施 例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議 的條件進(jìn)行。實施例ppGalNAc-T20多克隆抗體的制備步驟一，抗原序列的確立在ClustalX 軟件中輸入 ppGalNAc_T20 (GenBank Accession Number :GU220060) 和 ppGalNAc-TIO (GenBank Accession Number :AJ505950)的蛋白序列進(jìn)行比對，在 ppGalNAc-T20蛋白的莖區(qū)選取一段序列short T20作為抗原，short T20序列如SEQ ID NO 2 所示(ppGalNAc-T20 全蛋白質(zhì)編碼 30AA 到 141AA)；步驟二，重組質(zhì)粒的構(gòu)建抗原short T20的氨基酸序列對應(yīng)的DNA序列如SEQ ID NO :1所示；根據(jù) PGEX-5X-1的多克隆位點和short T20的DNA序列設(shè)計引物上游引物5'-GTT GCG AGC GGC CGC CTG TAC AAG GAT-3‘ ； (SEQ ID NO 3)；下游引物5'-GATAAT GAG TCG ACC GTT TGG CAG CCTTTC-3‘ (SEQ ID NO :4)。以 ppGalNAc-T20 全長 cDNA (GenBank Accession Number :GU220060)為模板，通過 PCR擴(kuò)增得到目的片段，PCR反應(yīng)條件為94°C 3min ；94°C 30s, 56°C 30s, 68°C 30s，25個循 環(huán)；68°C IOmin ；目的片段經(jīng) Sal I (TaKaRa) ,Not I (TaKaRa)雙酶切后膠回收，以 Ligation High連接酶(ToYoBo)連接入經(jīng)Sal I、Not I雙酶切的pGEX_5X_l質(zhì)粒(Amersham)，連接 反應(yīng)條件為:16°C,2h ；
將所構(gòu)建的pGEX-5X-l-short T20原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (天根)，使用含有100μ g/ml氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜篩選培養(yǎng)；挑取單菌落后搖菌，提取質(zhì)粒 并測序。步驟三，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；選擇步驟二中測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(天根)，IL大腸桿菌 BL21(DE3)培養(yǎng)液在37°C培養(yǎng)至OD值達(dá)到1. 0 ；大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)基組分為 (w/v)蛋白胨，0.5% (w/v)酵母提取物，(W/v)NaCl，所述IL培養(yǎng)基中，蛋白胨10g，酵母 提取物5g，NaCl 10g，余量為水；培養(yǎng)溫度為37°C。在大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液中加入IPTG至0. 5mM, 26°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)3h ；裂解大 腸桿菌BL21(DE3)將IL誘導(dǎo)后的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)液離心收集菌體，用IOOml裂 解緩沖液重懸，該緩沖液的組分為=PBS(pH = 7. 3),1% (v/v)Triton X-100，ImM PMSF，所 述 IL 緩沖液中，Triton X-100 10ml, PMSF 174. 2mg，余量為 PBS (pH = 7. 3)；超聲波破碎 20次，每次5s。然后將經(jīng)超聲波破碎后的菌體在4°C條件下，10，OOOrpm離心15min，收集上 清。如圖1所示，1為marker，2為未用IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解后的蛋白上清，3為用IPTG誘 導(dǎo)后的菌體裂解后的蛋白上清。由圖1可知，在大腸桿菌BL21(DE3)中可通過IPTG誘導(dǎo)表 達(dá)得到了 GST-short T20融合蛋白。步驟四，純化大腸桿菌BL21(DE3)菌體裂解破碎后的蛋白上清使用GE Healthcare公司的GSTrap HP親和純化柱，先用5倍柱床體積的PBS平衡該柱，接著上樣超 聲破碎離心后得到的上清，再用5倍柱床體積的PBS沖洗該柱，然后用5倍柱床體積的還原 性谷胱甘肽溶液洗脫。還原性谷胱甘肽溶液的組分為50mM Tris-HCl，IOmM還原性谷胱甘 肽，PH為8. 0，通過UV檢測收集洗脫峰。如圖2所示，1為marker，2為未純化的IPTG誘導(dǎo) 后的菌體裂解后的蛋白上清；3為穿透峰，即未被GSTrap HP柱結(jié)合的蛋白，4為洗脫峰，即 用還原性谷胱甘肽從GSTrap HP柱上洗脫下的GST-short T20融合蛋白。步驟五，用純化的抗原蛋白對家兔進(jìn)行免疫，每次使用抗原蛋白200 μ g，兩星 期一次；3個月后取血清，3，OOOrpm離心15分鐘后得到抗血清；純化抗血清使用GE Healthcare公司的Hitrap Protein A HP抗體純化柱，先用10倍柱床體積的結(jié)合液平衡 該柱，結(jié)合液成分為20mM Na3PO4, pH為7. 0，接著讓ppGalNAC-T20抗血清通過該柱，再用 5倍柱床體積的結(jié)合液沖洗該柱，然后用5倍柱床體積的洗脫液洗脫，洗脫液成分為0. IM Na3C6H5O7，pH為3. 0，通過UV(254nm)檢測收集洗脫峰。如圖3所示，1為marker，2為未純 化的ppGalNAc-T20抗血清，3為純化后的ppGalNAc_T20多克隆抗體。本實施例所得抗體是用ppGalNAC-T20的莖區(qū)一段蛋白作為抗原得到的，該 抗體不與和ppGalNAC-T20同源性最高的ppGalNAc-ΤΙΟ發(fā)生交叉反應(yīng)，也不與其它的 ppGalNAc-Ts家族成員發(fā)生交叉反應(yīng)。具有免疫印跡、組織細(xì)胞染色及免疫沉降等用途。不 僅可以用于PpGalNAc-T20蛋白的體內(nèi)檢測，還可以用于ppGalNAC-T20蛋白的體外檢測。實施效果(I)Western Blotting圖4，圖5及圖6是用Western Blotting檢測本實施例制備的多克隆抗體的特異 性和靈敏度。如圖4所示，從左到右依次為含帶Flag標(biāo)簽的ppGalNAc-Tl、ppGalNAc-T2, ppGalNAc-T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、ppGalNAc_T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc_T13、ppGalNAc_T14、ppGalNAc_T 15、ppGalNAc_T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 的 293T 細(xì)胞裂解液。圖 A，圖 B 禾Π 圖 C 中 分別為轉(zhuǎn)染Flag-ppGalNAc-Ts質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解液，圖A為抗ppGalNAC-T20抗體檢測 圖，圖B為抗FLAG抗體檢測圖。其中圖A為用ppGalNAc_T20抗體檢測帶Flag標(biāo)簽的ppGalNAc-Tl、 ppGalNAc-T2、ppGalNAc_T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、ppGalNAc_T9、 ppGalNAc-T10、 ppGalNAc_T12、 ppGalNAc_T13、 ppGalNAc_T14、 ppGalNAc_T15、 ppGalNAc-T16、ppGalNAc_T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 蛋白的 Western Blotting 結(jié)果圖。一抗比例為1 2000，抗兔二抗比例為1 10000，顯影時間IOmin ；圖B 為用抗 Flag 抗體檢測帶 Flag 標(biāo)簽的 ppGalNAc-Tl、ppGalNAc_T2、 ppGalNAc-T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、ppGalNAc_T9、ppGalNAc_T10、 ppGalNAc-T12、ppGalNAc_T13、ppGalNAc_T14、ppGalNAc_T 15、ppGalNAc_T16、 ppGalNAc-T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 蛋白的 Western Blotting 結(jié)果圖；一抗比 例為 1 2000 (HRPconjugated)，無需二抗，顯影時間 IOmin ；圖C 為用抗 actin 抗體檢測帶 Flag 標(biāo)簽的 ppGalNAc-Tl、ppGalNAc_T2、 ppGalNAc-T3、ppGalNAc_T4、ppGalNAc_T6、ppGalNAc_T8、ppGalNAc_T9、ppGalNAc_T10、 ppGalNAc-T12、ppGalNAc_T13、ppGalNAc_T14、ppGalNAc_T 15、ppGalNAc_T16、 ppGalNAc-T17、ppGalNAc_T18 和 ppGalNAc_T20 蛋白的 Western Blotting 結(jié)果圖；一抗比 例為1 2000，抗鼠二抗比例為1 2000，顯影時間lOmin。圖4說明ppGalNAC-T20抗體特異性良好，不與其它的ppGalNAc-Ts家族成員發(fā)生 交叉反應(yīng)；圖5說明ppGalNAC-T20抗體具有良好的靈敏度，可檢測出低至0. 625ng的純化 后抗原蛋白GST-short T20 ；圖6說明ppGalNAC-T20抗體具有良好的靈敏度，可檢測出低 至1. 0 μ g的轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解上清中的FLAG-ppGalNAC-T20蛋白；(2)ppGalNAc-T20多克隆抗體在免疫組化中的應(yīng)用圖7為用ppGalNAC-T20抗體通過免疫組化法檢測C57小鼠睪丸組織中 ppGalNAc-T20蛋白表達(dá)分布結(jié)果圖，箭頭所示處即為用ppGalNAC-T20抗體檢測到的 ppGalNAc-T20蛋白在C57小鼠睪丸組織中的表達(dá)分布。該圖說明ppGalNAC-T20抗體可以 應(yīng)用于免疫組化實驗檢測動物組織內(nèi)ppGalNAC-T20蛋白的表達(dá)分布情況。(3)ppGalNAc-T20多克隆抗體在免疫沉淀中的應(yīng)用圖8為用ppGalNAC-T20抗體通過免疫沉淀法檢測MLTC-1小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì) 胞裂解液的Western Blotting結(jié)果圖，其中MLTC-1小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞1和2分別 為轉(zhuǎn)染 pcDNA3. I-Full-length-T20 和對照 pcDNA3. 1 載體。該圖說明 ppGalNAc_T20 抗體 可以應(yīng)用于免疫沉淀實驗檢測細(xì)胞裂解液中的ppGalNAC-T20蛋白。序列表<110>上海交通大學(xué)<120>ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗體的制備方法<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>336<212>DNA〈213>Homo sapiens<400>1ctgtacaagg ataagcacct ggtgaagtca gcggagcccg gggagcagca gacatttcca 60ctgggcctgg gagatgggca attctattca tggacagatg gtttgagaag aaaggactgg 120catgactatg aaagcattca gaaagaggct atgcgctcag ggaaaggtga acatgggaaa 180ccttaccccc ttactgaaga ggaccatgat gactcagctt acagggaaaa tggttttaat 240attttcgtca gcaacaatat tgctctagag aggtctctgc cagatattcg tcatgctaac 300tgtaagcata agatgtatct ggaaaggctg CC3.3.3.CooU<210>2<211>112<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Leu Tyr Lys Asp Lys His Leu Val Lys Ser Ala Glu Pro Gly Glu Gln151015Gln Thr Phe Pro Leu Gly Leu Gly Asp Gly Gln Phe Tyr Ser Trp Thr202530Asp Gly Leu Arg Arg Lys Asp Trp His Asp Tyr Glu Ser lie Gln Lys354045Glu Ala Met Arg Ser Gly Lys Gly Glu His Gly Lys Pro Tyr Pro Leu505560Thr Glu Glu Asp His Asp Asp Ser Ala Tyr Arg Glu Asn Gly Phe Asn65707580lie Phe Val Ser Asn Asn lie Ala Leu Glu Arg Ser Leu Pro Asp lie859095Arg His Ala Asn Cys Lys His Lys Met Tyr Leu Glu Arg Leu Pro Asn100105110<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3gttgcgagcg gccgcctgta caaggat27<210>4<211>30<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gataatgagt cgaccgtttg gcagcctttc30
權(quán)利要求
一種ppGalNAc-T20抗原，其特征在于，該抗原為蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的ppGalNAC-T20抗原的核酸，其特征在于，該核酸的堿基 序列如SEQ ID NO 1所示。
3.—種如權(quán)利要求1所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟步驟一，以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白質(zhì)為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備 方法制備抗血清；步驟二，純化抗血清，即得。
4.一種如權(quán)利要求1所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟步驟一，克隆如SEQ ID NO 1所示的核酸片段；步驟二，利用步驟一所得核酸片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂解，純 化，得蛋白質(zhì)；步驟三，以步驟二所得蛋白質(zhì)為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清，純化 抗血清，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征是，步 驟一中，所述克隆，所用引物對具體為如SEQ ID NO 3所示的上游引物和SEQID NO 4所示 的下游引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征是，步 驟二中，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征 是，步驟二中，所述重組質(zhì)粒使用的質(zhì)粒為PGEX-5X-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征是，步 驟二中，篩選所述重組質(zhì)粒的過程為將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α中，使用含有 100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板，37°C下培養(yǎng)12h，挑取單菌落后搖菌，提取質(zhì)粒并測序，測 序正確的即為所需重組質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征是，步 驟二中，所述培養(yǎng)具體為，IL培養(yǎng)基的組成為蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量 為水；培養(yǎng)溫度為37°C ；培養(yǎng)至大腸桿菌BL21 (DE3)的OD值為0. 8 1. 2。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗體的制備方法，其特征是，步 驟二中，所述誘導(dǎo)為加入IPTG，使其終濃度為0. ImM 0. 5mM，溫度26°C下培養(yǎng)3h 6h。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗體的制備方法；本發(fā)明涉及的ppGalNAc-T20抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；本發(fā)明還涉及一種分離核酸，其堿基序列如SEQ ID NO1所示；本發(fā)明還涉及一種多克隆抗體，該多克隆抗體可用如下的方法制備得到，該方法包括如下步驟以氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的蛋白質(zhì)為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清；純化抗血清，即得；本發(fā)明還涉及一種制備多克隆抗體的方法，包括如下步驟克隆如SEQ ID NO1所示的核酸片段；構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂解，純化，得蛋白質(zhì)；以所得蛋白質(zhì)為抗原，采用常規(guī)多克隆抗體制備方法制備抗血清，純化抗血清，即得。本發(fā)明的方法簡單，制備的抗體免疫原性強(qiáng)。
文檔編號C12N15/70GK101818134SQ20101030009
公開日2010年9月1日 申請日期2010年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月7日
發(fā)明者張延 , 彭燦, 武功冬, 謝文嫻, 鄒霞 申請人:上海交通大學(xué)