專(zhuān)利名稱(chēng)：一種適于培養(yǎng)cho細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的培養(yǎng)基的配制及其培養(yǎng)工藝，更具體地說(shuō)涉及一種采無(wú)血清新培養(yǎng)基用懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白治療藥物的培養(yǎng)工藝，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
誕生于70年代末的基因工程藥物因其具有其他藥物無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，已迅速成為制藥工業(yè)中一個(gè)引人矚目的領(lǐng)域。1995年美國(guó)基因工程藥物銷(xiāo)售額約為48億美元，1997 年超過(guò)60億美元，年增長(zhǎng)率達(dá)20%以上。各國(guó)政府將其視為新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)熱點(diǎn)而給予了大力支持。其中，基因重組治療性抗體(包括受體-Fc融合蛋白等抗體樣分子)是生物制藥領(lǐng)域發(fā)展最迅猛、銷(xiāo)售額最高、產(chǎn)品種類(lèi)最多的一類(lèi)產(chǎn)品，是拉動(dòng)生物制藥產(chǎn)業(yè)快速增長(zhǎng)的主要力量。例如，羅氏公司阿瓦斯汀是一種阻礙血管生成的基因重組治療性抗體，被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療肺癌、結(jié)腸癌和直腸癌，并在歐洲獲準(zhǔn)用于治療乳腺癌， 2009年的銷(xiāo)售額達(dá)59億美元?；蛑亟M治療性抗體(包括受體-Fc融合蛋白等抗體樣分子)的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化， 是其發(fā)展的關(guān)鍵。由于基因重組治療性抗體上游構(gòu)建技術(shù)和大量生產(chǎn)抗體的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的落后，我國(guó)現(xiàn)在最高生產(chǎn)水平非常低，產(chǎn)量低導(dǎo)致生產(chǎn)成本高居不下，項(xiàng)目難以產(chǎn)業(yè)化。適宜的培養(yǎng)基和大規(guī)模培養(yǎng)工藝是目前制約重組抗體類(lèi)藥物表達(dá)水平的兩大瓶頸。而其中找到適合生產(chǎn)的工作細(xì)胞的培養(yǎng)工藝對(duì)整個(gè)生產(chǎn)的作用尤為重要，是提高細(xì)胞產(chǎn)量的重要途徑之一。差的培養(yǎng)工藝將導(dǎo)致高額的生產(chǎn)成本。20世紀(jì)80年代初期，在世界衛(wèi)生組織(WHO)明確了哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞可用于生物制品生產(chǎn)以后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在生物技術(shù)藥物的研發(fā)中獲得了長(zhǎng)足發(fā)展。目前，用于生物制藥的真核表達(dá)系統(tǒng)中，中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(Chinese hamster ovary cell line, CHO)是應(yīng)用最為廣泛的，在美國(guó)和歐盟已批準(zhǔn)的以哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物藥品中，利用CHO系統(tǒng)的占60%以上，且比例不斷上升。常用的CHO細(xì)胞系有兩種CH0和CHO(DHFR-)，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO細(xì)胞具有如下優(yōu)點(diǎn)a.外源蛋白容易在CHO細(xì)胞中合成并分泌到培養(yǎng)基中；b.表達(dá)蛋白的折疊及二硫鍵的形成幾乎與天然蛋白質(zhì)相同；c.在正常的氨基酸位置上發(fā)生糖基化；d.能完成其他翻譯后加工與修飾；e.能正確組裝多亞基蛋白；f.外源基因的整合穩(wěn)定；g.能以無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)并達(dá)到高密度，且培養(yǎng)體積能達(dá)到1000L以上。因此，CHO細(xì)胞在生物制藥業(yè)中受到廣泛重視，而其中CHO-DHFR-細(xì)胞系(二氫葉酸還原酶缺陷型)又因?yàn)槠淞己玫腄HFR篩選系統(tǒng)得到了研發(fā)者的一致青睞。目前已有越來(lái)越多的藥用蛋白在CHO細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)，其中部分藥物已投放市場(chǎng)，倒如EP0、GCSF等。但是，CHO細(xì)胞培養(yǎng)成本高，條件難掌握，在一定程度上影響了它對(duì)基因重組治療性抗體(包括受體-Fc融合蛋白等抗體樣分子)的表達(dá)水平。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源，不同生長(zhǎng)狀態(tài)(貼壁，懸浮)和用于表達(dá)不同基因重組治療性抗體(包括受體-Fc融合蛋白等抗體樣分子)的CHO細(xì)胞株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求都不一樣。因此，依據(jù)不同的細(xì)胞株設(shè)計(jì)和優(yōu)化出適合其高密度生長(zhǎng)或高水平目的產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)基，已經(jīng)是迫在眉睫且亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一提供了一種適于CHO細(xì)胞懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其包含下列組分(1) 21. 4g/L C6614 培養(yǎng)基(2) 0. 05 6. OmM/L 谷氨酰胺(3) 0. 1 100mg/L 胰島素(4) 0. 1 100mM/L 檸檬酸鐵調(diào)節(jié)pH 為 6. 9-7. 4。所述適于CHO細(xì)胞懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為(l)21.4g/L C6614 培養(yǎng)基(2) 4 6mM/L谷氨酰胺(3)5.0mg/L 胰島素5mM/L 檸檬酸鐵調(diào)節(jié)pH 為 7.0。上述培養(yǎng)基中還可以含有脂類(lèi)，其中所述脂類(lèi)優(yōu)選為⑶lipids。上述培養(yǎng)基的制備方法如下將C6614干粉與超純水混合攪拌后，加入谷氨酰胺、 檸檬酸鐵水溶液，再加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值為6. 9-7. 4，60分鐘后再加入胰島素，補(bǔ)充超純水，10分鐘后取樣測(cè)定生化參數(shù)，過(guò)濾除菌。本發(fā)明另一目的還提供了在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，后期培養(yǎng)中所用的流加培養(yǎng)基為含有EX-cell 302的培養(yǎng)基；所述的流加培養(yǎng)基優(yōu)選為濃縮的EX-cell 302培養(yǎng)基，其含有63. 6g/LEX-cell 302培養(yǎng)基、2_100g/L大豆水解蛋白、5_10mg/L胰島素；所述的濃縮的EX-cell 302培養(yǎng)基更有選為含有63. 6g/L EX-cell 302培養(yǎng)基、20g/L大豆水解蛋白、 5mg/L胰島素。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)重組蛋白類(lèi)藥物的CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝，其具體步驟如下(1)控制生物反應(yīng)器的參數(shù)溶氧控制為40，溫度控制為37°C，攪拌速度為40rpm， 氣體流量為100mL/min ；(2)采用權(quán)利要求1-3中任一培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，濃縮EX-cell 302培養(yǎng)基為流加培養(yǎng)基；(3)在培養(yǎng)后期采用流加和降溫培養(yǎng)工藝并降低pH，將溫度控制在34.0 36. 5°C，控制 pH 在 6.0 7. 1 ；(4)流加培養(yǎng)過(guò)程中，保持葡萄糖濃度為2 3g/L，谷氨酰胺濃度為2 3mM/L。所述的CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝，其步驟更優(yōu)選為(1)控制生物反應(yīng)器的參數(shù)溶氧控制為40，溫度控制為37°C，攪拌速度為40rpm， 氣體流量為100mL/min ；(2)采用權(quán)利要求2中的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，權(quán)利要求6中的濃縮EX-cell 302培養(yǎng)基為流加培養(yǎng)基；(3)在培養(yǎng)后期采用流加和降溫培養(yǎng)工藝并降低pH，將溫度控制在34-36. 5°C，控制 pH 在 6. 9-7. 0 ；(4)流加培養(yǎng)過(guò)程中，保持葡萄糖濃度為2 3g/L，谷氨酰胺濃度為2 3mM/L。本發(fā)明的培養(yǎng)工藝采用流加濃縮培養(yǎng)基流加和降溫培養(yǎng)，結(jié)合灌流基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法。該工藝具有十分良好的效果，工藝具有穩(wěn)定性好、可操作性強(qiáng)、批次間結(jié)果差異小等特點(diǎn)，可以極大的提高重組蛋白的產(chǎn)量。在本發(fā)明中，所述的融合蛋白是中國(guó)專(zhuān)利“VEGF受體融合蛋白在治療眼睛疾病中的應(yīng)用”(專(zhuān)利號(hào)ZL200610066257. 2)和“抑制血管新生的融合蛋白及其用途”(專(zhuān)利號(hào) ZL200510073595.4)，具體而言是穩(wěn)定表達(dá)FP3細(xì)胞系的CHO細(xì)胞(本發(fā)明中的細(xì)胞)以及 FP3融合蛋白，因此ZL200610066257. 2和ZL200510073595. 4的內(nèi)容可用來(lái)解釋本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料C6614 培養(yǎng)基(SAFC 公司，批號(hào)8E0326) ；EX-cell 302 培養(yǎng)基(SAFC 公司，批號(hào) 027K0075) ；CHO-S-SFM II Qnvitrogen 公司)；SAF-CH0-G-001 (清大天一公司)；谷氨酰胺(SIGMA公司，批號(hào)027K0075)；胰島素(諾和諾德公司，批號(hào)WG0074)；檸檬酸鐵(華東師范大學(xué)試劑廠，批號(hào)20070506)；大豆水解蛋白(KERRY公司，批號(hào)1320001沘3)；葡萄糖(SIGMA公司，批號(hào)1觀2291)；谷氨酰胺(SIGMA公司，批號(hào)027K0075)；濃縮混合脂 100XCD lipids(Gibco USA)實(shí)施例1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選發(fā)明人系統(tǒng)對(duì)比研究了五種培養(yǎng)基CH0DHFR-(C6614)，EX-cell 302，CHO-S-SFM II，SAF-CHO-G-OO1，混合培養(yǎng)(C6614 SFM-II EX-cell 302 = 4 1 1)，都添加 1.5mM 檸檬酸鐵和5mg/L的胰島素，結(jié)合細(xì)胞密度和活率，以蛋白產(chǎn)量為考察指標(biāo)，確定最佳的基
礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細(xì)胞從種子庫(kù)中取出，37°C快速解凍，用移液管將冷凍管中的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至 40mL離心管中，加入9mL培養(yǎng)基，900r/min離心3分鐘，棄上清，用IOmL培養(yǎng)基重懸沉淀， 接種于T75方瓶中，37°C培養(yǎng)，2天后計(jì)數(shù)，按照3X 105/mL接種于搖瓶中，以后每3天記數(shù)一次，并按照3X 105/mL的接種密度進(jìn)行擴(kuò)大。再按照5X IO5ceIVmL接種密度分別接種于 5個(gè)500mL搖瓶中，每瓶接種80mL，置入(X)2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)。從培養(yǎng)第2天起，每天取樣1. 5mL，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和生化分析檢測(cè)，時(shí)刻關(guān)注各項(xiàng)參數(shù)的變化，每當(dāng)糖濃度低于3g/L 時(shí)，添加一定量相應(yīng)流加培養(yǎng)基。取樣3mL，留樣1. 5mL用于后期蛋白含量測(cè)定。從表1可以看出，細(xì)胞在C6614培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最高活細(xì)胞數(shù)最大，約為 41. 97X 105，而在SFM-II、EX-cell 302、SAF-CHO-G-OO1和混合培養(yǎng)基中，最高活細(xì)胞數(shù)都較低。但是，細(xì)胞在C6614中培養(yǎng)，活細(xì)胞數(shù)下降非?？欤瑥牡?天開(kāi)始陡然下降，對(duì)濃縮培養(yǎng)基的流加也毫無(wú)反應(yīng)，生長(zhǎng)周期為8天，而在SFM-II和302培養(yǎng)基中，活細(xì)胞數(shù)的下降呈現(xiàn)一個(gè)平緩的趨勢(shì)，尤其是302培養(yǎng)基，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)維持12天。由表2細(xì)胞活率結(jié)果中也可以看出，采用C6614作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，細(xì)胞在培養(yǎng)初期具有較高的存活率，但是從第 5天開(kāi)始，存活率下降非?？?，培養(yǎng)第8天，存活率低于30%;SFM-2初期存活率不高，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)較C6614平緩的下降趨勢(shì)；EX-cell 302培養(yǎng)基從培養(yǎng)第3天開(kāi)始，存活率低于90%，但是細(xì)胞活性下降非常平緩，直到第8天才開(kāi)始下降，第11天細(xì)胞活性低于40%。 三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中從蛋白表達(dá)效果上來(lái)看(表幻，EX-cell 302比較好。因此，細(xì)胞在EX-cell 302培養(yǎng)基中能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間，而在C6614培養(yǎng)基中雖然不能維持較長(zhǎng)的時(shí)間，但是可以提高活細(xì)胞密度，所以我們選擇C6614培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，EX-cell 302培養(yǎng)基作為流加培養(yǎng)基。表1.活細(xì)胞密度變化趨勢(shì)(105/ml)
權(quán)利要求
1.一種適于CHO細(xì)胞懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于包含下列組分(1)21.4g/LC6614 培養(yǎng)基(2)0. 05 6. OmM/L谷氨酰胺(3)0.1 100mg/L 胰島素(4)0.1 100mM/L檸檬酸鐵調(diào)節(jié) PH 為 6. 9-7.4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于含有下列組分(1)21.4g/LC6614培養(yǎng)基(2)4 6mM/L谷氨酰胺(3)5.0mg/L 胰島素(4)1. 5mM/L檸檬酸鐵調(diào)節(jié)PH為7. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于還含有脂類(lèi)，其中所述脂類(lèi)優(yōu)選為 Iipid0
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其特征在于后期培養(yǎng)中所用的流加培養(yǎng)基為含有EX-cell 302的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的流加培養(yǎng)基為濃縮的EX-cell 302培養(yǎng)基，其中含有63. 6g/L 302培養(yǎng)基、2_100g/L大豆水解蛋白、5_10mg/L胰島素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的濃縮的EX-cell302培養(yǎng)基的成分為63. 6g/L 302培養(yǎng)基、20g/L大豆水解蛋白、5mg/L胰島素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于由以下方法制備C6614干粉與超純水混合攪拌后，加入谷氨酰胺、檸檬酸鐵水溶液，再加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值為6. 9-7. 4，60 分鐘后再加入胰島素，補(bǔ)充超純水，10分鐘后取樣測(cè)定生化參數(shù)，過(guò)濾除菌。
8.—種生產(chǎn)重組蛋白類(lèi)藥物的CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝，其特征在于(1)控制生物反應(yīng)器的參數(shù)溶氧控制為40，溫度控制為37°C，攪拌速度為40rpm，氣體流量為 100mL/min ；(2)采用權(quán)利要求1-3中任一培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，濃縮EX-cell302培養(yǎng)基為流加培養(yǎng)基；(3)在培養(yǎng)后期采用流加和降溫培養(yǎng)工藝并降低pH，將溫度控制在33.0 36. 5°C，控制pH在6. 0 7. 1 ；(4)流加培養(yǎng)過(guò)程中，保持葡萄糖濃度為2 3g/L，谷氨酰胺濃度為2 3mM/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝，其特征在于(1)控制生物反應(yīng)器的參數(shù)溶氧控制為40，溫度控制為37°C，攪拌速度為40rpm，氣體流量為 100mL/min ；(2)采用權(quán)利要求2中的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，權(quán)利要求6中的濃縮EX-cell302培養(yǎng)基為流加培養(yǎng)基；(3)在培養(yǎng)后期采用流加和降溫培養(yǎng)工藝并降低pH，將溫度控制在34-36.5°C，控制pH 在 6. 9-7. O ；(4)流加培養(yǎng)過(guò)程中，保持葡萄糖濃度為2 3g/L，谷氨酰胺濃度為2 3mM/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種適于培養(yǎng)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)工藝，涉及一種含有C6614的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含有EX-Cell 302的流加培養(yǎng)基，整個(gè)培養(yǎng)工藝采用流加濃縮培養(yǎng)基流加和降溫培養(yǎng)，結(jié)合灌流基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法。該工藝具有十分良好的效果，工藝具有穩(wěn)定性好、可操作性強(qiáng)、批次間結(jié)果差異小等特點(diǎn)，可以極大的提高重組蛋白的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12N5/075GK102443565SQ20101029727
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者柯瀟, 鄭強(qiáng) 申請(qǐng)人:成都康弘生物科技有限公司