專利名稱：miRNA-10a在制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種miRNA-lOa的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn) 移涉及非常復(fù)雜的機制和過程，由轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的繼發(fā)性腫瘤是人 類癌癥高發(fā)病率和死亡率的主要原因。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征，轉(zhuǎn)移造成細(xì)胞外 基質(zhì)的破壞，使腫瘤細(xì)胞遷徙和基質(zhì)微環(huán)境的改變，這些過程與一些特定基因的失調(diào)相 關(guān)。近來發(fā)現(xiàn)微小RNA家族(miRNA)具有基因調(diào)控子的作用，它們是一群18_26nt 的非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’非編碼區(qū)(UTR)互補位點的相互作用在轉(zhuǎn)錄 后水平調(diào)節(jié)基因的表達(Bartel DP.MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cell 2004 ； 116 281-297)。最新研究表明一些 miRNA 參與乳腺癌的 轉(zhuǎn)移，miR-10b通過抑制HOXDlO間接活化前轉(zhuǎn)移基因RHOC，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn) 移(Ma L, et al.Tumour invasion and metastasis initiatedby microRNA-10b in breast cancer. Nature 2007 ； 449 682-688)；而 miR-335 通過靶定轉(zhuǎn)錄因子 SOX4 和 tenascinC 抑制 轉(zhuǎn)移禾口遷徙(Tavazoie SF, et al.Endogenous humanmicroRNAs that suppress breast cancer metastasis.Nature 2008 ； 451 147-152) ； miR-373 和 miR-520 促進轉(zhuǎn)移(Huang Q, et al.The microRNAs miR-373and miR-520c promote tumourinvasion and metastasis.Nat Cell Biol 2008 ； 10: 202-210) ； miR_21不僅在乳腺癌而且在結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均刺激侵襲和 轉(zhuǎn)移(Zhu S，et al.MicroRNA-21 targets tumorsuppressor genes in invasion and metastasis.Cell Res 2008 ； 18: 350_359.AsanganiIA, et al.MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally downregulates tumorsuppressor Pdcd4 and stimulates invasion, intravasation and metastasis in colorectalcancer.Oncogene 2008 ； 27 2128-2136.Gabriely G, et al.MicroRNA 2lpromotes gliomainvasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.)。結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的首要因素，但其分子機制尚未闡明，早期報 道提示原始腫瘤是異質(zhì)性的，高轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞存在于原始的腫瘤細(xì)胞群中(Fidler IJ, KripkeML.Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.Science 1977 ； 197 893-895.)兩個結(jié)腸癌細(xì)胞株，SW480和SW620是從同一患者分離得到的，SW480細(xì)胞由 原始癌演化而來，而SW620則由淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位培養(yǎng)得到，這兩個細(xì)胞株差別在于轉(zhuǎn)移 潛能的變化，因而成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移機制的理想模型。我們以這兩個細(xì)胞株為主要研模型進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供miRNA-lOa在制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
miRNA-lOa在制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，其特征是所述 miRNA-10a是序列表中SEQ ID NO 1所述的核苷酸序列。所述核苷酸序列為化學(xué)合成獲得或通過構(gòu)建真核細(xì)胞表達載體進行表達獲得。通過研究實驗表明與低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW480相比，miRNA-10a(miR-IOa)在 高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW620是低水平表達的；Northern blot和實時定量PCR實驗也證明 在高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株及臨床標(biāo)本中miR-lOa也是低水平表達的；轉(zhuǎn)染pri-miR-lOa 提高SW620細(xì)胞miR-lOa水平則使該細(xì)胞的侵襲活性顯著下降，在其它高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸 癌細(xì)胞株(HT-29和THC8307細(xì)胞)也出現(xiàn)類似結(jié)果。裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染 pri-miR-lOa后，高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620形成轉(zhuǎn)移瘤的能力明顯降低，說明miR-lOa 在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲，在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。


圖1為miR-lOa在SW480細(xì)胞和未轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌標(biāo)本中高表達；圖2miR-10a抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的體外侵襲和體內(nèi)的肝轉(zhuǎn)移；圖3miR_10a在體外并不影響細(xì)胞活性及增殖；圖4用EGFP報告載體實驗驗證miRNA-10a靶基因；圖5miR_10a對靶基因表達的調(diào)節(jié)。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例11.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620和HT-29均培養(yǎng)在含10% FBS的Dulbecco，s 培養(yǎng)基中，結(jié)腸癌THC8307細(xì)胞株培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，兩種培養(yǎng) 基均添加100單位/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素，所有細(xì)胞均置含5% CO2的37°C培 養(yǎng)箱內(nèi)，2-3天傳代一次。2.結(jié)腸癌細(xì)胞小RNA的提取純化使用mir miRNA Isolation (Ambion，Austin, TX)試劑盒從結(jié)腸癌細(xì)胞以及未
轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌臨床標(biāo)本提取小RNA，并將其溶于無RNase的水中，通過測定 OD260、OD2SO數(shù)值，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定提取的小RNA含量和質(zhì)量。3.miRNA微陣列分析使用mirVana miRNA 探針系統(tǒng)和 mirVana miRNA 標(biāo)記試劑盒(Ambion， Austin, TX, USA),按照說明書方法進行探針點樣、miRNA熒光標(biāo)記和雜交。玻片用 ScanArray Expressmicroarray 進 亍掃描，掃描出的圖象用 ScanArray Express version 1.0 分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)的采集和輸出。4.實時定量PCR分析用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(TaKaRa，Otsu, Shiga, Japan)在 Applied Biosystems 7500實時定量PCR系統(tǒng)上進行，莖環(huán)RT-PCR方法按常規(guī)進行(Chen C， et al.Real-timequantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res.2005 ；33 el79)。進行數(shù)據(jù)處理分析，將所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后比較各組之間目的基因的變化，繪 制柱狀圖Folds = 2-ΔΔct Δ △Ct = (Ctl-Ct2)-(Ct3-Ct4)Ctl 處理樣品待測基因(miR-9)的臨界循環(huán)數(shù)Ct2 處理樣品持家基因(U6)的臨界循環(huán)數(shù)Ct3 對照樣品待測基因(miR-9)的臨界循環(huán)數(shù)Ct4 對照樣品持家基因(miR-9)的臨界循環(huán)數(shù)。5 .Northern blot在8M尿素變性的18%聚丙烯酰胺凝膠分離小RNA，將小RNA電轉(zhuǎn)移到帶正電 荷的BrightStar尼龍膜上，經(jīng)紫外交聯(lián)、預(yù)雜交后，與P32標(biāo)記探針雜交，形成20_30bp的 雜交片段，沖洗并曝光到X膠片上，然后掃描。以U6基因探針與膜進行雜交，其雜交 信號作為內(nèi)參。6.Western blot24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞成片后每孔加入ΙΟΟμΙ RIPA，置于4°C裂解25min ；收 集裂解液反復(fù)吹打，4°C 12000rpm，離心lOmin，收集上清；考馬司亮藍(lán)G-250法測定蛋 白含量，各樣品均取出50 μ g進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳；至目的蛋白有效分離后停 止電泳，取出聚丙烯酰胺凝膠進行硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)移；4°C，100mA,轉(zhuǎn)移過夜；出 硝酸纖維素膜，置于Blotto封閉液中，室溫下封閉3h;加入一抗(兔抗ACTGl蛋白抗體 或兔抗MMP14蛋白抗體)，室溫下孵育2h; TBST清洗4次，每次5min ；加入二抗(羊 抗兔IgG抗體)，室溫下孵育lh; TBST清洗4次，每次5min;加入增強化學(xué)發(fā)光試劑， 作用3min，曝光，然后進行顯影、定影處理；觀察結(jié)果，膠片用LabWorks 凝膠成像及 分析系統(tǒng)進行攝像，分析各組蛋白條帶的亮度值。7.細(xì)胞轉(zhuǎn)染將SW480或SW620細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至70 % -80 %成 片時(約18-24h后)，分別轉(zhuǎn)染甲氧基寡核苷酸和miRNA前體，轉(zhuǎn)染所用試劑為 Lipofectamine2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),按常規(guī)方法并參照說明書進行轉(zhuǎn) 染。寡核苷酸和SiRNA的工作濃度200nm/L，轉(zhuǎn)染所用核苷酸見下述序列。pri-miR-10a 包含 miR-10a 序列。miR-10a 序列為 5，uacccuguagauccgaauuugug3，(SEQ ID NO 1)antisense miR-10a 5' cacaaattcggatctacagggta3， (SEQ ID NO 2)antisense control 5，gactacacaaatcagcgattt3， (SEQ ID NO 3)ACTG1-targeting siRNA 5，gacucagcagaugcguagcauuu tt 3， (SEQ IDNO 4)3，tt cugagucgucuacgcaucguaaa5，(SEQ ID NO 5)MMP 14-targeting siRNA 5' cacuuucugcauccagaauuatt 3，(SEQ ID NO 6)3，ttgugaaagacguaggucuuaau 5' (SEQ ID NO 7)control siRNA 5，uucuccgaacgugucacgutt3，(SEQ ID NO 8)3，ttaagaggcuugcacagugca5， (SEQ ID NO 9)8.侵襲實驗在Transwell 的每個上層小室加 3O μ 1 Matrigel (2 μ g/ μ L)，37°C孵箱 lh，使膠重組成為模擬基底膜結(jié)構(gòu)，將100 μ L含5Χ 104SW480或SW620細(xì)胞的無血清Dulbecco，s MEM細(xì)胞懸液加到上層小室，下層小室加入600 μ 1 10% FBS的Dulbecco，s MEM培養(yǎng)
液，放入37°C孵箱中。60h后用棉簽擦除上層小室里面的未侵襲的細(xì)胞，再用PBS沖洗 2次，下層帶有侵襲細(xì)胞的膜用固定液固定，然后染色。9.動物實驗研究BALB/c無胸腺雌性裸鼠購自中國科學(xué)院動物研究所，在天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物 部在SPF條件下飼養(yǎng)。6-8周齡時進行脾注射，實驗分SW620細(xì)胞組、SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染 載體對照組、SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染pri-miR-lOa表達載體組，每組6只裸鼠，用10%水合氯醛 按3 μ L/g劑量麻醉小鼠，左側(cè)腹部剪口，找到脾臟；25 μ L Dulbecco，s MEM含1 X IO6 細(xì)胞的懸液與25 μ Lmatrigel (lmg/mL)混勻，用BD超細(xì)針(BD Biosciences產(chǎn)品)緩慢注 射進脾臟下極內(nèi)側(cè)，為防止感染腹腔注射慶大霉素注射液400 μ L。注射完成后，繼續(xù)飼 養(yǎng)，6周后處死小鼠，解剖尸體，觀察脾臟腫瘤生長狀況，肝臟、肺臟及其他器官是否有 轉(zhuǎn)移瘤形成。所有可疑組織均做好標(biāo)記，拍照，若有表面結(jié)節(jié)，計數(shù)后，凍于液氮中。 視結(jié)果情況用10%甲醛溶液固定過夜后做病理。10.生物信息學(xué)篩選靶基因利用網(wǎng)站預(yù)測miRanda，TargetScan和PicTar查找miRNA-10a的靶基因，并依
據(jù)各基因功能(與腫瘤的關(guān)系)篩出侯選靶基因。11.載體構(gòu)建①構(gòu)建增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告載體以pEGFP_N2 (Clontech， Mountain View，CA, USA)為模板，通過PCR擴增克隆得到全長719bp的EGFP片段， 所用上游引物序列5，-gcagccaagcttgccaccatgtgtagcaagggc-3，，下游引物序列5，-eg cggatcctttacttgtacagctcgtcc-3，，擴增的片段通過 HindIII、BamH I 克隆到 pcDNA3.1 (+)載 體上，形成pcDNA3/EGFP表達載體。②含靶基因作用位點的EGFP報告載體的構(gòu)建PCR擴增ACTGl的3’ UTR 片段(含預(yù)測的miR-10a結(jié)合位點)，擴增的片段通過BamH I、EcoR I插入到pcDNA3/ EGFP的EGFP編碼區(qū)的下游，構(gòu)建成pEGFP/ACTGl-UTR載體；類似地，可將 MMP14-UTR片段、ACTG13，UTR突變片段和MMP143’ UTR突變片段通過BamH I、EcoR I插入到pcDNA3/EGFP的EGFP編碼區(qū)的下游，構(gòu)建成pEGFP/MMP14_UTR載 體、pEGFP/ACTGI-UTR-M 和 pEGFP/MMP14-UTR_M 載體。③miR-lOa原始轉(zhuǎn)錄物表達載體的構(gòu)建PCR擴增pri-miR-10a片段，擴增的 片段通過 BamH I、EcoR I 克隆到 pcDNA3.1 (+)載體上，形成 pcDNA3 (+)/pri_miR-10a vector表達載體。12.熒光報告載體實驗SW480和SW620細(xì)胞各自接種到 24孔板，次日分別轉(zhuǎn)染miR-10a ASO、ASO 對照或pri-miR-lOa、無關(guān)寡核苷酸對照，24h后再轉(zhuǎn)染含靶基因作用位點(包括突變的 靶基因作用位點)的EGFP的各個報告載體；所有各個實驗組及對照組細(xì)胞均同時轉(zhuǎn)染 紅色熒光蛋白(RFP)表達載體作為內(nèi)參，以便標(biāo)準(zhǔn)化，72h后用RIPA裂解細(xì)胞，收取蛋 白，用熒光分光光度計F-4500 (HITACHI)。本發(fā)明通過miRNA芯片發(fā)現(xiàn)miRNA_10a在人結(jié)腸癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞SW480中高表達，而在人結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞SW620中非常顯著地低表達，Northern blot和實時定量 PCR實驗不僅驗證了 miRNA芯片的結(jié)果，并且還顯示在結(jié)腸癌的臨床標(biāo)本中，未轉(zhuǎn)移 組miRNA-lOa表達量同樣顯著地高于轉(zhuǎn)移組(見表1和圖1)。表1、SW480與SW620細(xì)胞miRNAs表達差異
表1通過miRNAs微陣列分析SW480與SW620細(xì)胞幾種miRNAs表達的差 異；基因與背景比值21.5就被認(rèn)為表達陽性，若比值< 1.5則表達陰性，顯示SW480與 SW620細(xì)胞幾種miRNAs差異表達與背景的比值。圖IA是用實時定量PCR檢測miR-10a在SW480與SW620細(xì)胞中的表達水平；圖IB用Northemblot檢測miR-10a在SW620、SW480細(xì)胞、肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌 標(biāo)本(MT)與未轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌標(biāo)本(NMT)中的表達水平，U6snRNA作為內(nèi)參。通過表1圖1表明與低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW480相比，miR_10a在高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞 株SW620是低水平表達的；Northern blot和實時定量PCR實驗也證明在高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸 癌細(xì)胞株及臨床標(biāo)本中miR-lOa也是低水平表達的。標(biāo)本miR-lOa表達量的驗證結(jié)果顯示出與細(xì)胞模型高度一致的趨勢。因此可以 推論miR-lOa在結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色。為研究miR-lOa在結(jié)腸癌中所起的作用，本發(fā)明采用了細(xì)胞模型和動物實驗來 觀察miR-lOa與結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。研究結(jié)果表明，SW620細(xì)胞具有比SW480 細(xì)胞更高的侵襲活性，并且用2’甲氧基miR-10a的反義鏈(miR-10a ASO)封閉SW480 細(xì)胞中的miR-10a，其侵襲活性顯著增強，而轉(zhuǎn)染pri-miR-10a提高SW620細(xì)胞miR-10a 水平則使該細(xì)胞的侵襲活性顯著下降，在其它高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29和THC8307 細(xì)胞)也出現(xiàn)類似結(jié)果(見圖2)；在圖2中圖2A用Matrigel侵襲實驗檢測SW480和SW620細(xì)胞侵襲活性；圖2B、圖2C用Matrigel侵襲實驗檢測SW480細(xì)胞、轉(zhuǎn)染2，甲氧基miR-10a
ASO或轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸(Ctri-ASO)的SW480細(xì)胞的侵襲活性，侵襲的細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫 染色后記數(shù)，圖2C為200 X的圖象；圖2D用Matrigel侵襲實驗檢測SW620細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pri-miR-10a或載體對照的 SW620細(xì)胞的侵襲活性；圖2E用Matrigel侵襲實驗檢測SW620細(xì)胞、轉(zhuǎn)染靶定ACTGl的 siRNA (ACTGi-siR)、轉(zhuǎn)染靶定 MMP14 的 siRNA(MMP14_siR)和轉(zhuǎn)染對照siRNA(Ctrl-siR)的SW620細(xì)胞的侵襲活性；圖2F-1、圖2F-2用Matrigel侵襲實驗檢測miR-10a過表達對HT-29和THC8307 侵襲的影響(*p < 0.05 ； **p < 0.01)圖2G用實時定量PCR實驗證實pri-miR-1 Oa載體的有效性，將pri-miR-IOa 表達載體轉(zhuǎn)染到高轉(zhuǎn)移SW620、HT-29和THC8307細(xì)胞系，然后用實時定量PCR檢測 miR-10a表達水平，直方圖顯示miR-10a在這些細(xì)胞的相對表達水平；圖2H動物體內(nèi)實驗檢測miR-10a過表達對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)的作用，SW620細(xì) 胞分別轉(zhuǎn)染pri-miR-10a(SW620-pri-miR-10a)和載體對照(SW620_Ctrl)，各自注射到裸 鼠脾臟，圖中列出了形成兩組實驗裸鼠的肝臟轉(zhuǎn)移瘤裸鼠數(shù)、肝表面結(jié)節(jié)總數(shù)和肝重與 體重的比值。圖21脾臟注射分別轉(zhuǎn)染載體對照(1，2)和pri-miR-10a(3，4) SW620細(xì)胞的裸 鼠肝臟的大體觀察和H-E染色(200X)。在1組中的黑箭頭表示在肝臟表面的轉(zhuǎn)移結(jié)； 在2組中低分化SW620細(xì)胞圍繞大片壞死組織排列，腫瘤組織與肝組織邊界清晰可見； pri-miR-IOa處理的SW620細(xì)胞組僅出現(xiàn)很少的轉(zhuǎn)移灶(3，4)。(N 正常肝組織；M 轉(zhuǎn)移瘤組織。)圖3，miR-10a并不影響細(xì)胞的活性和增殖。細(xì)胞活性檢測；用2，甲氧基miR-10a ASO封閉SW480細(xì)胞的mir_10a(圖 3A)，在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pri-miR-10a使mir-lOa過表達(圖3B)，用MTT方法檢測
細(xì)胞活性，直方圖顯示三次獨立實驗A57tl均值士SD;細(xì)胞增殖活性檢測；用2，甲氧基miR-10a ASO封閉SW480細(xì)胞的mir_10a(圖 3C)，在SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pri-miR-10a使mir_10a過表達(圖3D)，用細(xì)胞生長曲線實 驗檢測細(xì)胞增殖活性。( Ρ~> 0. 05)圖2圖3表明，miR-lOa在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲而不是抑制細(xì)胞的生長。 裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pri-miR-lOa后，高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620形成轉(zhuǎn)移瘤 的能力明顯降低即miR-lOa在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明探討了 miR-lOa抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，通過靶位點預(yù)測 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-lOa可能的靶基因，并結(jié)合基因的功能，篩選出Yl-肌動蛋白(actin， gamma 1，ACTG1)和基質(zhì)金屬蛋白酶 14 (matrix metallopeptidase 14，MMP14)是miR-lOa
最可能的功能靶基因。在哺乳動物中，miRNA弓丨起mRNA的降解或翻譯抑制是通過與靶mRNA的 3’ UTR堿基配對并相互作用實現(xiàn)的，成熟mRNA的第2-8堿基是靶向識別的最重要區(qū) 域，因而被稱為種子區(qū)域。通過Targetscan數(shù)據(jù)庫分析我們找到了 miR-lOa與ACTGl和 MMP14的mRNA在3’ UTR上的功能結(jié)合位點，為了證實這一點，本發(fā)明采用熒光報告 載體實驗進行驗證，實驗表明與僅轉(zhuǎn)染EGFP表達載體相比，將帶有靶基因3’ UTR的 EGFP表達載體轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，熒光表達信號的強度顯著降低(圖4)。圖4A 從 TargetScan 數(shù)據(jù)庫獲得的 ACTGlmRNA 和 MMPHmRNA 的 3，UTR 與 miR-lOa互補序列；圖4B轉(zhuǎn)染各組熒光報告載體的SW480細(xì)胞中EGFP熒光強度的檢測結(jié)果；圖4C、圖4D封閉miR-lOa的SW480細(xì)胞EGFP熒光強度的檢測結(jié)果，在SW480 細(xì)胞中抑制 miR-lOa 會增加帶有 ACTGlmRNA 3，UTR 或 MMPHmRNA 3’ UTR 的EGFP的表達，而對帶有ACTGlmRNA突變的3’ UTR或MMPHmRNA突變的 3’ UTR的EGFP的表達沒有影響；圖4E、圖 4F 在過表達 miR-10a 的SW620 細(xì)胞中，帶有 ACTGlmRNA 3，UTR or或MMPHmRNA 3’ UTR的報告載體，EGFP的表達受到抑制，而帶有ACTGlmRNA 突變的3，UTR or或MMPHmRNA突變的3，UTR的報告載體，EGFP的表達不受影 響。(*p < 0.05 ； **p < 0.01 ； ρ> 0.05)圖5為miR-10a對靶基因表達的調(diào)節(jié)圖5中圖5A，圖5B分別在SW480細(xì)胞和SW620細(xì)胞中檢測的ACTGl禾口 MMP14表達，圖5A實時定量RT-PCR檢測結(jié)果，圖5B Western blotting檢測結(jié)果；圖5C、圖5D在SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染2’甲氧基miR_10a ASO或轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸 (Ctrl-ASO)后 ACTGl 和 MMP14 的表達，(C)實時定量 RT-PCR 檢測結(jié)果，(D) Western blotting 檢測結(jié)果。(*p < 0.05 ； **p < 0.01)實時定量PCR和Western blot檢測表明無論從mRNA水平還是蛋白水平， SW620細(xì)胞的ACTGl和MMP14表達都顯著高于SW480細(xì)胞；用2，甲氧基-miR-10a ASO封閉miR-10a SW480細(xì)胞的miR-10a，無論從mRNA水平還是蛋白水平ACTGl和
MMP14的表達均顯著上升。這就證明ACTGl和MMP14是miR-10a的直接靶基因。本發(fā)明探討了 ACTGl和MMP14的侵襲相關(guān)功能，分別合成ACTGl和MMP14 各自特異性的siRNA，轉(zhuǎn)染到SW620細(xì)胞以分別下調(diào)原來高表達的ACTGl和MMP14， 結(jié)果SW620細(xì)胞的侵襲活性大幅度地被抑制(圖2E)。這表明ACTGl和MMP14能夠增 加結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲活性；進而說明在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)中，這兩個基因是miR-lOa的 功能靶基因。綜合上述結(jié)果miR-lOa抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，它是通過下調(diào)靶基因 ACTGl和MMP14發(fā)揮作用的；在高轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細(xì)胞和肝轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者標(biāo)本中， miR-lOa是低水平表達的。因而通過檢測miR-lOa可以預(yù)測結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移性。并可以利 用miRNA-lOa來制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物。
權(quán)利要求
1.miRNA-lOa在制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，其特征是所述 miRNA-10a是序列表中SEQ IDNO 1所述的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述miRNA-lOa在制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用， 其特征是所述核苷酸序列為化學(xué)合成獲得或通過構(gòu)建真核細(xì)胞表達載體進行表達獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了miRNA-10a在制備抑制結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，所述miRNA-10a是序列表中SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。通過實驗表明與低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW480相比，miRNA-10a在高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株SW620是低水平表達的；Northern blot和實時定量PCR實驗也證明在高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株及臨床標(biāo)本中miRNA-10a也是低水平表達的；轉(zhuǎn)染pri-miR-10a提高SW620細(xì)胞miRNA-10a水平則使該細(xì)胞的侵襲活性顯著下降，在其它高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株也出現(xiàn)類似結(jié)果。實驗結(jié)果表明miRNA-10a在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲，在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
文檔編號C12N15/113GK102018965SQ20101028527
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者萬海英, 劉民, 劉濤, 吳海東, 李怡璇, 李欣, 湯華, 王芳 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)