Wtx穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種WTX穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞及其制備方法，其中WTX穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟：1)構(gòu)建沉默WTX的SHRNA的質(zhì)粒載體；2)以步驟1)所得的沉默WTX的SHRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞；3)以G418穩(wěn)定步驟2)所得的人結(jié)腸癌細(xì)胞。本發(fā)明所述的WTX穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞能夠更好的用于在結(jié)腸癌研究中。
【專利說(shuō)明】
WTX穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種WTX穩(wěn)定敲低SW480細(xì)胞及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] WTX(Wilm's tumor on X chromosome,又稱。411238、41631、05〔5)，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn) 定位于X染色體上的抑癌基因，于2007年首次在《Science》上被報(bào)道，其后，先后被證實(shí)在 Wilms瘤、合并有煩骨硬化癥的條紋狀骨病(OSCS)、白血病、腎上腺皮質(zhì)瘤、肝癌、胃癌中存 在不同程度突變，提示W(wǎng)TX可能在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但其在結(jié)直腸癌中的作 用目前尚未見報(bào)道，其對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、患者預(yù)后的影響尚處于未知。本研究旨在通 過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)合G418藥物篩選的方法構(gòu)建抑癌基因WTX穩(wěn)定敲低結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞系，為 進(jìn)一步研究抑癌基因rrx對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展的明確作用W及作用機(jī)制提供分子生物學(xué) 工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決如前提到的問(wèn)題，本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種rrx穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì) 胞的制備方法，其包括W下步驟：
[0004] 1)構(gòu)建沉默WTX的ShRNA的質(zhì)粒載體；
[0005] 2) W步驟1)所得的沉默WTX的ShRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞；
[0006] 3) WG418穩(wěn)定步驟2)所得的人結(jié)腸癌細(xì)胞。
[0007] 進(jìn)一步地，步驟1)的質(zhì)粒載體通過(guò)W下方法獲得：
[000引 la)設(shè)計(jì)ShRNA序列為：
[0009] Ib)用特異性快切酶快速雙酶切堿基序列(優(yōu)選地，酶切條件:37°C攝氏度，0.5~ 化），露出BamHI/Agel粘性末端，與同步雙酶切并純化后的GV112真核表達(dá)載體用Iigase buffer特效連接(優(yōu)選地，連接條件:22°C攝氏度，45min~化），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊(cè)a感受態(tài)細(xì) 菌，挑選陽(yáng)性克隆菌，測(cè)序鑒定。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟2)的轉(zhuǎn)染是通過(guò)W下步驟獲得：
[0011] 2a)測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建成功的陽(yáng)性克隆菌，大量搖菌進(jìn)行質(zhì)粒中量提取；
[0012]化)步驟2a)提取得到的質(zhì)粒用無(wú)菌DEPC7JC溶解，卵日離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 人直腸癌細(xì)胞中；
[0013] 優(yōu)選地，陽(yáng)離子脂質(zhì)體法中所用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體為lipofectimane2000。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟3)的穩(wěn)定是通過(guò)W下步驟獲得：
[0015] 3a)將步驟2)所得的轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，按50%~70%密度接種；
[0016] 3b)鋪板2地后，加入G418,細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%時(shí)可用含G418的培養(yǎng)基傳代繼續(xù)培養(yǎng)：
[0017] 3c)維持藥物濃度持續(xù)培養(yǎng)10~14天，并在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)終止篩選，得到 慢病毒穩(wěn)定感染的細(xì)胞株；
[001引優(yōu)選地，步驟3b)的G418的濃度為lOOOng/ml。
[0019] 進(jìn)一步地，所述的人結(jié)腸癌細(xì)胞為SW480細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了如前所述制備方法獲得的rrx穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì) 胞。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種干擾或沉默WTX基因的RNA，其序列為：
[0022] SiRNA 為：
[0023] 日'-TGCCCTATATGAGTTCTAT-3';
[0024] 5'-CAATAGTGATGAAGGTTAT-3';或 [00巧]5'-CTGACTTTCCAATCCTATA-3';或
[0026] SiRNA為雙鏈RNA，其序列為：
[0027] 5^-Ccggagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcacttttttg-3/ 和
[0028] 5^-曰曰ttc曰曰曰曰曰曰gtgccct曰t曰tg曰gttct曰tctcg曰g曰t曰g曰曰etc曰t曰t曰gggc曰Ct-S^ O
[0029] 本發(fā)明另一個(gè)方面提供了如前所述RNA在干擾或沉默WTX基因中的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為WQPCR篩選WTX最有效干擾片斷結(jié)果圖。
[0031] 圖2為^Western Blotting篩選WTX最有效干擾片斷結(jié)果圖。
[0032] 圖3為根據(jù)WTX SiRNA-I設(shè)計(jì)ShRNA載體序列
[0033] 其中，第一行中的CCgg為限制性內(nèi)切酶AgeI酶切位點(diǎn)，第二行中的aattcaaaaa為 限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點(diǎn)。
[0034] 圖4為^Western Blotting驗(yàn)證SW480細(xì)胞中WTX沉默效率結(jié)果圖。
[00巧]圖5為WQPCR驗(yàn)證SW480細(xì)胞WTX沉默效率結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1WTX干擾S iRNA序列的設(shè)計(jì)
[0037] WTX的CDS區(qū)全長(zhǎng)3405bp，編碼1135AA，在CDS區(qū)散在選取3個(gè)位點(diǎn)作為SiRNA的目標(biāo) 祀點(diǎn)。在各位點(diǎn)逐個(gè)堿基之間前后移動(dòng)進(jìn)行序列篩選，保證所選3條SiRNA祀序列長(zhǎng)度19~ 2化P，GC含量在40%~50%左右，并逐條經(jīng)過(guò)NCBI blast比對(duì)，檢測(cè)序列的特異性，驗(yàn)證是 否為人類其它基因的同源序列。同時(shí)選用RNAi設(shè)計(jì)時(shí)公認(rèn)的scramble序列作為對(duì)照，對(duì)照 序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，使用前再次b 1 as t比對(duì)驗(yàn)證與WTX基因是否有同源性。將所選3 條SiRNA及1條scramble序列，聯(lián)系廣州維真生物技術(shù)公司進(jìn)行化學(xué)合成。
[0038] 設(shè)計(jì)3條WTX干擾片段，序列如下：
[0039] ^乂干擾片段1序列（313臟1)5'-16〔(：口'41416461'1'押41'-3'
[0040] WTX干擾片段2序列（siRNA2)5' -CAATAGTGATGAAGGTTAT-3'
[0041 ] WTX干擾片段3序列（siRNA3)5' -CTGACTTTCCAATCCTATA-3'
[0042] Scramb 1 e 序列 5 ' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '
[0043] 實(shí)施例2WTX SiRNA片段轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞
[0044] 將siRNAl-3及scramble片段按照Inmol :50ul DEPC水混勻稀釋，配制成lOiiM/L的 工作液，-200°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)生 長(zhǎng)24h后，待細(xì)胞密度約50%-70%時(shí)，使用lipofectamine2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。獲得Si-I、Si-2和Si-3細(xì)胞W及對(duì)照細(xì)胞(con化ol或NC)，其中Si-I是WsiRNAl進(jìn)行干 擾后獲得的細(xì)胞，Si-2是WsiRNA2進(jìn)行干擾后獲得的細(xì)胞，Si-3是WsiRNA3進(jìn)行干擾后獲 得的細(xì)胞，對(duì)照細(xì)胞是^scramble片斷進(jìn)行干擾的細(xì)胞。
[0045] 實(shí)施例3QPCRW及Western blotting檢測(cè)并篩選最有效干擾片段
[0046] 細(xì)胞經(jīng)過(guò)SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后4她，收集六孔板內(nèi)各組目的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞，用PBS 清洗目的細(xì)胞W及對(duì)照組細(xì)胞各2次，加入Trizol逐級(jí)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA， QPCR分析目的細(xì)胞W及對(duì)照細(xì)胞中WTX相對(duì)表達(dá)量。QPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用柱狀圖形式表示， 通過(guò)柱狀圖的高低直接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)含量，我們選取柱狀圖結(jié)果最低的細(xì)胞組所 對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染的SiRNA為WTX最有效干擾SiRNA,因此篩選得至IjWTX最有效干擾序列。QPCR實(shí)驗(yàn)W GAPDH做內(nèi)參。所用引物序列：
[0047] WTX:sense:5' -GACCCAAAAGGATGAAGCT-3';
[0048] antisense:5'-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3'，
[0049] GAP畑：sense: 5^TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3';
[0050] antisense:5' -CCATTGATGACAAGCTTCCCG-3'。
[0051 ] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見附圖1。通過(guò)數(shù)值的對(duì)比可知，siRNAl、siRNA2、siRNA3能夠降低WTX 的表達(dá)，其中SiRNAl相比于對(duì)照組降低最多，能夠達(dá)到40%左右。
[0052] 分別收集六孔板內(nèi)經(jīng)過(guò)SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的各組目的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞，提取細(xì)胞 全蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用lysis buffer調(diào)整各組樣品濃度至相近水平，按比例加入 loading buffer，煮沸變性蛋白質(zhì);配置10%的SDS-PAGE膠，在膠內(nèi)各泳道中，按順序?qū)⑻?理好的蛋白樣品各30ug進(jìn)行加樣并分離電泳，電泳后切取目的條帶濕法轉(zhuǎn)至0.22um PVDF 膜，5 %的脫脂奶粉室溫封閉化，一抗4 °C解育過(guò)夜，PBST清洗5min巧次，辣根酶標(biāo)記的二抗 室溫解育化，PBST清洗5min巧次，E化曝光觀察，對(duì)比曝光條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見附圖2。因?yàn)闂l 帶的粗細(xì)W及密度可W直接反應(yīng)內(nèi)參齊平的條件下，細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)含量。我們選 取曝光條帶最弱的泳道SiRNAl,對(duì)應(yīng)得到該組樣品所轉(zhuǎn)染的SiRNA序列，該序列即為所有用 的SiRNA中，可W對(duì)WTX最有效干擾的序列。綜上方法，我們選取得到干擾效果最強(qiáng)的SiRNAl 條帶。WGAPDH做內(nèi)參。
[0053] 實(shí)施例4shRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建與測(cè)序
[0054] 篩選最有效的SiRNA片段，W祀標(biāo)序列為主鏈，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，設(shè)計(jì)SiRNA 序列所對(duì)應(yīng)的"互補(bǔ)片段"。W此特異性SiRNA祀標(biāo)序列W及其"互補(bǔ)片段"為環(huán)狀RNA的兩端 "枝干"，在片段中間插入構(gòu)建環(huán)狀RNA所特需的6堿基"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)，"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)堿基序列選 用結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的乂 TCGAG"序列。設(shè)計(jì)好ShRNA莖環(huán)與枝干主體結(jié)構(gòu)后，在枝干兩端插入EcoRI/ AgeI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列，化學(xué)合成法逐個(gè)堿基合成設(shè)計(jì)好的的雙鏈Oligo序列。 [0055] 其中ShRNA序列為:ShRNA為雙鏈RNA，序列為：
[0056] 5^-Ccggagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcacttttttg-3/和
[0057] 5^-aattcaaaaaagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcact-3^
[OO5引用特異性快切酶快速雙酶切堿基序列（酶切條件：37°C，0.5~Ih)，露出BamHI/ AgeI粘性末端，與同步雙酶切并純化后的GVl 12真核表達(dá)載體用Iigase buffer特效連接 (連接條件：22°C，45min~化），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)菌，挑選陽(yáng)性克隆菌，搖菌后菌 液測(cè)序鑒定。
[0059] 實(shí)施例5shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞
[0060] 將測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建成功的陽(yáng)性克隆菌，大量搖菌進(jìn)行質(zhì)粒中量提取，所提取質(zhì) 粒用無(wú)菌DEPC水溶解，測(cè)定質(zhì)粒濃度，用Iipof ectimane2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌 SW480細(xì)胞。
[0061 ] 實(shí)施例6G418篩選濃度測(cè)定W及篩選得到WTX感染穩(wěn)定株
[0062] W未經(jīng)轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌裸細(xì)胞SW480對(duì)G418最佳用藥濃度進(jìn)行篩選，將結(jié)直腸癌 細(xì)胞接種于24孔板，待次日細(xì)胞密度達(dá)50%~70%時(shí)，更換培養(yǎng)基并加入濃度分別為 500叫/1111，800雌/1111，1000叫/1111，2000叫/1111，3000叫/1111的6418開始篩選，^10~14天內(nèi)細(xì) 胞全部死亡的最低濃度定為最佳篩選濃度。篩選結(jié)果確定G418最佳用藥濃度為lOOOng/ml。
[0063] 將ShRNA轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，按50 %~70 %密度接種于六孔板，鋪板24h 后，按比例加入濃度為lOOOng/ml的G418,細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%時(shí)可用含G418的培養(yǎng)基傳代繼續(xù) 培養(yǎng)，維持藥物濃度持續(xù)培養(yǎng)10~14天，并在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)可終止篩選。得到WTX 被穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株SW480. shW。
[0064] 實(shí)施例7QPCR驗(yàn)證細(xì)胞株mRNA水平表達(dá)變化
[0065] 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后4她，用PBS清洗目的細(xì)胞W及對(duì)照組細(xì)胞各2次，加入化izol逐級(jí) 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，QPCR分析目的細(xì)胞W及對(duì)照細(xì)胞中WTX相對(duì)表達(dá)量。 GAPDH做內(nèi)參。所用引物序列：
[0066] WTX:sense:5' -GACCCAAAAGGATGAAGCT-3';
[0067] antisense:5'-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3'，
[0068] GAP畑：sense: 5' -TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3';
[0069] antisense:5' -CCATTGATGACAAGCTTCCCG-3'。
[0070] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見附圖5
[0071] 實(shí)施例SWestern blotting驗(yàn)證細(xì)胞株蛋白水平表達(dá)變化
[0072] 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后72h，收集目的W及對(duì)照組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，western blotting檢測(cè)驗(yàn)證目的細(xì)胞W及對(duì)照細(xì)胞株中WTX的相對(duì)表達(dá)量，GAPDH做內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 參見附圖4,對(duì)比兩條泳道內(nèi)電泳條帶，根據(jù)條帶的粗細(xì)W及密度，可W得到在內(nèi)參齊平的 條件下，SW480. ShW細(xì)胞內(nèi)WTX蛋白表達(dá)豐度明顯低于未經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞，條帶明顯變淡、變 細(xì)、密度減低。結(jié)果表明本發(fā)明的細(xì)胞株W T X的相對(duì)表達(dá)量相比于對(duì)照組有明顯降低， SW480. ShW細(xì)胞系中幾乎不含有WTX。
[0073] 實(shí)現(xiàn)在WTX內(nèi)源性表達(dá)較高的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)，穩(wěn)定敲低抑癌基因WTX，構(gòu)建 SW480. ShW細(xì)胞系，為后續(xù)研究WTX生物學(xué)功能提供分子工具。



【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種WTX穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟： 1) 構(gòu)建沉默WTX的ShRNA的質(zhì)粒載體； 2) 以步驟1)所得的沉默WTX的shRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞； 3) 以G418穩(wěn)定步驟2)所得的人結(jié)腸癌細(xì)胞。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟1)的質(zhì)粒載體通過(guò)以下方法獲得： la) 設(shè)計(jì)shRNA序列為： lb) 用特異性快切酶快速雙酶切堿基序列（優(yōu)選地，酶切條件：37°C攝氏度，0.5~Ih)， 露出BamHI/Agel粘性末端，與同步雙酶切并純化后的GV112真核表達(dá)載體用ligase buffer 特效連接(優(yōu)選地，連接條件：22°C攝氏度，45min~Ih)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，挑 選陽(yáng)性克隆菌，測(cè)序鑒定。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，步驟2)的轉(zhuǎn)染是通過(guò)以下步驟獲 得： 2a)測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建成功的陽(yáng)性克隆菌，大量搖菌進(jìn)行質(zhì)粒中量提取； 2b)步驟2a)提取得到的質(zhì)粒用無(wú)菌DEPC水溶解，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人直 腸癌細(xì)胞中； 優(yōu)選地，陽(yáng)離子脂質(zhì)體法中所用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體為lip〇fectimane2000。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，步驟3)的穩(wěn)定是通過(guò)以下步驟獲 得： 3a)將步驟2)所得的轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，按50 %~70 %密度接種； 3b)鋪板24h后，加入G418，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90 %時(shí)可用含G418的培養(yǎng)基傳代繼續(xù)培養(yǎng)： 3c)維持藥物濃度持續(xù)培養(yǎng)10~14天，并在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)終止篩選，得到慢病 毒穩(wěn)定感染的細(xì)胞株； 優(yōu)選地，步驟3b)的G418的濃度為1000ng/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其中，所述的人結(jié)腸癌細(xì)胞為SW480細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述制備方法獲得的WTX穩(wěn)定敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞。7. -種干擾或沉默WTX基因的RNA，其序列為： si RNA 為： 57-TGCCCTATATGAGTTCTAT-37 ； Y-CAATAGTGATGAAGGTTAT-3';或 5'-CTGACTTTCCAATCCTATA-3';或 shRNA 為： 57-Ccggagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcacttttttg-3 7 和 57-aattcaaaaaagtgccctatatgagttctatctcgagatagaactcatatagggcact-3 7 〇8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的RNA在干擾或沉默WTX基因中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK105925529SQ201610421093
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】張慶玲, 馬文霞, 劉霞
【申請(qǐng)人】南方醫(yī)科大學(xué)