專利名稱：人乳頭瘤病毒16和18型l1蛋白在昆蟲細胞中的表達及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，且涉及人乳頭瘤病毒16和18型Ll蛋白在昆蟲細胞中的表達及其疫苗制備方法。
背景技術：
世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計資料表明，宮頸癌是嚴重危害婦女健康的侵染性疾病，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，居全世界女性惡性腫瘤第二位，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年約有50萬名婦女罹患宮頸癌，且有將近30萬名婦女死于宮頸癌，其中，80%的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國現(xiàn)有宮頸癌病人約13. 8萬，每年約有5萬人死于宮頸癌，且發(fā)病率呈逐年上升、年輕化的趨勢。在1995年，WHO已將人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染確定為宮頸癌的致病病因。幾乎所有的宮頸癌都由HPV引起，其中高達99. 7%的宮頸癌患者都存在HPV 感染，且超過2/3的宮頸癌病例由HPV 16型和18型引起。人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，其具有高度的特異性。HPV是一組病毒的總稱，其組成一個科，其中各病毒的形態(tài)類似，但DNA限制性內(nèi)切酶圖譜不同，核殼體蛋白質(zhì)的抗原性不同。目前已經(jīng)確定的HPV型別大約有160余種，依其感染的上皮所在的部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，其中大約35種型別可感染婦女生殖道，大約20種與腫瘤相關。依據(jù)HPV導致腫瘤的危險性的高低，將HPV分為低危險型別HPV和高危險型別HPV。低危險型別HPV包括HPV6、11、42、43、44等型別，其通常引起外生殖器濕疣等良性病變，包括宮頸上皮內(nèi)低度病變(CINI)。高危險型別HPV包括HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等型別。高危險型別 HPV，特別是 HPV16 和 18 型， 與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN II/III)的發(fā)生相關。近十幾年來，HPV疫苗研究可以分為兩類，即預防性疫苗研究和治療性疫苗研究。 預防性疫苗一般以HPV16主要衣殼蛋白Ll和次要衣殼蛋白L2為靶抗原，其作用在于誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性的中和抗體和有效的局部免疫應答，以阻止HPV的長期感染和再感染。HPV 的衣殼蛋白在真核以及原核表達系統(tǒng)中表達時，能自我裝配或形成病毒樣顆粒(VLP)，其結構和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似。VLP能與細胞受體結合并進入細胞，從而有利于抗原的加工呈遞以及誘發(fā)較強的細胞免疫。治療性疫苗通常是以經(jīng)修飾的HPV16早期蛋白(其轉(zhuǎn)化活性被去除，但仍保留抗原性)作為靶抗原，它可誘導特異性的細胞免疫應答， 從而可用于控制或消除感染HPV的良性和惡性病灶，并可作為這類疾病的手術后的輔助治療。在大多數(shù)與HPV16相關的宮頸癌及其癌前病變中，HPV16的E6和E7蛋白持續(xù)表達，而這種持續(xù)表達是腫瘤細胞轉(zhuǎn)化和維持惡性特征所必需的，并且正常組織中不存在這兩種蛋白。因此，E6和E7蛋白為用于HPV16相關宮頸癌及癌前病變的治療性疫苗的理想靶抗原。 針對中晚期宮頸癌病人手術后殘留的腫瘤細胞，可應用這種治療性疫苗，以通過激發(fā)病人的細胞免疫來殺傷、清除這些腫瘤細胞和已感染的上皮細胞，從而防止或限制腫瘤的復發(fā)和擴散。預防性和治療性HPV疫苗的作用也有交叉。例如，在良性疣和輕度CIN病變中存在HPV晚期蛋白的表達，因此，預防性疫苗對這些疾病也有一定治療作用。近年來研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等，同時具備預防和治療雙重作用。HPV疫苗在預防導致宮頸癌的持續(xù)性感染方面，有效率達到100%，它能將宮頸癌發(fā)生率降低75%，安全性好。目前國際上已有多個HPV16候選疫苗進入I/II期臨床試驗， 這種疫苗將會拯救成千上萬的婦女的生命，因此對婦女的健康產(chǎn)生重大影響。默克公司于1991年從澳大利亞CSL公司獲得專利授權，通過使用釀酒酵母表達， 制備了針對HPV 6、11、16和18型的四價HPV疫苗。而葛蘭素史克公司的HPV疫苗技術來源于Medlmmune公司，該疫苗為2價疫苗，商品名為“Cervarix”(預防16、18型)，其使用昆蟲細胞進行表達。這兩種疫苗均可以迅速使受試動物產(chǎn)生對HPV病毒的中和抗體，并且對人畜安全，能夠有效預防治療HPV病毒所導致的各種疾病，特別是梅毒和宮頸癌。這些技術已在國際權威專業(yè)雜志上公開發(fā)表、部分內(nèi)容已經(jīng)獲得美國等多個國家專利保護。瑞士洛桑大學研究人員最近研究出一種治療宮頸癌的噴霧劑疫苗，其效果與注射疫苗相同。通過吸入該噴霧劑疫苗，可以刺激并產(chǎn)生針對這種病毒的抗體，其效果與注射疫苗一樣。這種噴霧劑使用方便，療程短。病人只需使用兩次，其間間隔2周，而注射疫苗需要注射3次，并且耗時6個月。2004年還報道，一種基于7種人乳頭瘤病毒(HPV)的有效疫苗可以預防全球的多數(shù)宮頸癌。然而，它的費用很高，而且針對一些不太常見的HPV亞型，其提供的保護作用也很難清楚地證實。考慮到成本問題，針對2種(HPV16U8)或3種(HPV16、18和45)最常見亞型的疫苗可能更便宜，也更現(xiàn)實。特別地，抗HPV16和HPV18的疫苗非常有意義，因為其可以預防70%的宮頸癌。為此，本發(fā)明基于我國流行的高致病性HPV16/18型毒株的Ll蛋白氨基酸序列，開發(fā)了新的HPV16/18 二價疫苗的制備方法，其對于大規(guī)模生產(chǎn)HPV16/18 二價疫苗以及對于我國婦女的宮頸癌預防具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
人乳頭狀瘤病毒的主要衣殼蛋白Ll基因在原核和真核表達后能夠自我裝配或形成病毒樣顆粒(VLP)，從而能與細胞受體結合誘發(fā)細胞免疫。因此，Ll蛋白是預防宮頸癌的最有價值的靶抗原。本發(fā)明以我國流行的高致病性HPV 16和18兩種亞型的主要衣殼蛋白 Ll基因作為研究對象，開發(fā)了新的HPV16/18 二價疫苗的制備方法。利用該方法，本發(fā)明實現(xiàn)了 HPV 16和HPV 18的主要衣殼蛋白Ll的高表達，并且獲得了生物學性狀較好的VLP，其具有優(yōu)良的抗原性和免疫原性，對于大規(guī)模生產(chǎn)HPV16/18 二價疫苗以及對于我國婦女的宮頸癌預防有重要的現(xiàn)實意義。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了制備針對人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18的二價疫苗的方法，其包括以下步驟1)分別優(yōu)化HPV16和HPV18的Ll蛋白的基因序列；2)將步驟1)中優(yōu)化后的基因序列分別克隆入桿狀病毒表達載體，以獲得重組質(zhì)粒；3)用所述重組質(zhì)粒，與相應的桿狀病毒基因組一起，分別轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，以獲得重組桿狀病毒；4)用所述重組桿狀病毒分別感染新鮮培養(yǎng)的昆蟲細胞；5)從步驟4)的昆蟲細胞分別分離純化HPV16和HPV18的Ll蛋白，并將其與佐劑混合制備成二價疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，HPV16和HPV18的Ll蛋白的優(yōu)化后的基因序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法所使用的桿狀病毒表達載體是PAcSG2，所使用的桿狀病毒基因組是桿狀病毒基因組AcNPV。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法所使用的昆蟲細胞選自Sf-9細胞、Sf-21 細胞和High Five細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法將分離純化的HPV16和HPV18的Ll蛋白吸附至佐劑上，以制備二價疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法所使用的佐劑優(yōu)選選自氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑。在一個方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含HPV16和HPV18的Ll蛋白的優(yōu)化后的基因序列。優(yōu)選，本發(fā)明的分離的核酸分子包含SEQ ID NO. 1或2所示的序列。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分離的核酸分子的載體。優(yōu)選，本發(fā)明的載體是表達載體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的載體適合于在昆蟲細胞例如Sf-9細胞、Sf-21細胞或High Five細胞等中表達，其優(yōu)選是桿狀病毒表達載體，更優(yōu)選是pAcSG2。在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分離的核酸分子或載體的細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的細胞是昆蟲細胞，優(yōu)選Sf-9細胞、Sf-21細胞或High Five細胞。在一個方面，還提供了本發(fā)明的分離的核酸分子用于制備二價疫苗的用途，所述二價疫苗用于預防HPV16和HPV18的感染。在一個方面，還提供了本發(fā)明的分離的核酸分子用于制備HPV16和HPV18的Ll蛋白的用途。發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術方案具有以下有益效果(1)所制備的疫苗針對我國流行的高致病性HPV16/18型毒株的Ll蛋白氨基酸序列，有助于對我國婦女的宮頸癌預防；(2)在疫苗的制備過程中，對HPV16/18L1蛋白的基因序列進行了優(yōu)化，有助于提高Ll蛋白在昆蟲細胞中的表達水平，從而對于大規(guī)模生產(chǎn)HPV16/18 二價疫苗以及對于HPV 疫苗的臨床應用具有重要的現(xiàn)實意義。下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得顯然。附圖概述

圖1顯示pVL16-Ll和pVL18_Ll的雙酶切鑒定。其中，泳道1為DNA分子量標準； 泳道2為pVL16-Ll的Β ο I和Nco I雙酶切產(chǎn)物；泳道3為pVL18_Ll的Β ο I和Nco I 雙酶切產(chǎn)物。
圖2顯示重組病毒的PCR擴增產(chǎn)物的酶切鑒定。其中，泳道1為DNA分子量標準； 泳道2為rBV16的基因組PCR擴增產(chǎn)物；泳道3為rBV18的基因組PCR擴增產(chǎn)物。圖3顯示rBV16表達的HPV16 Ll蛋白的SDS-PAGE鑒定。其中，泳道1為Sf_9細胞裂解液對照；泳道2和3均為rBV16感染的Sf_9細胞的裂解液；泳道4為蛋白分子量標準。圖4顯示rBV18表達的HPV18 Ll蛋白的SDS-PAGE鑒定。其中，泳道1為Sf_9細胞裂解液對照；泳道2、3、4和5均為rBV18感染的Sf_9細胞的裂解液；泳道6為蛋白分子
量標準。圖5顯示純化的HPV16/18 Ll蛋白的SDS-PAGE鑒定。其中，泳道1為蛋白分子量標準；泳道2為純化的HPV16 Ll蛋白；泳道3為純化的HPV18 Ll蛋白。圖6是HPV16/18 Ll的透射電鏡照片。其中，圖6A顯示HPV16 Ll的VLP ；圖B顯示 HPV18 Ll 的 VLP。圖7顯示HPV16/18 Ll蛋白的Western印跡鑒定。其中，泳道1為蛋白分子量標準；泳道2為HPV16 Ll蛋白；泳道3為Sf_9細胞對照；泳道4為HPV18 Ll蛋白；泳道5為 Sf-9細胞對照。圖8顯示制備的假病毒感染細胞后的細胞內(nèi)熒光。
具體實施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說明但不限定本發(fā)明的實施例來描述本發(fā)明。實施例1. HPV16/18的Ll蛋白的基因序列的優(yōu)化我國流行的高致病性HPV16和HPV18型毒株的Ll蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 7和8所示。使用市售可得的軟件OptimumGene 對HPV16和HPV18型的Ll基因序列進行優(yōu)化，以提高Ll基因在昆蟲細胞中的表達水平。其中，優(yōu)化后的HPV16 Ll基因序列如SEQ ID NO. 1所示；優(yōu)化后的HPV18 Ll基因序列如SEQ ID NO. 2所示。實施例2. PVL16-L1和pVL18_Ll轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的構建利用引物對5' -CTC GAG GAA TTC AGG ATG CAA GTG ACG TTTATT-3 ‘ (SEQ ID NO. 3)禾口 5' -A GAG CTC CCA TGG AGG TTA CM CTTGCG TTT CTT-3 ‘ (SEQ ID N0. 4)，以及引物對 5' -CTC GAG GAA TTCAGG ATG TGC TTG TAC ACG CGC-3 ‘ (SEQ ID N0. 5)禾口 5' -A GAG CTCCCA TGG AGG TTA TTT GCG AGC TCT CAC G_3' (SEQ ID NO. 6)，通過PCR分別擴增人工合成的經(jīng)優(yōu)化的HPV16型和HPV18型Ll基因。PCR反應條件為95°C預變性5分鐘；30 個循環(huán)的95°C變性30秒，55°C退火45秒，72°C延伸2分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增后，獲得兩端分別帶有》ιο I和Nco I限制性內(nèi)切酶酶切位點的Ll基因片段。使用商購可得的Bio I和Nco I (例如購自寶生物工程(大連)有限公司)對Ll 基因片段和桿狀病毒載體pAcSG2 (來源于美國BD公司的試劑盒，BD BacuIoGoId , 560129) 分別進行雙酶切，于37°C進行3小時(IygW Ll基因片段或pAcSG2載體，加入IOU Xho I 和lOUNco I)。將酶切后的Ll基因片段分別插入到同樣經(jīng)過Β ο I和NcoI酶切的桿狀病毒載體pAcSG2中。連接的反應體系為L1基因片段100yg，pAcSG2載體150yg，T4DNA連接酶IU ；反應條件為16°C連接過夜。用連接后的載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)，然后經(jīng)克隆篩選、增菌培養(yǎng)和質(zhì)粒抽提獲得包含目的基因片段的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。所獲得的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒通過Xho I和Nco I雙酶切進行鑒定。如圖1所示，獲得了包含目的基因片段的重組質(zhì)粒HPV16Ll_pAcSG2 (簡稱 PVL16-L1)和 HPV18Ll-pAcSG2 (簡稱 pVL18_Ll)。實施例3.重組桿狀病毒的制備將pVL16-Ll和pVL18_Ll重組質(zhì)粒分別與AcNPV基因組DNA(來源于美國BD公司的試劑盒，BD BaculoGold , 560129) 一起共轉(zhuǎn)染Sf_9細胞(購買自美國hvitrogen公司)。在27°C下培養(yǎng)4天后，在鏡下觀察到轉(zhuǎn)染后的細胞體積增大。培養(yǎng)5天后，收集細胞培養(yǎng)上清液(其中分別含有重組病毒rBV16和rBV18)。將細胞上清液分別接種到新鮮培養(yǎng)的 Sf-9細胞，在27°C下培養(yǎng)3天。取培養(yǎng)上清液再傳代一次。之后，取培養(yǎng)上清液，加入等體積的2X沉淀液(含20% PEG6000UM NaCl)，在4°C混合過夜。然后在4°C下，以13000rpm 將混合物離心30分鐘，并棄去上清液。所得的沉淀用100 μ 1無菌水重懸浮，并加入5U蛋白酶K，在50°C消化過夜。向消化物中加入等體積的酚/氯仿，振蕩混和，并以13000rpm離心10分鐘；取上清液，加入等體積的氯仿，振蕩混和，再次以13000rpm離心10分鐘；取上清液，加入1/10體積的3M NaAc和0.6X的異丙醇，并于_20°C放置15分鐘。然后在4°C 下以13000rpm離心10分鐘，并棄去上清液。所得的沉淀用預冷的70%乙醇洗滌2次，然后在室溫下干燥10分鐘。干燥后，沉淀用50 μ 1無菌水懸浮，從而獲得重組病毒rBV16和 rBV18的基因組。取5 μ 1重組病毒基因組，并分別用特異性引物對SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4，以及SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6進行PCR鑒定。PCR反應條件如下95°C預變性5 分鐘；30個循環(huán)的95°C變性30秒，55°C退火45秒，72°C延伸2分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR鑒定的結果表明，重組病毒rBV16和rBV18的基因組中分別含有大小為1600bp的 HPV16 Ll和大小為1700bp的HPV18 Ll的目的片段(參見圖2)。收集被感染的Sf-9細胞，加入細胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) ； 15mmol/ L NaCl ；0. lmmol/L PMSF ；0. 1% NP40 ；5mmol/LEDTA)進行裂解。將 100 μ 1 細胞裂解物和 100 μ 1 2Χ 蛋白上樣緩沖液(IOOmmol/L Tris HCl (ρΗ 6.8) ；200mmol/L DTT ；8 % SDS ； 0. 02%考馬斯亮藍R-250 甘油)混合，并沸水浴10分鐘。然后取10 μ 1樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE電泳，并進行考馬斯亮蘭染色，以檢測目的蛋白是否表達。 結果顯示，重組病毒rBV16和rBV18分別表達分子量為59. 4KD的HPV16 Ll蛋白和分子量為63. 7KD的HPV18 Ll蛋白(參見圖3和4)。進一步通過軟件Quatity 0ne(Bio_Rad公司)進行分析，結果表明，表達的HPV16 Ll蛋白占全部Sf-9細胞總蛋白的9. 8% (參見圖 3)，表達的HPV18 Ll蛋白占全部Sf-9細胞總蛋白的6. 5% (參見圖4)。實施例4. HPV16/18 Ll蛋白的分離純化向培養(yǎng)96小時的感染重組桿狀病毒的昆蟲細胞中加入細胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) ； 15mmol/L NaCl ；0. lmmol/L PMSF ；0. 1% NP40 ；5mmol/L EDTA)，超聲波破碎細胞，并于4°C以IOOOOg離心15分鐘，去除細胞碎片。以IOOOOOg 4°C離心上清液90 分鐘。將所得的沉淀重懸于緩沖液A(50mM Tris,ρΗ 8.0 ；IM NaCl ；IOmMMgCl2 ；IOmM CaCl2 ； 2mM PMSF ； 10ug/ml Leupeptin)中，然后加入5. 2克的固體CsCl，并用緩沖液A將體積調(diào)整到13ml (CsCl終濃度為0. 4g/ml)，進一步以IOOOOOg 4°C離心22小時，得到經(jīng)純化的HPV16 和HPV18 Ll蛋白。所得的蛋白通過SDS-PAGE進行鑒定，結果示于圖5中。
也可通過蔗糖密度梯度離心純化HPV16和HPV18L1蛋白。重組蛋白帶出現(xiàn)在 50-60%的蔗糖密度梯度上。具體的純化方法如下將上清液鋪于30%的蔗糖溶液(溶于 TBS中)上，以150000g，4°C離心6小時；獲得的沉淀用50mM Tris-IOOmM NaCl重懸浮，并鋪于20% -60%的蔗糖密度梯度溶液(溶于50mM Tris-IOOmM NaCl中)上，以150000g， 4°C離心22小時；吸出目的灰白區(qū)帶，并用緩沖液A稀釋，然后通過100000g，4°C離心90分鐘來沉淀純化的HPV16/18 Ll蛋白。實施例5. HPV16/18 Ll蛋白的形杰觀察取經(jīng)純化的HPV16/18 Ll蛋白液，滴銅網(wǎng)，用2%磷鎢酸染色，并通過透射電鏡進行觀察。結果表明，HPV16/18 Ll蛋白呈現(xiàn)為病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLP)，其直徑約為52nm(參見圖6)。實施例6.通過Western印跡來檢測重組HPV16/18 Ll蛋白分別使用抗HPV16 Ll 抗體(來源于 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY 公司，sc-18052) 和抗HPV18L1抗體(來源于abeam公司，ab31492)，通過^festern印跡來檢測純化后的HPV16 和HPV18 Ll蛋白。Western印跡結果顯示，分子量為59. 4KD的HPV16 Ll和分子量為63. 7KD 的HPV18 Ll蛋白的特異性蛋白帶(參見圖7)，這表明所表達的HPV16和HPV18 Ll蛋白具有良好的抗原性。實施例7.用重組HPV16/18 Ll蛋白免疫動物用Bio-Rad Protein Assay試劑盒定量純化的HPV16和HPV18 Ll蛋白。分別將 0. lyg、2yg或20yg的HPV16 Ll蛋白和HPV18 Ll蛋白吸附至0. 5mg Al (OH)3，以制備成三種劑量的HPV 二價疫苗。使用制備的HPV 二價疫苗，分別于0、2、4周通過肌肉注射來免疫Balb/c小鼠三次。最后一次免疫后三天，處死小鼠，并收集血清。實施例8. HPV16/18假病毒顆粒的制備分別將HPV16 和 HPV18 的 Ll 和 L2 基因(HPV16 L2 的 GeneBank 登錄號 AF084952， HPV18 L2 的 GeneBank 登錄號 DQ003068)克隆入 pcDNA3. 1 載體(購自 hvitrogen 公司)，以構建 pcDNA3. 1-16L1、pcDNA3. 1-16L2、pcDNA3. 1-18L1 和 pcDNA3. 1-18L2 重組載體。將pcDNA3. 1-16L1和pcDNA3. 1-16L2共轉(zhuǎn)染細胞(購買于美國ATCC)；將 pcDNA3. 1-18L1和pcDNA3. 1-18L2共轉(zhuǎn)染細胞。所得的細胞在37°C培養(yǎng)3-5天。收獲細胞并反復凍融三次，進行氯仿抽提，并收集上清液。所得的上清液即為HPV16假病毒 (pseudovirus 16，psV16)和 HPV18 假病毒(pseudovirus 18，psV18)顆粒，凍存?zhèn)溆?。?96孔板培養(yǎng)的細胞上對制備的假病毒psV16和psV18進行滴度測定。簡言之，取假病毒種子液進行10倍系列稀釋，每個稀釋度接種8個培養(yǎng)孔；接種后的細胞在37°C培養(yǎng)5 天，然后于熒光顯微鏡下觀察每個培養(yǎng)孔的細胞內(nèi)的熒光(參見圖8)，計算假病毒的滴度。實施例9. HPV16/18 Ll蛋白的免疫原性分析用純化的HPV16/18 Ll蛋白(于碳酸鹽緩沖液中)過夜4°C包被96孔板。然后用PBST (PBS溶液+0. 5% Tween-20)溶液洗滌板三次，加入PBS稀釋的小鼠血清，37°C孵育 1小時。孵育后，用PBST溶液洗滌板三次，加入HRP標記的抗小鼠IgG抗體(購買于KPL 公司)，37°C孵育1小時。孵育后，用PBST溶液洗滌板三次，加入OPD底物顯色液(檸檬酸 0. 51%, Na2HPO4 ‘ 12H20 1.84%，鄰苯二胺(OPD)0. 05%，Η2&50 μ 1)，避光顯色 10 分鐘。之后用2Ν H2SO4終止反應，并用酶標儀(BI0-RAD公司)測定492nm處的OD值。結果顯示，HPV16/18 Ll蛋白可以誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，這表明重組HPV16/18 Ll蛋白具有良好的免疫原性(參見表1)。將小鼠血清按1 500稀釋，將稀釋液分別與100PFU的假病毒psV16和psV18混和，并在37°C溫育1小時。溫育后，將假病毒加入到單層的細胞上，并在37°C吸附1 小時。吸附后，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)細胞7天。最后，通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)的熒光。結果顯示，抗HPV16/18 Ll蛋白的小鼠血清可以與假病毒psV16和psV18結合，并抑制假病毒進入細胞內(nèi)產(chǎn)生熒光，這表明小鼠血清中含有抗HPV16/18 Ll蛋白的中和抗體，其能夠保護機體免受HPV16/18型病毒的感染(參見表2)。表1. HPV16 Ll疫苗的免疫原性測定
權利要求
1.制備針對人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18的二價疫苗的方法，其包括以下步驟1)分別優(yōu)化HPV16和HPV18的Ll蛋白的基因序列，優(yōu)選HPV16和HPV18的Ll蛋白的優(yōu)化后的基因序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示；2)將步驟1)中優(yōu)化后的基因序列分別克隆入桿狀病毒表達載體，以獲得重組質(zhì)粒，優(yōu)選所述桿狀病毒表達載體是pAcSG2 ；3)用所述重組質(zhì)粒，與相應的桿狀病毒基因組一起，分別轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，以獲得重組桿狀病毒，優(yōu)選所述桿狀病毒基因組是桿狀病毒基因組AcNPV，所述昆蟲細胞優(yōu)選選自Sf-9 細胞、Sf-21細胞和High Five細胞；4)用所述重組桿狀病毒分別感染新鮮培養(yǎng)的昆蟲細胞；5)從步驟4)的昆蟲細胞分別分離純化HPV16和HPV18的Ll蛋白，并將其與佐劑混合制備成二價疫苗，所述佐劑優(yōu)選選自氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑。
2.分離的核酸分子，其序列如SEQID NO. 1所示。
3.分離的核酸分子，其序列如SEQID NO. 2所示。
4.含有權利要求2或3的核酸分子的載體，所述載體優(yōu)選是表達載體，更優(yōu)選是桿狀病毒表達載體，更優(yōu)選是pAcSG2。
5.含有權利要求4的載體的細胞，所述細胞優(yōu)選是昆蟲細胞，更優(yōu)選是Sf-9細胞、 Sf-21細胞或High Five細胞。
6.權利要求2和/或3的核酸分子用于制備二價疫苗的用途，所述二價疫苗用于預防 HPV16和HPV18的感染。
7.權利要求2的核酸分子用于制備HPV16的Ll蛋白的用途。
8.權利要求3的核酸分子用于制備HPV18的Ll蛋白的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備針對人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18的二價疫苗的方法，其包括下列步驟優(yōu)化HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列；將優(yōu)化后的基因序列克隆入桿狀病毒表達載體并轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，以獲得重組的桿狀病毒；用所述桿狀病毒感染昆蟲細胞；回收和純化表達的HPV16和HPV18的L1蛋白，并將其與佐劑混和制備成二價疫苗。本發(fā)明還提供了經(jīng)優(yōu)化的HPV16和HPV18的L1蛋白的基因序列，含有此類基因序列的載體，以及含有此類載體的細胞。
文檔編號C12N15/866GK102178944SQ201010284969
公開日2011年9月14日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權日2010年9月17日
發(fā)明者周蕾, 周長民, 張千, 李衛(wèi)東, 李春明, 段廣宇, 王敏文, 王玉峰, 王飛宇, 聶飛, 郭文軍, 閆昆明, 高偉星 申請人:大連雅立峰生物制藥有限公司