專利名稱：基于尾氣中CO₂濃度的維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)控制工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地涉及一種基于尾氣中(X)2濃度的維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)控制工藝。
背景技術(shù)：
維生素B12 (VB12)是一種生物催化活性物質(zhì)，是哺乳動物不可缺少的維生素。維生素B12在臨床上主要用于治療惡性貧血，亦與葉酸合用于治療各種巨幼細(xì)胞貧血、抗葉酸藥引起的貧血及脂肪瀉等；其也用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)炎、神經(jīng)萎縮等；還用于治療肝臟疾病如肝炎、肝硬化等[1]。另外，VB12還與其他維生素一起構(gòu)成復(fù)合維生素產(chǎn)品，作為OTC藥物、保健食品廣泛銷售。VB12除了用于醫(yī)藥方面，還大量應(yīng)用于動物飼料、營養(yǎng)補充劑和食品加工，如維生素強化面粉、再制食品、嬰兒食品等。1961年Hodgkin利用X-射線技術(shù)首先鑒定出了 VB12的三維結(jié)構(gòu)β]。1978年， Barker等系統(tǒng)地闡明了 VB12的生物學(xué)功能及作為輔酶參加體內(nèi)的代謝反應(yīng)ω。VB12又名鈷胺素，是一類含咕啉環(huán)化合物；分子中三價鈷位于類似卟啉的咕啉環(huán)平面的中心，與Co連接的基團(tuán)X可以為脫氧腺苷(5' -deoxyadenosyl)、甲基(-CH3)、氰基(-CN)所取代，從而形成腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素和氰鈷胺素[4]。維生素B12的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。微生物生物合成的VB12為腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素和羥鈷胺素，但是由于它們的性狀不太穩(wěn)定，因此在工業(yè)提純過程中需要加入氰化鈉，使天然形式的VB12轉(zhuǎn)化為性質(zhì)更為穩(wěn)定的氰鈷胺素[5’6]。1974年hchenmoser完成了 VB12的全化學(xué)合成[7]，由于VB12的化學(xué)結(jié)構(gòu)式極其復(fù)雜，化學(xué)合成需要70多步反應(yīng)且成本十分昂貴，因此開始尋找能夠合成VB12的微生物，利用深層液體發(fā)酵技術(shù)直接生產(chǎn)?，F(xiàn)在國內(nèi)和國外商品化的維生素B12幾乎都是通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)的。能夠合成維生素B12的微生物根據(jù)其耗氧情況分為兩類(1)厭氧菌或間性厭氧菌如費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、Hf 氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermani i)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等，這些菌在合成VB12時不需要氧。(2)好氧菌比如脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas denitrificans)，鈷胺素根瘤菌 (Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等，這些菌在VB12的生物合成過程中需要氧的參與。以脫氮假單胞桿菌(I^eudomonas denitrif icans)為生產(chǎn)菌株的好氧發(fā)酵工藝是目前工業(yè)化生產(chǎn)VB12的主要工藝，培養(yǎng)基采用甜菜糖蜜或麥芽糖為主要碳源，玉米漿或酵母膏為氮源，補加無機鹽、鈷離子以及5，6_ 二甲基苯并咪唑(DMBI)。在脫氮假單胞菌的育種方面，隨著P. denitrificans VB12的合成途徑及相應(yīng)基因被詳細(xì)闡明，利用基因工程技術(shù)有目的地改造VB12生產(chǎn)菌株成為研究的熱點[8’9’1(1]。在脫氮假單胞菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝方面，Marwaha等報道了甜菜堿對發(fā)酵的促進(jìn)作用，闡明了外源前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑對菌體生長和VB12合成的影響[11]。李昆太等對Si2+、 Co2+和DMBI在VB12發(fā)酵中的作用進(jìn)行了研究，并通過補料工藝的改進(jìn)提高了發(fā)酵生產(chǎn)單位 [12_14]。由于該菌好氧工藝條件下的發(fā)酵單位是P. freudenreichii厭氧工藝的三倍，所以被國內(nèi)外眾多廠家所應(yīng)用。供氧對微生物的生長和產(chǎn)物形成有著重要的影響。對于耗氧微生物發(fā)酵過程中， 必須供給適量的無菌空氣，菌體才能繁殖和積累所需代謝產(chǎn)物。不同菌種及不同發(fā)酵階段的菌體的需氧量是不同的，發(fā)酵液的供氧能力的大小直接影響微生物的酶的活性、代謝途徑及產(chǎn)物產(chǎn)量。因此研究供氧大小對發(fā)酵的影響及控制對提高生產(chǎn)效率，改善產(chǎn)品質(zhì)量等都有重要意義。一般的耗氧發(fā)酵過程均控制較高的供氧以避免氧限制的發(fā)生，在這種情況下可以以溶解氧濃度(Dissolved Oxygen，簡稱DO)來表征供氧水平，但對于某些特殊的高耗氧菌種來說，溶氧可能不能成為有效的控制指標(biāo)，這就需要尋找另外的能有效表征供氧水平的參數(shù)。此外，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有通過調(diào)控二氧化碳來提高維生素B12產(chǎn)量的報道。目前，維生素B12需求量較大，因此優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高維生素B12的生產(chǎn)水平成為當(dāng)務(wù)之急。本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效的生產(chǎn)維生素B12的方法，不僅要提高維生素B12 的產(chǎn)量，而且盡可能的節(jié)約能耗、降低成本，提高生產(chǎn)效率，以滿足市場的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效的生產(chǎn)維生素B12的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，它包括步驟(a)在適合發(fā)酵的條件下，培養(yǎng)維生素B12的生產(chǎn)菌株；(b)在發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，通過調(diào)控攪拌速度、罐壓和/或進(jìn)氣，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)，從而維持高水平的維生素Β12的產(chǎn)物合成速率，并產(chǎn)生維生素Β12 ；和(c)從發(fā)酵液中分離純化出維生素Β12。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述的調(diào)控是間歇式調(diào)控、或連續(xù)調(diào)控。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)尾氣中二氧化碳濃度低于5% (ν/ν)時，提高攪拌速度/或增加二氧化碳?xì)怏w的進(jìn)氣量；當(dāng)尾氣中二氧化碳濃度大于10. 5% (ν/ν)時，降低攪拌速度/ 或增加空氣的進(jìn)氣量。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，通過調(diào)控使得發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度處于6-10% (ν/ν)范圍內(nèi)，更佳地處于7-9. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，根據(jù)以下公式計算尾氣中的二氧化碳濃度并進(jìn)行調(diào)控Eco2 = RQXΓ0.6358 XR0.2250 XP-0.0716XVX22. 57+0. 03式中，ECO2*尾氣中二氧化碳體積濃度，％;RQ為呼吸熵，無量綱；F為進(jìn)氣流量， m3/h ；R為攪拌轉(zhuǎn)速，rpm ；P為罐壓力，MP ；V為發(fā)酵液體積，m3。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中還包括控制發(fā)酵體系的氧消耗速率，使得氧消耗速率為 12-25mmol · Γ1 · IT1。在另一優(yōu)選例中，所述的氧消耗速率按以下公式計算uun =Loin--=- -J
V 2 I-CC +C
y丄 V^o2OUt T LcO20ut 乂 式中，F(xiàn)in為進(jìn)氣流量L/min ；V發(fā)酵液體積L ；( in\C02in\CC02in 分別為進(jìn)氣中惰性氣體、氧氣及二氧化碳的質(zhì)量分率；co2。ut\cco2。ut 分別為排氣中氧及二氧化碳的質(zhì)量分率；
97λ1式中，Pin是進(jìn)氣的絕對壓強1 ；tin是進(jìn)氣的溫度。C ；h是進(jìn)氣的相對濕度％。在另一優(yōu)選例中，所述的高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率是彡 2. Omg · L-1 · 1Γ1。在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵體系的體積為5L至200立方米，較佳地為50L至150
立方米。在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌是費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)、鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)、脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas denitrificans)或鈷胺素根瘤菌。在另一優(yōu)選例中，優(yōu)選的工程菌是脫氮假單胞桿菌(I^eudomonas denitrificans)0在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟在維生素B12的生產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)生維生素B12的期間，控制發(fā)酵體系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于 25mmol · Γ1 · IT1 (較佳地，16_25mmol · Γ1 · tT1，更佳地 18_20mmol · Γ1 · IT1 范圍)。在另一優(yōu)選例中，還包括以下步驟在發(fā)酵過程前期維持發(fā)酵體系的高水平的氧消耗速率，從而促進(jìn)菌體生長和維生素B12合成的啟動，其中所述的發(fā)酵過程前期是指從發(fā)酵開始起至菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期； 以及在發(fā)酵過程的中后期降低并維持發(fā)酵體系的低水平的氧消耗速度，從而維持高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率，從而產(chǎn)生維生素B12，其中所述的發(fā)酵過程中后期是指從發(fā)酵過程前期結(jié)束起至發(fā)酵結(jié)束。在另一優(yōu)選例中，一旦菌體的生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期，就可視為發(fā)酵過程前期結(jié)束。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，氧消耗速度的降低是間歇式降低、連續(xù)下降或逐步降低。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中高水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率為 35-45mmol · Γ1 · IT1。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中低水平的氧消耗速率是控制氧消耗速率為 12-25mmol · L-1 · tT1，更佳地 15_20mmol · Γ1 · IT1 范圍。在另一優(yōu)選例中，所述的高水平的維生素Β12的產(chǎn)物合成速率是彡 2. Omg · Γ1 · 1Γ1，通常在 2. 0-5. Omg · Γ1 · IT1 范圍，更佳地為在 3. 0-4. Omg · Γ1 · IT1 范圍。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括通過控制檢測發(fā)酵體系的尾氣計算出所述的氧消耗速率，從而調(diào)節(jié)供氧實現(xiàn)所需的氧消耗速率。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括在發(fā)酵過程的中后期，降低發(fā)酵體系中的攪拌速度。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括控制以下參數(shù)罐溫32士0. 5°C，和/或罐壓 0. 05 0. 06Mpa。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括在培養(yǎng)基中添加可溶性無機鉀鹽(包括氯化鉀、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鉀、硫酸鉀)，這些無機鉀鹽被用作發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的促進(jìn)劑。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法包括在發(fā)酵過程中，當(dāng)生產(chǎn)維生素B12的工程菌菌體生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期時或之后(通常為從發(fā)酵開始的40-72小時后)，通過調(diào)控攪拌速度和/或進(jìn)氣，控制發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)，從而維持維生素Β12的生產(chǎn)速率大于或等于2. Omg · L—1 ^tT1。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括當(dāng)生產(chǎn)維生素Β12的工程菌菌體生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期時或之后(通常為從發(fā)酵開始的40-72小時后)，控制發(fā)酵體系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于25mmol · L-1 · h—1 (較佳地，16-25mmol · L-1 · h-1，更佳地 18-20mmol · Γ1 · IT1 范圍)。在另一優(yōu)選例中，所述的工程菌是費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenr eichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas denitrificans)或鈷胺素根瘤菌。在另一優(yōu)選例中，優(yōu)選的工程菌是脫氮假單胞桿菌(I^eudomonas denitrificans)0在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括在培養(yǎng)基中添加可溶性無機鉀鹽(包括氯化鉀、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸鉀、硫酸鉀)，這些無機鉀鹽被用作發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的促進(jìn)劑。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種提高維生素B12生產(chǎn)速率和/或降低糖消耗的方法，所述方法包括步驟控制發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟在維生素Β12的生產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)生維生素Β12的期間，控制發(fā)酵體系的氧消耗速率，使得氧消耗速率小于或等于 25mmol · Γ1 · IT1 (較佳地，16_25mmol · Γ1 · tT1，更佳地 18_20mmol · Γ1 · IT1 范圍)。在另一優(yōu)選例中，在所述的受控的氧消耗速率和尾氣二氧化碳濃度下，所述的維生素B12生產(chǎn)菌株的維生素B12的生產(chǎn)速率大于或等于2. Omg · L—1 · h—1，通常在 2. 0-5. Omg · Γ1 · IT1 范圍，更佳地為在 3. 0-4. Omg · Γ1 · h—1 范圍。應(yīng)理解，上述的以及本文下文中所詳述的任何二個或多個技術(shù)特征都可相互組合，以構(gòu)成新的技術(shù)方案。在此申請中，為了節(jié)省篇幅，不再一一列出。


圖1顯示了維生素B12結(jié)構(gòu)式。
圖2顯示了 50L發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程曲線圖。圖3顯示了不同(X)2濃度對發(fā)酵過程中菌體生長、PH值、糖耗和產(chǎn)物合成的影響。 圖中，各二氧化碳的濃度分別為=A :0. 03士0. 001% ；B 3. 32士0. 12% ；C :8. 86士0. 24% ；D 13. 84士0. 27%。圖4顯示了利用優(yōu)化的階段供氧控制策略在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12過程中各參數(shù)的變化。圖4顯示了不同CO2濃度對前體氨基乙酰丙酸和丙酮酸羧化酶的影響。圖中， 各二氧化碳的濃度分別為A :0. 03士0. 001 % ；B 3. 32士0. 12 % ；C :8. 86士0. 24 % ;D 13. 84士0. 27%。圖5顯示了不同(X)2濃度下的脫氮假單胞菌菌體形態(tài)。圖中，各二氧化碳的濃度分別為:A :0. 03士0. 001% (對照)；B 3. 32士0. 12% ；C 8. 86士0. 24% ；D :13. 84士0. 27%。圖6顯示了 50L發(fā)酵生產(chǎn)中溶解CO2對VB12發(fā)酵的影響；A =RPM和通氣 (Aeration) ；B :0UR ;C 尾氣中CO2濃度(ECO2) ；D =VB120其中包括了優(yōu)化的控制策略 (optimal)，發(fā)酵對照試驗(control)。圖7顯示了 120m3反應(yīng)器中轉(zhuǎn)速和流量的交互作用對供氧和尾氣中二氧化碳濃度的變化關(guān)系，其中OUR等高線為mol/m7h，尾碳濃度等高線為％。圖8顯示了發(fā)酵過程中二氧化碳濃度控制對發(fā)酵的影響。其中包括常規(guī)的未優(yōu)化工藝(CK)和尾氣二氧化碳濃度優(yōu)化控制工藝。
具體實施例方式本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中通過調(diào)控攪拌速度、 罐壓和/或進(jìn)氣，控制尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)，可以提高和維持高水平的維生素Β12的產(chǎn)物合成速率，從而大幅提高維生素Β12的產(chǎn)量，同時降低底物消耗和單位能耗。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵初期”、“發(fā)酵過程前期，，和“發(fā)酵前期，，可互換使用，都指從發(fā)酵開始起至菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期為止的一段發(fā)酵期間。通常，菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期的時間在36-72小時之間，故所述的發(fā)酵過程前期是從發(fā)酵開始起至菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期為止，換言之，如果進(jìn)入生長穩(wěn)定期為40小時，則所述的發(fā)酵過程前期為自發(fā)酵起的0-40小時；如果如果進(jìn)入生長穩(wěn)定期為40小時，則所述的發(fā)酵過程前期為自發(fā)酵起的0-72小時。 應(yīng)理解，受發(fā)酵條件、生產(chǎn)菌株等因素的影響，菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期的時間會略有不同。如本文所用，術(shù)語“穩(wěn)定期”和“生長穩(wěn)定期”可互換使用。在發(fā)酵過程前期，隨著菌體的生長，其OD值會上升(處于上升期)，當(dāng)進(jìn)入生長穩(wěn)定期時，其OD值基本保持不變 (處于平臺期)。一旦進(jìn)入生長穩(wěn)定期，就可視為發(fā)酵過程前期結(jié)束。確定進(jìn)入生長穩(wěn)定期的方法是本領(lǐng)域中已知的。一種常規(guī)的方法是測定發(fā)酵液的 OD值。例如，每2-4小時測定一次OD值(如每3小時測定一次)，如果連續(xù)三個時間點OD 值不變或基本不變(例如，各OD值< (100% 士5%) XOD平均值)，則可視為菌體生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期。如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵過程中后期”是指從發(fā)酵過程前期結(jié)束起至發(fā)酵結(jié)束的一段時間。換言之，發(fā)酵過程中后期是從菌體生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期開始至發(fā)酵結(jié)束。就維生素B12的發(fā)酵而言，整個發(fā)酵過程通常為約6-8天。因菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期的時間在36-72小時之間，故發(fā)酵過程前期為0至36-72小時，之后可視為發(fā)酵過程中后期。尾氣中二氧化碳濃度的控制本發(fā)明人首次提出了以尾氣中二氧化碳的濃度為控制變量，間接控制二氧化碳溶解濃度，進(jìn)行發(fā)酵控制的策略。具體地，在發(fā)酵過程中，根據(jù)發(fā)酵體系的二氧化碳濃度情況，通過調(diào)控攪拌速度、 罐壓和/或進(jìn)氣等手段，控制尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)，可以提高和維持高水平的維生素Β12的產(chǎn)物合成速率，從而大幅提高維生素Β12的產(chǎn)量，同時降低底物消耗和單位能耗。應(yīng)理解，直接控制發(fā)酵液中的(X)2溶解濃度也是可行的。因為發(fā)酵液中的(X)2溶解濃度與尾氣中二氧化碳濃度存在對應(yīng)關(guān)系，且(X)2溶解濃度的測量較復(fù)雜，因此可以間接采用尾氣中二氧化碳濃度作為指標(biāo)進(jìn)行控制。在本發(fā)明中，宜通過調(diào)控手段，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ ν)，較佳地6-10% (ν/ν)，更佳地7-9. 5% (ν/ν)，從而提高和/或維持維生素Β12的生產(chǎn)速率大于或等于2. Omg · Γ1 · (較佳地大于或等于2. 5mg · Γ1 · tT1，更佳地大于或等于 3. Omg · L-1 · h-1)。在本發(fā)明中，適用的控制尾氣中二氧化碳手段包括調(diào)控攪拌速度、罐壓和/或進(jìn)飛寸。以攪拌速度為例，通常增加攪拌速度有助于提高尾氣中二氧化碳濃度，降低攪拌速度有助于降低尾氣中二氧化碳濃度。以罐壓為例，通常增加罐壓有助于提高尾氣中二氧化碳濃度，減小罐壓有助于降低尾氣中二氧化碳濃度。以進(jìn)氣為例，通常增加(X)2的進(jìn)氣有助于提高尾氣中二氧化碳濃度，減小(X)2的進(jìn)氣有助于降低尾氣中二氧化碳濃度；增加空氣或A的進(jìn)氣量或進(jìn)氣速度有助于降低尾氣中二氧化碳濃度，減少空氣或A的進(jìn)氣量或進(jìn)氣速度有助于提高尾氣中二氧化碳濃度。其他優(yōu)化控制本發(fā)明方法還可與其他的優(yōu)化手段聯(lián)合使用，從而進(jìn)一步提高維生素B12的產(chǎn)率和產(chǎn)量。這些優(yōu)化手段包括添加甜菜堿、Zn2\ Co2+和DMBI等。一種優(yōu)選的優(yōu)化手段是以氧消耗速率(OUR)為控制參數(shù)，采用了分階段的供氧控制策略，發(fā)酵過程前期維持高供氧以促進(jìn)菌體生長和VB12合成的啟動，中后期間歇式降低、連續(xù)下降或逐步降低供氧以維持高的產(chǎn)物合成速率，該控制工藝也可明顯提高維生素 B12產(chǎn)率，同時也可降低單位能耗，降低生產(chǎn)成本，并具有工藝控制簡單、可操作性強、節(jié)約能源等特點。本發(fā)明人在中國專利申請CN 200810204263.9中(該專利申請被全部引入本文， 作為參考)，首次提出了以氧消耗速率OUR為控制變量進(jìn)行分階段供氧的控制策略。試驗表明，在發(fā)酵過程的前期維持較高的供氧以促進(jìn)菌體的快速增長和VB12合成的快速啟動，發(fā)酵過程的中后期通過降低轉(zhuǎn)速來降低供氧以控制菌體的呼吸代謝，可以維持較高的比生產(chǎn)速率和底物轉(zhuǎn)化率。具體地，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，除了調(diào)控尾氣中的二氧化碳之外，它還包括步驟(a)在發(fā)酵過程前期維持發(fā)酵體系的高水平的氧消耗速率，從而促進(jìn)菌體生長和維生素B12合成的啟動，其中所述的發(fā)酵過程前期是指從發(fā)酵開始起至菌株進(jìn)入生長穩(wěn)定期；(b)在發(fā)酵過程的中后期降低并維持發(fā)酵體系的低水平的氧消耗速度，從而維持高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率，從而產(chǎn)生維生素B12，其中所述的發(fā)酵過程中后期是指從發(fā)酵過程前期結(jié)束起至發(fā)酵結(jié)束。在本發(fā)明中，就氧消耗速率的控制而言，應(yīng)在發(fā)酵中后期的全部或部分時間內(nèi)(通常至少50 %以上，較佳地60 %以上，較佳地70 %以上，較佳地80 %以上，最佳地90 %以上的中后期時間內(nèi))，控制氧消耗速率小于或等于25mmol · Γ1 · IT1 (較佳地， 12-25mmol · L-1 · tT1，更佳地 15_20mmol · Γ1 · IT1 范圍)。在本發(fā)明中，雖然對于發(fā)酵前期的氧消耗速率可以不加控制，然而為了促進(jìn)菌體生長和維生素B12合成的啟動，宜提供高水平的氧消耗速率，即控制氧消耗速率為 35-50mmol · L-1 · tT1，較佳地為 35_45mmol · L-1 · IT1。生產(chǎn)菌株適用于本發(fā)明方法的表達(dá)維生素B12的菌株沒有特別限制，可以是現(xiàn)有的生產(chǎn)維生素B12的工程菌，也可用常規(guī)方法改造或誘變的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不限于)厭氧菌或間性厭氧菌如費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、 謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；以及好氧的脫氮假單胞桿菌(I^seudomcmas denitrif icans)，鈷胺素根瘤菌 [6] (Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等。一種優(yōu)選的工程菌是脫氮假單胞桿菌 (Pseudomonas denitrificans)。在獲得了表達(dá)維生素B12的工程菌后，便可在常規(guī)的適合表達(dá)維生素B12的條件下培養(yǎng)，以表達(dá)維生素B12。培養(yǎng)基用于本發(fā)明的培養(yǎng)基沒有特別限制，可以是各種常規(guī)的培養(yǎng)基。例如對于脫氮假單胞菌而已，可以選用(但并不限于)培養(yǎng)基l(g/L)蔗糖80，玉米漿45，甜菜堿14， (NH4)2SO4 LCoCI2 ·6Η20 0. 075,MgO 0. 5，DMBI0. 05，ZnSO4 ·7Η20 0. 08, CaCO3LpH 7.2-7.4; 培養(yǎng)基2(g/L)葡萄糖55g，玉米漿35g (干物)，硫酸銨5g，磷酸二氫鈉8g，氯化鉆0. Olg, 調(diào)pH 6. 8-7. O ；或低鹽發(fā)酵培養(yǎng)基等。當(dāng)然，為了用于有利于維生素B12的發(fā)酵，可以在培養(yǎng)基中添加一定濃度的鉀鹽， 以便使得使用時鉀離子的濃度處于合適的范圍。當(dāng)然，也可使用一般的培養(yǎng)基，然后在發(fā)酵過程中添加或補加鉀離子源，從而將發(fā)酵體系中的氧消耗速率控制在合適的范圍。另外，還在培養(yǎng)基中添加一定濃度的葡萄糖和/或磷酸氫二銨，以便使得使用時葡萄糖和/或磷酸氫二銨的濃度處于合適的范圍。當(dāng)然，也可使用一般的培養(yǎng)基，然后在發(fā)酵過程中補加或添加葡萄糖和/或磷酸氫二銨，從而將發(fā)酵體系中的葡萄糖和/或磷酸氫二銨濃度控制在合適的范圍。
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分離純化在本發(fā)明中，對于發(fā)酵生產(chǎn)的維生素B12，可以用常規(guī)方法進(jìn)行純化，隨后制成藥劑。一種優(yōu)選方法是對發(fā)酵樣品用常規(guī)方法酸化后進(jìn)行離心、過濾等方式去除菌體，獲得含維生素B12的發(fā)酵清液。然后，對發(fā)酵清液通過鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行離子層析純化。在本發(fā)明的一個實施例中，在50L規(guī)模發(fā)酵罐上采用優(yōu)化后的二氧化碳控制策略，其180小時VB12的濃度為235. 4mg · L—1，比對照批次大幅提高(至少提高10% )。在 120噸的發(fā)酵罐也獲得了類似的結(jié)果。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)通過簡單有效的控制方法(控制氧消耗速率)，可以極其有效地提高維生素 B12的產(chǎn)量。(b)本發(fā)明方法可有效降低單位能耗，極大的降低了生產(chǎn)成本，具有工藝控制簡單、可操作性強、節(jié)約能源等特點，有利于進(jìn)一步工業(yè)化放大及推廣應(yīng)用。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非特別說明，所有的百分比和份數(shù)按重量計算。實施例1一、材料與方法1. 1菌種與培養(yǎng)基菌種脫氮假單胞桿菌(P. denitrificans)(購自石家莊華榮制藥集團(tuán))。種子培養(yǎng)基(g/L)蔗糖40，玉米漿 20，甜菜堿 5，(NH4) 2S04 1，(NH4) 2ΗΡ04 2， MnSO4 · H2O 0. 8，CoCl2 · 6Η20 0. 02，MgO 0. 3，DMBI 0. 01，ZnSO4 · 7Η20 0· 01，pH 7· 2 7· 4。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)蔗糖80，玉米漿 45，甜菜堿 14，(NH4)2SO4 1, KH2PO4 0. 75, CoCl2 · 6H20 0. 075，MgO 0. 5，DMBI 0. 05，ZnSO4 · 7Η200· 08，CaCO3 1，pH 7· 2 7· 4。補料培養(yǎng)基1 (g/L)葡萄糖 300，DMBI 0. 15，CoCl2 · 6H20 0. 15。補料培養(yǎng)基2 (g/L)甜菜堿 30，DMBI 0. 4，CoCl2 · 6H20 0. 3。合成發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)=(NH4)2HPO4 10.0, KCl 0. 2，MgSO4 · 7H20 1.4, (NH4)2SO4 5. 0，5，6- 二甲基苯并咪唑(5,6-dimethylbenzimidazole) 0. 0065，MnSO4 · H2O 0. 002， ZnSO4 · 7H20 0. 002，CoCl2 · 6H20 0. 0025，F(xiàn)eSO4 · 7Η200· 0003，Na2MO4O. 0002。1.2試劑和儀器試劑糖蜜(內(nèi)蒙古蘭田糖業(yè)有限公司)，甜菜堿(華榮制藥有限公司)，玉米漿(河北興柏糖業(yè)有限公司)，5，6_ 二甲基苯并咪唑(河北科碩化工有限公司)， CoCl2 · BH2O(山東臨縣匯豐鈷廠)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器722型紫外一可見分光光度計；HPLC 1100 (Agilent公司)；尾氣質(zhì)譜分析儀美國Extrel過程質(zhì)譜MAX300-LG ；50L發(fā)酵罐上海國強生化裝備有限責(zé)任公司；發(fā)酵控制系統(tǒng)國佳生化工程中心NCBbiostar發(fā)酵控制系統(tǒng)。1.3實驗方法
1.3. 1菌濃測定將菌液適當(dāng)稀釋后于波長700nm處測定吸光值，以去離子水為對照。菌體光密度
值(OD700) = OD讀數(shù)X稀釋倍數(shù)。


1. 3. 2還原糖和總糖測定采用改進(jìn)了的DNS法和葡萄糖試劑盒[16]。 1. 3. 3銨離子測定利用苯酚-次氯酸鹽反應(yīng)測定[17]。 1.3. 4有機酸測定[18]:
Agilent 11OOHPLC系統(tǒng)，色譜柱AquaS印公司C8柱。流動相
0. 05MKH2P04 (pH2. 5) CH3OH = 95 5 ；流速0. 6mL/min。進(jìn)樣量20μ L。柱溫30°C。檢測波長:210nm。1.3. 5氨基酸測定Agilent 11OOHPLC 系統(tǒng)，色譜柱Zorbax Eclipase AAA,在線自動衍生，氨基酸用鄰苯二甲醛(OPA)衍生，流動相A :40mM NaH2PO4, pH7. 8 ；流動相B
H2O (45 45 10, ν/ν/ν)；流速 2. OmL/min，紫外雙波長檢測338nm 禾口
CH3OH
CH3CN 262nm。1. 3. 65-氨基乙酰丙酸(δ -ALA)的測定取300 μ L細(xì)胞破碎的浸提液至試管中，試管預(yù)先裝有400 μ L l.Omol/L的乙酸鈉緩沖液(pH 4.7)；加35 μ L乙酰丙酮，搖勻；置沸水浴中反應(yīng)IOmin ；冷卻至室溫，加入 700 μ L改進(jìn)的mrrlich’ s試劑到試管中，立刻振蕩均勻進(jìn)行顯色；IOmin后，在分光光度計 556nm處測定吸光值，根據(jù)吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出發(fā)酵液中δ -ALA的含量[19]。1.3.7膽色素原(PBG)的測定PBG和Ehrlich，s試劑反應(yīng)生成Ehrlich-PBG復(fù)合鹽，該復(fù)合鹽在555nm處有最大吸光值。取ImL細(xì)胞破碎的浸提液至試管中，加入lmLEhrlich’ s試劑，充分振蕩進(jìn)行顯色，15min后，在分光光度計上555nm處測定吸光值，然后根據(jù)其分子消光系數(shù)即可計算出 PBG的含量。1. 3. 8發(fā)酵過程尾氣分析采用Extrel過程質(zhì)譜MAX300-LG對發(fā)酵過程中的進(jìn)氣和尾氣進(jìn)行實時在線采集分析，該質(zhì)譜儀能夠精確測定發(fā)酵過程尾氣中的氬氣、氮氣、二氧化碳和氧氣等分子量300 以內(nèi)的可揮發(fā)性氣體。使用之前用標(biāo)準(zhǔn)氣體對儀器的響應(yīng)度進(jìn)行標(biāo)定。氧消耗速率(OUR)和二氧化碳生成速率(CER)測定OUR和CER的計算通過對發(fā)酵尾氣的分析數(shù)據(jù)計算得到。以進(jìn)氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER的計算公式如下
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，其特征在于，它包括步驟(a)在適合發(fā)酵的條件下，培養(yǎng)維生素B12的生產(chǎn)菌株；(b)在發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，通過調(diào)控攪拌速度、罐壓和 /或進(jìn)氣，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)，從而維持高水平的維生素Β12的產(chǎn)物合成速率，并產(chǎn)生維生素Β12 ；和(c)從發(fā)酵液中分離純化出維生素Β12。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，所述的調(diào)控是間歇式調(diào)控、或連續(xù)調(diào)控。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，通過調(diào)控使得發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度處于6-10% (ν/ν)范圍內(nèi)，更佳地處于7-9. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中，根據(jù)以下公式計算尾氣中的二氧化碳濃度并進(jìn)行調(diào)控Eco2 = RQ X F-0·6358 X R0'2250 X P-0'0716 X V X 22. 57+0. 03式中，ECO2為尾氣中二氧化碳體積濃度，％ ；RQ為呼吸熵，無量綱；F為進(jìn)氣流量，m3/ h ；R為攪拌轉(zhuǎn)速，rpm ；P為罐壓力，MP ；V為發(fā)酵液體積，m3。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中還包括控制發(fā)酵體系的氧消耗速率，使得氧消耗速率為12-25mmol · Γ1 · h—1。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率是彡 2. Omg · L"1 · 1Γ1。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵體系的體積為5L至200立方米， 較佳地為50L至150立方米。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌是費氏丙酸桿菌 (Propionibacterium freudenreichii)、Hi 氏丙酸If 菌(Propionibacteriumshermanii)、 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas denitrificans)或鈷胺素根瘤菌。
9.一種維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵過程中，當(dāng)生產(chǎn)維生素B12的工程菌菌體生長進(jìn)入生長穩(wěn)定期時或之后，通過調(diào)控攪拌速度和/或進(jìn)氣，控制發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)，從而維持維生素Β12的生產(chǎn)速率大于或等于2. Omg ·廠1 · IT1。
10.一種提高維生素Β12生產(chǎn)速率和/或降低糖消耗的方法，所述方法包括步驟控制發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，使得尾氣中二氧化碳的濃度處于5-10. 5% (ν/ν)范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于氧消耗速率的維生素B12發(fā)酵生產(chǎn)控制工藝。具體地，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)維生素B12的發(fā)酵方法，包括步驟(a)培養(yǎng)維生素B12的生產(chǎn)菌株；(b)在發(fā)酵過程中檢測發(fā)酵體系的尾氣中二氧化碳的濃度，通過調(diào)控攪拌速度和/或進(jìn)氣，控制尾氣中二氧化碳的濃度，從而維持高水平的維生素B12的產(chǎn)物合成速率；和(c)從發(fā)酵液中分離純化出維生素B12。本發(fā)明方法可明顯提高維生素B12產(chǎn)率，降低底物消耗，同時降低單位能耗，可大幅降低生產(chǎn)成本，具有工藝控制簡單、可操作性強、節(jié)約能源等特點。
文檔編號C12R1/41GK102399845SQ20101027921
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者儲炬, 唐麗娜, 莊英萍, 張嗣良, 曹云峰, 李永亮, 王振國, 王澤建, 謝麗華, 陳學(xué)軍 申請人:華東理工大學(xué), 河北華榮制藥有限公司