專利名稱:基于異丁醇的安莎霉素p-3生產(chǎn)優(yōu)化方法
技術領域:
本發(fā)明涉及的是一種生物工程與技術領域的方法,具體是一種基于異丁醇的安莎 霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法。
背景技術:
Ansamitocin是珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)來源的美登素 衍生物,其母核為19-C的大環(huán)內酰胺環(huán),C-3連接不同長度的碳鏈,主要活性成份安莎霉素 P-3(AP-3)的側鏈為異丁?;诘蜐舛认驴梢种品前籽园籽〖毎导叭祟惞腆w腫瘤。 由于腸胃副效應及神經(jīng)毒性,其研究還停留在臨床二階段。然而,由于Ansamitocin可在臨 床一期中作為抗體毒素結合物及免疫結合物,各方面的研究仍在進行中,并且其在2009年 被世界衛(wèi)生組織列為非常重要的抗菌藥物。次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量受不同環(huán)境條件影響,如培養(yǎng)基中組成、氧供應及發(fā)酵溫度 等。而優(yōu)化培養(yǎng)基的組成是傳統(tǒng)也是重要的一步用于提高代謝物產(chǎn)量。目前,已報道的野 生型珍貴橙色束絲放線菌產(chǎn)Ansamitocin主要為液體發(fā)酵,盡管有報道利用培養(yǎng)基優(yōu)化的 方法及高表達調節(jié)基因的方法提高AP-3產(chǎn)量,但得到的產(chǎn)率仍只在50mg/L[6,7]左右;因 此,利用各種方法提高AP-3產(chǎn)率是其應用的一個關鍵步驟。異丁醇是一種重要的化工原 料,同時也有報道其可作為能源燃料,在發(fā)酵生物質產(chǎn)乙醇的過程中作為副產(chǎn)物積累;由于 異丁醇是一種分支醇,可作為分支鏈脂肪酸的前體,這就為其在需要以分支鏈脂肪酸為底 物的生物培養(yǎng)過程的利用提供可能;然而,對于醇(特別是異丁醇)作為生物培養(yǎng)過程中的 添加劑或營養(yǎng)因子是鮮有報道的。本發(fā)明的目標產(chǎn)物AP-3屬于大環(huán)內酯類抗生素,其合成 需要一系列來源于脂肪酸的CoA,這使利用異丁醇添加提高AP-3產(chǎn)量成為可能。經(jīng)過對現(xiàn)有技術的檢索發(fā)現(xiàn),K.Hatano, E. Higashide, S. Akiyama, and Μ.Yoneda(1984)在 Selective accumulation of Ansamitocin P_2, P_3and P_4, and biosynthetic origins of their acylmoieties (P_2,P_3 及 P_4 的選擇性積累及其酰基 基團來源)(Agric. Biol. Chem. 48(7) :1721_1729) 一文中記載了纈氨酸也可以作為AP-3的 前體以提高其產(chǎn)量[6,8],但由于纈氨酸在使用前需要過濾除菌,但其在水中的溶解度低, 為添加操作帶來極大的不便,且提高AP-3產(chǎn)量的幅度(僅為20% -60% )遠不如異丁醇 (200% -400% ),故在AP-3發(fā)酵過程中,我們提出添加異丁醇提高目標產(chǎn)物產(chǎn)率的方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足,提供一種基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn) 優(yōu)化方法,即通過在野生型珍貴橙色束絲放線菌比較添加與不添加異丁醇的AP-3產(chǎn)量,獲 得一個有效提高AP-3產(chǎn)量的方法,此方法有助于提高AP-3產(chǎn)率,并減少副產(chǎn)物的生成,可 為簡化后續(xù)的分離純化工作作奠定基礎。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的,包括如下步驟第一步、配制種子培養(yǎng)基,采用甘油保存的珍貴橙色束絲放線菌接種于種子培養(yǎng)基并進行培養(yǎng)操作,獲得一級種子,并經(jīng)二次培養(yǎng)后獲得二級種子;所述的野生型珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum)保藏于 The Global Bioresource Center ATCC (國際生物資源中心 ATCC,保 藏號31565),可通過以下方式獲得http //www, atcc. orR/ATCCAdvancedCataloRSearch/ProductDetails/ tabid/452/Default. aspx ? ATCCNum = 31565&Template = bacteria ;所述的種子培養(yǎng)基的組分及質量百分比含量為酵母提取物質1%、牛肉浸膏 1%、葡萄糖0. 5%、甘油和氯化鈉0. 3%以及96. 2%的雙蒸水,其PH為7. 4。所述的甘油管種子保存于-70°c冰箱,保存濃度為108CFU/ml,按1.6%接種率接種 于種子培養(yǎng)基中,接種量為1.6%。所述的培養(yǎng)操作是指在28°C環(huán)境下以220rpm轉速培養(yǎng)2天。所述的二次培養(yǎng)是指取一級種子按1. 6%接種率接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng) 操作。第二步、配制發(fā)酵培養(yǎng)基,取二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,添加異丁醇并進行搖瓶 培養(yǎng);所述的配制發(fā)酵培養(yǎng)基是指依次配置組分及質量百分比含量如下酵母提取物 質1 %、玉米煮沸濾液2 %、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸鈣0. 5%、磷酸氫二鉀0. 05%及七 水合硫酸亞鐵0. 0002%,余量為雙蒸水,配置得到的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7. 4。所述的搖瓶培養(yǎng)是指將二級種子按1. 6%接種率接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28°C 環(huán)境下以220rpm培養(yǎng)4_6天。所述的添加異丁醇是指直接在搖瓶培養(yǎng)過程的0-48小時時間段內滴加質量百 分比濃度大于99%的異丁醇,直至發(fā)酵培養(yǎng)基中的異丁醇濃度達到72毫摩爾/升。第三步、培養(yǎng)結束的發(fā)酵液經(jīng)離心后,分離出上清液,用等體積的乙酸乙酯提取3 次,合并提取液,旋轉蒸干后,再用甲醇溶解并過濾備用,最后采用高相液相色譜分析所得 安莎霉素的純度。經(jīng)上述方法優(yōu)化發(fā)酵得到的AP-3產(chǎn)量提高200%以上,并大大減少副產(chǎn)物AP-2的 積累。本發(fā)明操作簡單,易于實施,便于大規(guī)模生產(chǎn)。
圖1為實施例中野生型珍貴橙色束絲放線菌在添加不同濃度異丁醇條件下的 AP-3產(chǎn)量。圖2為實施例中野生型珍貴橙色束絲放線菌在不同培養(yǎng)時間添加異丁醇條件下 的AP-3產(chǎn)量。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明,本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施,給出了詳細的實施方式和具體的操作過程,但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。所使用的微生物珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)。液體發(fā)酵之前,菌體先接兩級種子(60ml/250ml,220rpm, 28°C各2天),再以1. 6%的接種量 接種發(fā)酵培養(yǎng)基,在培養(yǎng)初始或培養(yǎng)過程中添加不同濃度的異丁醇,培養(yǎng)結束后,再用等體 積的乙酸乙酯萃取Ansamitocin,蒸干后溶于甲醇,過濾后低溫保存或直接HPLC檢測。實施例1采用的菌種珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565);種子及發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基成份為酵母提取物質1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖 0. 5 %,甘油1 %和氯化鈉0.3%。發(fā)酵培養(yǎng)基成份為酵母提取物質1 %、玉米煮沸濾液1 %、 葡萄糖0. 5 %,甘油4 %,碳酸鈣0. 5 %,磷酸氫二鉀0. 05 %及七水合硫酸亞鐵0. 0002 %。 250-ml搖瓶裝液量60ml。低溫保存的甘油管種子1ml,于28°C,220rpm培養(yǎng)2天,按1. 6% 的接種量轉接二級種子,28°C,培養(yǎng)2天,再以1. 6%的接種量轉接發(fā)酵培養(yǎng)基,并添加不同 濃度的異丁醇(7. 2、18、36和72mM,對應為40、100、200、400微升),以不添加為對照,每個 條件設三個生物學重復,培養(yǎng)4-6天。樣品處理及檢測方法液體培養(yǎng)結束后,發(fā)酵液離心取上清用等體積的乙酸乙酯 萃取3次,合并3次乙酸乙酯萃取液。上述乙酸乙酯液于50°C旋轉蒸發(fā)后,加入Iml的甲醇 溶解,用0. 22 μ m有機膜過濾后于高相液相色譜(HPLC)檢測AP-3和AP-2含量;所使用的 HPLC柱為C18反向柱,柱溫28°C,流動相為85%甲醇和15%水,流速0. 6ml/min。結果表明,添加異丁醇濃度為36mM能有效地提高AP-3產(chǎn)量。實施例2采用的菌種如實施例1;種子及發(fā)酵培養(yǎng)如實施例1,不同的是在培養(yǎng)的初始(即第0小時)、第12小時、 第24小時、第36小時及第48小時添加36mM的異丁醇,以不添加為對照,每個條件設三個 生物學重復,培養(yǎng)4-6天。樣品處理及檢測方法如實施例1。結果表明,在培養(yǎng)初始,即第0小時,添加終濃度為36mM的異丁醇能使AP_3產(chǎn)量 達 93. 8mg/L。
權利要求
一種基于異丁醇的安莎霉素P 3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征在于,包括如下步驟第一步、配制種子培養(yǎng)基,采用甘油保存的珍貴橙色束絲放線菌接種于種子培養(yǎng)基并進行培養(yǎng)操作,獲得一級種子,并經(jīng)二次培養(yǎng)后獲得二級種子;第二步、配制發(fā)酵培養(yǎng)基,取二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,添加異丁醇并進行搖瓶培養(yǎng);第三步、培養(yǎng)結束的發(fā)酵液經(jīng)離心后,分離出上清液,用等體積的乙酸乙酯提取3次,合并提取液,旋轉蒸干后,再用甲醇溶解并過濾備用,最后采用高相液相色譜分析所得安莎霉素的純度。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,所述的 種子培養(yǎng)基的組分及質量百分比含量為酵母提取物質1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、 甘油和氯化鈉0. 3%以及96. 2%的雙蒸水,其pH為7. 4。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,所述 的甘油管種子保存于-70°C冰箱,保存濃度為108CFU/ml,按1.6%接種率接種于種子培養(yǎng)基 中,接種量為1.6%。
4.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,第一步 中所述的培養(yǎng)操作是指在28°C環(huán)境下以220rpm轉速培養(yǎng)2天。
5.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,第一步 中所述的二次培養(yǎng)是指取一級種子按1. 6%接種率接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)操作。
6.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,所述 的配制發(fā)酵培養(yǎng)基是指依次配置組分及質量百分比含量如下酵母提取物質1%、玉米煮 沸濾液2%、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸鈣0. 5 %、磷酸氫二鉀0. 05%及七水合硫酸亞鐵 0. 0002%,余量為雙蒸水,配置得到的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7. 4。
7.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,第二步 中所述的搖瓶培養(yǎng)是指將二級種子按1. 6%接種率接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28°C環(huán)境下 以220rpm培養(yǎng)4-6天。
8.根據(jù)權利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,其特征是,所述 的添加異丁醇是指直接在搖瓶培養(yǎng)過程的0-48小時時間段內滴加質量百分比濃度大于 99%的異丁醇,直至發(fā)酵培養(yǎng)基中的異丁醇濃度達到72毫摩爾/升。
全文摘要
一種生物工程技術領域的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法,通過在野生型珍貴橙色束絲放線菌比較添加與不添加異丁醇的AP-3產(chǎn)量,獲得一個有效提高AP-3產(chǎn)量的方法,此方法有助于提高AP-3產(chǎn)率,并減少副產(chǎn)物的生成,可為簡化后續(xù)的分離純化工作作奠定基礎。
文檔編號C12R1/01GK101914587SQ20101026691
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月30日 優(yōu)先權日2010年8月30日
發(fā)明者林錦霞, 鐘建江 申請人:上海交通大學