專利名稱：VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組載體領(lǐng)域，具體涉及VEGF165和Ang-I雙基因共表達(dá)載體制備促進(jìn)血管新生藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，在血管新生中，有諸多的細(xì)胞和化學(xué)因子參與調(diào)控。目前認(rèn)為 VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)具有特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘發(fā)新生血管生長，繼而形成側(cè)支循環(huán)等生物學(xué)作用，在血管新生的起始與維持階段均有作用；FGF (成纖維細(xì)胞生長因子)主要參與初期過程；而Ang-I (血管生成素)、IGF (胰島素樣生長因子)與PDGF (血小板衍生生長因子)主要影響血管的成熟與穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)研究揭示外源性VEGF基因治療可能明顯改善缺血心肌的灌注及功能，并取得了一定的療效(參見L0S0rd0 Dff, Vale PR, Symes JF, et al. 1998,98 =2800-2804.)。但新近的一些實(shí)驗(yàn)陸續(xù)提示單獨(dú)應(yīng)用VEGF時(shí)，即使使用的是治療劑量，有可能導(dǎo)致局部組織的明顯水腫(參見Dor Y，DjionovV, Abramovitch R，et al. 2002，21 (8) :1939-1947.)、缺血肢體的壞死(參見Masaki L, Yonemitsu Y, Yamashita A，et al. 2002，90 (9) :966-973.)、血管瘤形成和心功能惡化等(參見Lee RJ, Springer ML, Blanco-Bose WE，et al. 2000,102 :898-901.)。因此，在有效發(fā)揮 VEGF 血管新生治療作用的同時(shí)，探討如何避免和減少其不良反應(yīng)的方案，是迫切需要解決的臨床問題，基因的聯(lián)合治療可能是解決辦法之一。近年來，基因聯(lián)合治療心肌缺血成為研究的熱點(diǎn)之一，有研究用VEGF和Ang-I兩種基因分別在缺血局部注射，心肌梗塞的面積縮小，提示這兩種基因治療協(xié)同作用，鑒于類似的研究均是兩次或分別進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，多是應(yīng)用在缺血組織的局部，如缺血下肢或心肌 (參見Jho D,Mehta D, Ahmmed G，etal. 2006，96 (12) :1282-1290 ；Shyu KG, Chang H, Isner JM. Life Sciences, 2003，73 (20) :563-579.)。既往的聯(lián)合基因治療均是兩個(gè)載體分別攜帶兩個(gè)基因，先后或同時(shí)給予，在轉(zhuǎn)基因治療時(shí)需要兩次基因轉(zhuǎn)染，而且兩個(gè)基因分別給予時(shí)劑量難以協(xié)調(diào)計(jì)算和基因轉(zhuǎn)移效率低等缺點(diǎn)。尚未見到由同一個(gè)腺病毒載體攜帶兩種促進(jìn)血管生成的基因，并共同在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)中表達(dá)，聯(lián)合基因結(jié)合干細(xì)胞移植治療缺血心肌，促進(jìn)缺血區(qū)血管新生和改善心功能的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種VEGF165和Ang-I雙基因共表達(dá)載體。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種VEGF165和Ang-I雙基因共表達(dá)載體，所述雙基因共表達(dá)載體含有人基因VEGF165和人Ang-I基因，所述雙基因共表達(dá)質(zhì)粒為 pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165。進(jìn)一步的技術(shù)方案中，將上述PAdiTrack-CMV-Ang-1 -IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι同源重組后，在QBH93A細(xì)胞中包裝和擴(kuò)增獲得 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒，以便用攜帶VEGF和Ang-I的雙基因重組腺病毒感染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，促進(jìn)缺血心肌的血管新生和改善心功能。因此，本發(fā)明要求保護(hù)pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移載體在制備促進(jìn)缺血心肌的血管新生藥物中的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明要求保護(hù)Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒在制備促進(jìn)缺血心肌的血管新生藥物中的應(yīng)用。采用常規(guī)技術(shù)將上述pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌大腸桿菌中，然后進(jìn)行保藏，該大腸桿菌的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2010年5月16日；保藏編號CCTCC NO =M 2010117 ；分類命名大腸桿菌 DH5a/pAdTrack-CMV-hAng-l-IRES-hVEGF165 ；Escherichia coli DH5α /pAdTrack-CMV-hAng-l-IRES_hVEGF165。上述pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移載體的制備方法包括以下步驟(1)根據(jù)GenBank報(bào)道的IRES(內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn))保守序列，設(shè)計(jì)引物P1、 P2，以含有IRES片段的pGEZ-Term質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增IRES目的基因片段，亞克隆至 pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建pAdTrack-CMV_IRES雙基因共表達(dá)轉(zhuǎn)移空質(zhì)粒，并經(jīng)PCR、雙酶切和DNA測序鑒定；(2)根據(jù)GenBank報(bào)道的人VEGF165基因序列，設(shè)計(jì)引物P3、P4，以含有人VEGF165 基因片段的PSV-K3-VEGF165質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增人VEGF165目的基因片段，亞克隆至 pAdTrack-CMV-IRES 構(gòu)建 pAdTrack-CMV-IRES_VEGF165 單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并經(jīng) PCR、 雙酶切和DNA測序鑒定；(3)根據(jù)GenBank報(bào)道的人Ang-I基因序列，設(shè)計(jì)引物P5、P6，以人骨髓細(xì)胞總 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR(RT-PCR)擴(kuò)增人Ang-I目的基因片段，分別亞克隆至 pAdTrack-CMV-IRES 和 pAdTrack-CMV-IRES_VEGF165 構(gòu)建 pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒并經(jīng)PCR、雙酶切和DNA測序鑒定。進(jìn)一步的技術(shù)方案中，將上述構(gòu)建正確的pAdTrack-CMV-IRES空質(zhì)粒、 pAdTrack-CMV-1RES-VEGF16 5 和 pAcTTrack-CMV-Ang-l-IRES 單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒及pA(Trrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)Pme I酶切后分別與 pAdEasy-Ι腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183大腸桿菌中同源重組，得到的重組腺病毒質(zhì)粒pAdEa sy-l-pAdTrack-CMV-IRES (pAd-IRES)、pAdEasy-1 -pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165 (pAd-IRES -VEGF165)、pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES(pAd-Ang-l-IRES)和 pAdEasy-1-pAdTr ack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165(pAd-Ang-l-IRES-VEGF165)經(jīng) Pac I 酶切后再用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染QBH93A細(xì)胞，經(jīng)多輪感染和擴(kuò)增后獲得Ad-IRES空載體腺病毒、Ad-IRES_VEGF165 單基因重組腺病毒、Ad-Ang-I-IRES單基因重組腺病毒和Ad-Ang-1-IRES_VEGF165雙基因重組腺病毒，并利用RT-PCR和Wfestern blot檢測腺病毒為載體介導(dǎo)的外源性VEGF165和 Ang-I基因在QBH93A細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別以PGEZ-Term質(zhì)粒、pSV_K3_VEGF165質(zhì)粒和人骨髓細(xì)胞總 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR均能擴(kuò)增出581bp的IRES、576bp的人VEGF165 和1497bp的人Ang-I目的基因片段，亞克隆的IRES、VEGF165和Ang-I基因片段其
4CN 102191209 A
序列測定結(jié)果與GenBank報(bào)道的完全一致，成功構(gòu)建了 pAcTTrack-CMV-IRES空質(zhì)粒、 pAdTrack-CMV-1RES-VEGF165 單基因重組質(zhì)粒、pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 單基因重組質(zhì)粒和pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組質(zhì)粒，并成功獲得了 Ad-IRES 空載體腺病毒、Ad-IRES-VEGF165單基因重組腺病毒、Ad-Ang-I-IRES單基因重組腺病毒和Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因重組腺病毒；RT-PCR和Western blot證實(shí) Ad-IRES-VEGF165、Ad-Ang-I-IRES 和 Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 重組腺病毒介導(dǎo)的外源性 VEGF165和Ang-I基因在QBH93A細(xì)胞中能成功轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。由于血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial proganitor cells，EPCs)是一種骨髓和外周血存在的內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，有高度增殖潛能，能以血管生成-即胚胎期的血管形成方式、 參與人體缺血部位的代償性血管重建。在血管損傷和組織缺血時(shí)，動員骨髓中的EPCs向外周血中釋放并向缺血區(qū)趨化，鑒于EPCs本身的促進(jìn)血管新生和趨化的功能，因此選用EPCs 作為基因治療的載體細(xì)胞是十分合理和有效的。因此，進(jìn)一步的技術(shù)方案中，在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)分離培養(yǎng)和 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因重組腺病毒構(gòu)建的基礎(chǔ)上，將Ad-Ang-1-IRES_VEGF165體外感染EPCs細(xì)胞，以制備腺病毒為載體介導(dǎo)的VEGF165和Ang-I促血管生長因子雙基因修飾的EPCs ；感染結(jié)果表明，VEGF165和Ang-I重組腺病毒能高效感染EPCs細(xì)胞，其感染效率可達(dá)90%以上；間接免疫熒光和ELISA檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)腺病毒介導(dǎo)的外源性VEGF165 和Ang-I基因能在EPCs細(xì)胞中共表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過VEGF165和Ang-I雙基因修飾的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，經(jīng)過導(dǎo)管遞送后，能顯著促進(jìn)外源性基因在體內(nèi)的表達(dá)和新生血管形成，改善左心室收縮功能，減輕心室擴(kuò)大，效果優(yōu)于單基因修飾的血管祖細(xì)胞。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明所述用IRES構(gòu)建的VEGF165和Ang-I雙基因共表達(dá)的腺病毒載體和用 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165修飾的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)可以作為治療心肌缺血的藥物。2、本發(fā)明用Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因修飾血管內(nèi)皮祖細(xì)胞治療心肌缺血的治療方案，利用了 EPCs向心肌缺血區(qū)趨化的特性，進(jìn)行基因治療，有效地避免造成非缺血區(qū)的血管新生等副作用。


大腸桿菌的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2010年5月16日；保藏編號CCTCC NO =M 2010117 ；分類命名大腸桿菌 DH5α /pAdTrack-CMV-hAng-1-IRES-hVEGF165 ；Escherichia coli DH5α /pAdTrack-CMV-h Ang-l-IRES-hVEGF165。圖1是實(shí)施例一中IRES介導(dǎo)的VEGF165和Ang-I雙基因腺病毒共表達(dá)模式圖；圖2是實(shí)施例一中pAdTrack-CMV-IRES改造空轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定圖，其中， (A)PCR 獲得 IRES 片段1. pGEZ-Term 質(zhì)粒為模板的 IRES PCR 產(chǎn)物；M. DL2000marker ； (B) pAdTrack-CMV-IRES 質(zhì)粒 PCR 鑒定1. pAdTrack-CMV-IRES 質(zhì)粒為模板的 IRES PCR 產(chǎn)物； M. DL2000marker ； (C) pAdTrack-CMV-IRES 質(zhì)粒雙酶切鑒定1. pAdTrack-CMV-IRES 質(zhì)粒 SalI、Not I 雙酶切；M. DL2000marker ；
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圖3是實(shí)施例一中pAcWrack-CMV-IRES-VEGFieS單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定圖，其中，(A)PCR獲得VEGF165片段1. pSV_K3_VEGF165質(zhì)粒為模板的 VEGF165 PCR 產(chǎn)物；M. DL2000 marker ； (B) pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165 質(zhì)粒 PCR 鑒定1. pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165 質(zhì)粒為模板的 VEGF165PCR 產(chǎn)物；M. DL2000marker ； (C)pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165 質(zhì)粒 Xho I、EcoR V 雙酶切鑒定1. pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165 質(zhì)粒 Xho I、EcoR V 雙酶切； M. DL2000marker ； (D)pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165 質(zhì)粒 Sal I、EcoR V 雙酶切鑒定 1. pAdTrack-CMV-1RES-VEGF165 質(zhì)粒 Sail、EcoR V 雙酶切；M. DL2000marker ；圖4是實(shí)施例一中pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定圖，其中，㈧RT-PCR獲得Ang-I片段1.骨髓細(xì)胞總RNA為模板的 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物；M. DL2000marker ； (B) pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒 PCR 鑒定
I.pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒為模板的 Ang-IPCR 產(chǎn)物；M. DL2000marker ； (C) pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒雙酶切鑒定1· pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒 Bgl
II、SalI 雙酶切；M. DL2000marker ； (D)pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒雙酶切鑒定
1.pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒 Bgl II、Not I 雙酶切；M. DL2000 marker ；圖5是實(shí)施例一中pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定圖，其中，㈧RT-PCR獲得Ang-I片段1.骨髓細(xì)胞總RNA為模板的 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物；M. DL2000 marker ； (B)pAdTrack-CMV-Ang-1-1RES-VEGF165 質(zhì)粒 PCR 鑒定1. pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 質(zhì)粒為模板的 Ang-IPCR 產(chǎn)物；M. DL2000marker ； (C) pAdTr ack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF16 5 質(zhì)粒雙酶切鑒定1· pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF 165 質(zhì)粒 Bgl II、SalI 雙酶切；M. DL2000marker ； (D)ρAdTrack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF165 質(zhì)粒雙酶切鑒定1. pAdTr ack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF16 5 質(zhì)粒 Bgl II、EcoR V 雙酶切； M.DL2000marker ；圖6是實(shí)施例一中同源重組克隆質(zhì)粒(BJ518;3)瓊脂糖電泳分子量大小鑒定圖，其中，(A)pAd-IRES同源重組克隆質(zhì)粒(BJ5183)分子量大小鑒定1. pAdEasy-Ι ；
2.pAdTrack-CMV-IRES ；3 8.為所挑的6個(gè)克隆，其中3,7,8為同源重組克隆；4，5，6為非同源重組克??；(B)pAd-IRES-VEGF165同源重組克隆質(zhì)粒(BJ5183)分子量大小鑒定
1.pAdEasy-Ι ；2. pAdTr ack-CMV-1RES-VEGF16 5 ；3 8.為所挑的 6 個(gè)克隆，其中 3，4，6，7 為同源重組克??；5，8為非同源重組克隆；(C)pAd-Ang-l-IRES同源重組克隆質(zhì)粒(BJ5183) 分子量大小鑒定1. pAdEasy-Ι ；2. pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES ；3 8.為所挑的 6 個(gè)克隆，其中3，4，5，6，7，8均為同源重組克??；(D)pAd-Ang-l-IRES-VEGF165同源重組克隆質(zhì)粒(BJ5183)分子量大小鑒定1. pAdEasy-Ι ； 2. pAdTr ack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF16 5 ；3 8.為所挑的6個(gè)克隆，其中3，4，5，6，7為同源重組克??；8為非同源重組克??；圖7是實(shí)施例一中同源重組克隆質(zhì)粒(DH5ci)瓊脂糖電泳分子量大小鑒定圖，其中，(A)pAd-IRES同源重組克隆質(zhì)粒(DH5 α )分子量大小鑒定1. pAdEasy-Ι ；
2.pAdTrack-CMV-IRES ；3 5.分另丨」為圖7 (A)中的3個(gè)同源重組克??；(B) pAd-IRES-VEGF165同源重組克隆質(zhì)粒(DH5 α)分子量大小鑒定1. pAdEasy-Ι ； 2. pAdTr ack-CMV-1RES-VEGF16 5 ；3 6.分別為圖7 (B)中的4個(gè)同源重組克??； (C)pAd-Ang-l-IRES同源重組克隆質(zhì)粒(DH5 α)分子量大小鑒定1. pAdEasy-Ι ；2. pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES ；3 8.分別為圖7 (C)中的6個(gè)同源重組克隆；⑶ pAd-Ang-l-IRES-VEGF165同源重組克隆質(zhì)粒(DH5 α )分子量大小鑒定1. pAdEasy-1 ；2. pA dTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165 ；3 7.分別為圖7(D)中的5個(gè)同源重組克隆；圖8是實(shí)施例一中同源重組質(zhì)粒PCR鑒定圖，其中，1. pAd-IRES為模板，P1， P2為引物IRES PCR陽性產(chǎn)物；2. pAd-IRES為模板，P3，P4為引物VEGF165PCR產(chǎn)物為陰性；3. pAd-IRES 為模板，P5，P6 為引物 Ang-IPCR 產(chǎn)物為陰性；4. pAd-IRES_VEGF165 為模板，Pl，P2為引物IRES PCR陽性產(chǎn)物；5. pAd-IRES_VEGF165為模板，P3，P4為引物 VEGF165PCR 陽性產(chǎn)物；6. pAd-IRES_VEGF165 為模板，P5, P6 為引物 Ang-IPCR 產(chǎn)物為陰性；7. pAd-Ang-1-IRES 為模板，Pl，P2 為引物 IRES PCR 陽性產(chǎn)物；8. pAd-Ang-1-IRES 為模板，P3，P4為引物VEGF165PCR產(chǎn)物為陰性；9. pAd-Ang-1-IRES為模板，P5，P6為引物 Ang-IPCR 陽性產(chǎn)物；10. pAd-Ang-l-IRES_VEGF165 為模板，Pl，P2 為引物 IRES PCR 陽性產(chǎn)物；11. pAd-Ang-l-IRES-VEGF165 為模板，P3，P4 為引物 VEGF165PCR 陽性產(chǎn)物； 12. pAd-Ang-l-IRES-VEGF165 為模板，P5, P6 為引物 Ang-IPCR 陽性產(chǎn)物；M. DL2000marker ；圖9是實(shí)施例一中同源重組質(zhì)粒I^cI酶切鑒定圖，其中，(A)pAd-IRES質(zhì)粒 PacI 酶切鑒定l.pAd-IRES PacI 酶切；Μ· λ -Hind III digest DNAmarker ； (B) pAd-IRES-VEGF165 質(zhì)粒 PacI 酶切鑒定1. pAd-IRES_VEGF165PacI 酶切；Μ· λ -Hind III digest DNA marker ； (C) pAd-Ang-l-IRES 質(zhì)粒 PacI 酶切鑒定:1. pAd-Ang-l-IRES PacI 酶切；Μ. λ -Hind III digest DNA marker ; (D) pAd-Ang-l-IRES_VEGF165質(zhì)粒PacI 酶切鑒定
1.pAd-Ang-l-IRES-VEGF165PacI 酶切；Μ· λ -Hind III digest DNA marker ；圖10是實(shí)施例一中各組重組腺病毒感染QBH93A細(xì)胞光鏡和熒光照片，其中，A. QBI-293A ;B.QBI-293A+Ad-IRES ;C.QBI-293A+Ad-IRES-VEGF165 ；
D.QBI-293A+Ad-Ang-1-IRES；Ε.QBI-293A+Ad-Ang-1-1RES-VEGF165 ；圖11是實(shí)施例一中VEGF165和Ang-I基因在QBH93A細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄鑒定 (RT-PCR)圖，其中，圖A 1. QBI-293A，P3，P4為引物；2. QBI-293A，P1，P2為引物 IRES RT-PCR 產(chǎn)物為陰性；3. QBI-293A, P5, P6 為引物；M. DL2000marker ；圖 B 1. QBI-293A+Ad-IRES, Pl, P2 為引物；2. QBH93A+Ad-IRES，P3, P4 為引物；3. QBH93A+Ad_IRES，P5, P6 為弓丨物；M. DL2000marker ；圖 C 1. QBU93A+Ad-IRES_VEGF165，Pl，P2 為弓丨物；
2.QBI-293A+Ad-IRES-VEGF165, P3, P4 為弓丨物；3. QBI-293A+Ad-IRES_VEGF165，P5, P6 為引物；M. DL2000marker ；圖 D. 1. QBH93A+Ad-Ang-1_IRES，Pl，P2 為引物； 2. QBI-293A+Ad-Ang-1-IRES, P3, P4 為引物；3. QBI-293A+Ad-Ang-1-IRES, P5, P6 為引物； M. DL2000marker ；圖 Ε. 1. QBI-293A+Ad-Ang-1 -1RES-VEGF165, P1,P2 為引物 IRESRT-PCR 產(chǎn)物；2. QBI-293A+Ad-Ang-1 -1RES-VEGF165, P3, P4 為引物 VEGF165RT-PCR 產(chǎn)物；3. QBI-293A +Ad-Ang-1-IRES-VEGF165, P5, P6 為引物 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物；Μ. DL2000marker ；圖12是實(shí)施例一中ELISA法檢測Ad_Ang-l/VEGF165在細(xì)胞培養(yǎng)上清中 VEGF165和Ang-I蛋白的表達(dá)水平圖；圖13是實(shí)施例二中VEGF165和Ang-I重組腺病毒促CAM血管形成活性檢測圖；圖14是實(shí)施例二中各組重組腺病毒感染EPCs細(xì)胞光鏡和熒光照片，其中，A. EPCs ；B.EPCs+Ad-IRES ；C.EPCs+Ad-IRES_VEGF165 ；D.EPCs+Ad-Ang-1-IRES ；
E.EPCs+Ad-Ang-l-IRES-VEGF165；
圖15是實(shí)施例二中VEGF165ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖16是實(shí)施例二中Ang-IELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖17是實(shí)施例三中125I-Tf (Fe)2標(biāo)記的EPCs在心肌梗塞兔活體內(nèi)分布的動態(tài)觀察圖；圖18是實(shí)施例三中EPCs注射M小時(shí)后在各臟器內(nèi)的分布圖，其中，1.血液； 2.腦；3.肺；4.心；5.肝臟；6.脾臟；7.腎臟；8.腸；9.肌肉；10.甲狀腺；圖19是實(shí)施例三中RT-PCR鑒定外源性VEGF165和Ang-I基因在兔缺血心肌中的轉(zhuǎn)錄，其中，1.未治療組，Pl，P2為引物IRES RT-PCR產(chǎn)物為陰性；2.未治療組， P3，P4為引物VEGF165RT-PCR產(chǎn)物為陰性；3.未治療組，P5，P6為引物Ang-IRT-PCR產(chǎn)物為陰性；4. EPCs治療組，PI, P2為引物IRES RT-PCR產(chǎn)物為陰性；5. EPCs治療組，P3， P4為引物VEGF165RT-PCR產(chǎn)物為陰性；6. EPCs治療組，P5，P6為引物Ang-IRT-PCR產(chǎn)物為陰性；7. EPCs+Ad-IRES 治療組，Pl，P2 為引物 IRES RT-PCR 產(chǎn)物；8. EPCs+Ad-IRES 治療組，P3, P4 為引物 VEGF165RT-PCR 產(chǎn)物為陰性；9. EPCs+Ad-IRES, P5, P6 為引物 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物為陰性；10. EPCs+Ad-IRES_VEGF165 治療組，Pl，P2 為引物 IRES RT-PCR 產(chǎn)物；11. EPCs+Ad-IRES-VEGF165 治療組，P3，P4 為弓丨物 VEGF165RT-PCR 產(chǎn)物；12. EPCs+Ad-IRES-VEGF165 治療組，P5，P6 為引物 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物為陰性； 13. EPCs+Ad-Ang-1-IRES 治療組，P1，P2 為引物 IRES RT-PCR產(chǎn)物；14. EPCs+Ad-Ang-1-IRES 治療組，P3，P4 為引物 VEGF165RT-PCR 產(chǎn)物為陰性；15. EPCs+Ad-Ang-1-IRES 治療組，P5， P6 為引物 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物；16. EPCs+Ad-Ang-l-IRES_VEGF165 治療組，Pl，P2 為引物 IRES RT-PCR產(chǎn)物；17. EPCs+Ad-Ang-l-IRES_VEGF165 治療組，P3，P4 為引物 VEGF165RT-PCR 產(chǎn)物；18. EPCs+Ad-Ang-l-IRES-VEGF165 治療組，P5，P6 為弓丨物 Ang-IRT-PCR 產(chǎn)物； M.DL2000marker ；圖20是實(shí)施例三中vWF因子的免疫組織化學(xué)染色照片；圖21是實(shí)施例三中α -actin的免疫組織化學(xué)染色照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一VEGF165和Ang-I雙基因重組載體的構(gòu)建和鑒定，采用IRES介導(dǎo)的 VEGF165和Ang-I雙基因腺病毒共表達(dá)模式，示意圖如圖1所示。(1)材料Bgl II、Sal I、Not I、Xho I 禾Π EcoR V 限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、 DL2000marker、Taq DNA 聚合酶、dNTPmix、Oligo d(T)18 購自 TaKaRa 公司；逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV、 λ -Hind III digest DNA marker和低分子量蛋白marker購自MBI公司；日常型小量質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物清潔試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；pGEZ-krm質(zhì)粒、pSV-K3-VEGF165質(zhì)粒、大腸桿菌DH5a由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室楊吉成教授惠贈；GFP標(biāo)記的pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-Ι、大腸桿菌BJ5183、腺病毒包裝細(xì)胞QBH93A由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)教研室鐘江教授惠贈；RPMI1640購自GIBCO公司；小牛血清購自杭州四季青公司；24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)購自CORNING公司；人VEGF165抗體[VEGF(A_20) :sc-152_G]、人Ang-I抗體[Ang-1 (C-19) :sc-6320]和兔抗山羊IgG-AP 二抗購自Santa Cruz公司；引物(如表1)、 UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉等生化試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司。表1 PCR擴(kuò)增所用引物及其序列
引物編號和名稱引物序列產(chǎn)物大小SEQ ID No. 1，Pl IRES 上游5 ‘ -accgtcgacaattccgcccctctccctcccccccccctaa-3 ‘581bpSEQID No. 2, P2 IRES 下游5，-gacgcggccgcttatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccac-3 ‘SEQIDNo. 3,P3 VEGF165 下游5 ‘ -gcactcgagatgaactttctgctgtcttgggtg-3 ‘576bpSEQID No. 4, P4 VEGF165 下游5'- taagatatctcaccgcctcggcttgtcacatc-3 ‘SEQ ID No. 5, P5 Ang-I 上游5 ‘ -tagagatctatgacagttttcctttcctttgc-3，1497bpSEQID No. 6，P6 Ang-I 下游5，-accgtcgactcaaaaatctaaaggtcgaatcatc-3 ‘(2)pAdTrack-CMV-IRES改造空轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建PCR獲得IRES目的片段比對IRES的保守序列，設(shè)計(jì)引物Pl、P2(如表1)，以含有IRES片段的pGEZ-Term質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增IRES目的片段，兩端分別引入Ml I、Not I酶切位點(diǎn)，獲得的IRES PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。結(jié)果表明擴(kuò)增出IRES目的基因片段大小與預(yù)期擴(kuò)增的IRES理論值大小(581bp)相一致[圖2(A)]。IRES片段亞克隆于pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒將DNA清潔試劑盒純化的IRES PCR 產(chǎn)物和日常型小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV分別用Ml I、Not I 37°C雙酶切證后，割膠回收目的片段，并用T4DNA連接酶將其4°C連接過夜，繼而連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a和KanaGOyg/ml)篩選挑單克隆，并用PCR、雙酶切鑒定和DNA序列測定，陽性克隆菌保種備用。結(jié)果表明重組載體PAdTrack-CMV-IRES經(jīng)PCR能擴(kuò)增出約 581bp大小的條帶[圖2(B)]和Ml I、Not I雙酶切同樣能釋放出相同大小的片段[圖 2(C)]，均表明IRES目的基因片段已成功亞克隆于pAdTrack-CMV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中。DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)成功構(gòu)建了 pAdTrack-CMV-IRES改造空轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。(3)pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建以含有VEGF165基因片段的pSV_K3_VEGF165質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增VEGF165目的片段，兩端分別引入》io I、EcoR V酶切位點(diǎn)，獲得的VEGF165PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。結(jié)果表明擴(kuò)增出VEGF165目的基因片段，其大小與預(yù)期擴(kuò)增的VEGF165理論值大小(576bp) 相一致[圖3(A)]。將純化的VEGF165PCR產(chǎn)物和日常型小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提的改造轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-IRES分別用Bio I、EcoRV 37°C雙酶切釙后，割膠回收目的片段，并用T4DNA連接酶將其4°C連接過夜，繼而連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α和Kana篩選挑單克隆，并用PCR、雙酶切鑒定和DNA序列測定，陽性克隆菌保種備用。結(jié)果表明重組載體 pAdTrack-CMV-1RES-VEGF165 經(jīng) PCR 能擴(kuò)增出約 576bp 大小的條帶[圖 3 (B)]；經(jīng) Xho I、 EcoR V雙酶切同樣能釋放出576bp大小的片段[圖3 (C)]；經(jīng)Ml I、EcoR V雙酶切能釋放出1157bp大小的IRES+VEGF165片段[圖3 (D)]，均表明VEGF165目的基因片段已成功亞克隆于pAdTrack-CMV-IRES改造空轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中。DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)成功構(gòu)建了 pAdTrack-CMV-1RES-VEGF165單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。(4) pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
Ang-I基因的克隆根據(jù)GenBank (登陸號NM_001146)報(bào)道的人Ang-IcDNA序列設(shè)計(jì)上下游引物P5、P6 (如表1)，以骨髓細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR擴(kuò)增 Ang-I目的基因片段，兩端分別引入Bgl II, Sal I酶切位點(diǎn)，獲得的Ang-IRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。結(jié)果表明擴(kuò)增出Ang-I目的基因片段，其大小與預(yù)期擴(kuò)增的Ang-I理論值大小相一致[圖4(A)]。將上述純化的Ang-IRT-PCR產(chǎn)物和日常型小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PAdTrack-CMV-IRES分別用Bgl II, Sal I 37°C雙酶切釙后，割膠回收目的片段，并用T4DNA連接酶將其4°C連接過夜，繼而連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α和Kana篩選挑單克隆，并用PCR、雙酶切鑒定和DNA序列測定，陽性克隆菌保種備用。結(jié)果表明重組載體 pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 經(jīng) PCR 能擴(kuò)增出約 1497bp 大小的條帶[圖 4(B)]；經(jīng) Bgl II、 Sal I雙酶切同樣能釋放出1497bp大小的片段[圖4(C)]；經(jīng)Bgl II、Not I雙酶切能釋放出2078bp大小的Ang-1+IRES片段[圖4 (D)]，均表明Ang-I目的基因片段已成功亞克隆于pAdTrack-CMV-IRES改造空轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中。DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)成功構(gòu)建了 pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。(5)pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165 雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建在pAdTrack-CMV-IRES_VEGF165單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建的基礎(chǔ)上，將以反轉(zhuǎn)錄合成的骨髓細(xì)胞總RNA的cDNA為模板，P5、P6為引物RT-PCR擴(kuò)增的Ang-I目的基因片段[圖5(A)]進(jìn)一步亞克隆于pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中構(gòu)建pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。重組載體 pAdTrack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF165 經(jīng) PCR 能擴(kuò)增出約 1497bp 大小的條帶[圖 5 (B)]；經(jīng) Bgl II、Mil雙酶切同樣能釋放出1497bp大小的片段[圖5(C)]；經(jīng)B gl II, EcoR V雙酶切能釋放出26Mbp 大小的Ang-1+IRES+VEGF165片段[圖5 (D)]，均表明Ang-I目的基因片段已成功亞克隆于pAdTrack-CMV-IRES-VEGF165單基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中。DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)成功構(gòu)建了 pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。(6)重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建將上述構(gòu)建的pAdTrack-CMV-IRES、pAdTrack-CMV-1RES-VEGF165, pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES 和 pA(Trrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用^ie I 37°C單酶切池線性化后，分別與pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒氯化鈣法共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌，Kana篩選挑單克隆抽提質(zhì)粒，瓊脂糖電泳根據(jù)分子量大小初步篩選 pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-IRES (簡稱為 pAd-IRES)、pAdEasy-1-pAdTrac k-CMV-IRES-VEGF165(簡稱為 pAd-IRES-VEGFl^)、pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-Ang-I-IRES (簡稱為 pAd-Ang-1-IRES)和 pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEG Fl65 (簡稱為pAd-Ang-l-IRES-VEGF165)同源重組克隆，瓊脂糖電泳(圖6)結(jié)果表明，pAdTrack-CMV-IRES與pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)化組所挑的6個(gè)克隆有3個(gè)為陽性克?。?pAdTr ack-CMV-1RES-VEGF16 5與pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)化組所挑的6個(gè)克隆有4個(gè)為陽性克??；pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES與pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)化組所挑的6個(gè)克隆均為陽性克?。?pAdTrack-CMV-Ang-1 -1RES-VEGF165與pAdEasy-Ι共轉(zhuǎn)化組所挑的6個(gè)克隆有5個(gè)為陽性克隆。將上述各組同源重組陽性克隆分別轉(zhuǎn)化DH5 α后抽提質(zhì)粒(圖7)，并選擇某一初步確定的同源重組陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定(圖8)均可見預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物和I^acI酶切鑒定(圖9)均可獲得301Λ大小的腺病毒基因組片段和獨(dú)特的4. 5kb大小的ori及卡那霉素抗性編碼基因片段。(7)重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及其效價(jià)檢測將構(gòu)建的pAd-IRES、pAd-IRES_VEGF165、pAd-Ang-l-IRES 禾口 pAd-Ang-l-IRES-VEGF165同源重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)I^ac I線性化后膠回收大片段，按 LipofectamineTM2000操作說明分別轉(zhuǎn)染70%貼壁的QBH93A細(xì)胞。Pac I線性化的 pAd-IRES、pAd-IRES-VEGF165、pAd-Ang-1-IRES 和 pAd-Ang-l-IRES_VEGF165 同源重組質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamin脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染QBH93A細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見GFP的表達(dá)， 且熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染IOd后分別收集Ad-IRES、Ad-IRES-VEGF165、 Ad-Ang-I-IRES 和 Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 第一代病毒，再二次感染 QBI-293A 細(xì)胞， 在倒置熒光顯微鏡下可觀察到熒光，并出現(xiàn)CPE，結(jié)果表明Ad-IRES、Ad-IRES-VEGF165、 Ad-Ang-I-IRES 和 Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 在 QBH93A 細(xì)胞中包裝成功。二次感染 4_6d 后，收集細(xì)胞，用PBS懸浮，反復(fù)凍融獲得Ad-IRES、Ad-IRES-VEGF165、Ad-Ang-I-IRES 和 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165第三代重組病毒子粗提液，并經(jīng)多輪感染、擴(kuò)增和CsCl梯度離心純化后，最終分別獲得5 X 1010pfu/ml滴度的Ad-IRES病毒子、2 X 1010pfu/ml滴度的 Ad-IRES-VEGF165 病毒子、3X 101Qpfu/ml 滴度的 Ad-Ang-I-IRES 病毒子和 4X 10lclpfu/ml 滴度的 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165 病毒子于 _80°C保存?zhèn)溆?。Ad-IRES、Ad-IRES_VEGF165、 Ad-Ang-I-IRES 和 Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 感染 QBH93A 細(xì)胞光鏡 CPE 和熒光照片如圖 10。其中，重組腺病毒的效價(jià)檢測的方法為將對數(shù)生長期的QBH93A細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X IO5個(gè)/ml，在96孔板上按每孔100 μ 1接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，將收獲的 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165、Ad-Ang-l-IRES、Ad-IRES_VEGF165 重組腺病毒和空載體 Ad-IRES腺病毒作10_4、10_5、10_6、10_7稀釋后，每個(gè)稀釋度按每孔100 μ 1接種3孔，37°C,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1 后，熒光顯微鏡下，進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，按病毒效價(jià)(pfu/ml)=(每孔熒光平均數(shù)X 10)/稀釋度公式計(jì)算病毒效價(jià)。(8)重組腺病毒的鑒定RT-PCR 鑒定用 10M0I 的 Ad-Ang-1-IRES_VEGF165、Ad-Ang-1-IRES、 Ad-IRES-VEGF165重組腺病毒和空載體Ad-IRES腺病毒分別感染QBH93A細(xì)胞4 后， 1000r/min離心5min收集上述病毒感染細(xì)胞和未感染病毒的QBH93A細(xì)胞對照，PBS洗滌 2 3次，按UNIQ-IO柱式1Trizol總RNA抽提試劑盒說明書操作提取各組QBH93A細(xì)胞總 RNA，用上述引物 P1、P2 ；P3、P4 ；P5、P6 進(jìn)行 RT-PCR，分別鑒定 IRES、VEGF165 和 Ang-I 基因在QBH93A細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄?？俁NA提取和RT-PCR體系和條件同前。結(jié)果見圖11 :Ad-Ang-l-IRES-VEGF165感染組可產(chǎn)生預(yù)期大小的581bpIRES、 576bp VEGF165和1497Ang_lPCR產(chǎn)物；Ad-IRES_VEGF165感染組均可產(chǎn)生預(yù)期大小的581bp IRES 和 576bp VEGF165PCR 產(chǎn)物，而相應(yīng)位置未產(chǎn)生 1497Ang-lPCR 產(chǎn)物；Ad-Ang-I-IRES 感染組可產(chǎn)生預(yù)期大小的58 IbpIRES和1497Ang-lPCR產(chǎn)物，而相應(yīng)位置未產(chǎn)生576bp VEGF165PCR產(chǎn)物；Ad-IRES感染組可產(chǎn)生預(yù)期大小的581bp IRES PCR產(chǎn)物，而相應(yīng)位置未產(chǎn)生VEGF165和1497Ang_lPCR產(chǎn)物；QBH93A未感染病毒的細(xì)胞對照組在相應(yīng)位置均未產(chǎn)生上述條帶。RT-PCR鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165 (雙基因)、
11Ad-Ang-I-IRES (單基因)、Ad-IRES_VEGF165 (單基因)、Ad-IRES (空載體)腺病毒。ELISA 法檢測 Ad_Ang-l/VEGF165 在 293A 細(xì)胞中 VEGF165 和 Ang-I 蛋白的表達(dá) 用 10M0I 的 Ad-Ang-l-IRES-VEGF165、Ad-Ang-l-IRES、Ad-IRES-VEGF165 重組腺病毒和空載體Ad-IRES腺病毒分別感染QBH93A細(xì)胞4 后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA檢測試劑盒分別測定上清中Ang-I和VEGF的含量。結(jié)果見圖12和表2，進(jìn)一步表明IRES介導(dǎo)的VEGF165和Ang-I雙基因腺病毒表達(dá)載體導(dǎo)入的外源VEGF165和Ang-I基因均能成功地表達(dá)。表2 ELISA 法檢測 Ad_Ang-l/VEGF165 在細(xì)胞培養(yǎng)上清中 VEGF165 和 Ang-I 蛋白的表達(dá)水平(pg/ml)
實(shí)驗(yàn)組別Ang-I(pg/ml)VEGF165(pg/ml)293A細(xì)胞對照2490. 86 ±550. 956455. 33±653. 68Ad-IRES空白對照2323. 20 + 260. 556074. 51 ±629. 58Ad-IRES-Angl47022. 53±3685. 576274. 51 + 609. 59Ad-IRES-VEGF16538783. 13±3449. 9510367. 12±1401. 22Ad-IRES-Angl-VEGF72652. 53±4286. 029558. 13±1221. 21實(shí)施例二 實(shí)施例一所得VEGF165和Ang-I雙基因腺病毒載體體外感染外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(1)材料8d雞胚購自蘇州市孵化場；平陽霉素(PYM)購自蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院；24孔和 6孔細(xì)胞培養(yǎng)購自CORNING公司；RPMI1640購自GIBCO公司；小牛血清購自杭州四季青公司；人 VEGF165 抗體[VEGF(A-20) :sc-152_G]、人 Ang-I 抗體[Ang-1 (C-19) :sc_6320]購自 Santa Cruz公司；免疫熒光染色試劑盒-抗山羊Cy3購自碧云天生物技術(shù)研究所；人VEGF、 Ang-IELISA檢測試劑盒購自晶美公司。(2) VEGF165和Ang-I重組腺病毒的活性檢測(CAM試驗(yàn))將孵育8d的生長狀態(tài)良好的雞胚隨機(jī)分成6組=Ad-IRES空載體組、 Ad-IRES-VEGF165 單基因組、Ad-Ang-I-IRES 單基因組、Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 雙基因組、NS組和平陽霉素(PYM)組(作為陰性對照)，每組6只雞胚。將Ad-IRES空載體組、 Ad-IRES-VEGF165 單基因組、Ad-Ang-I-IRES 單基因組和 Ad-Ang-1-IRES_VEGF165 雙基因組 4組腺病毒子用PBS稀釋均調(diào)整為IX IO8個(gè)/ml的濃度；平陽霉素(PYM)用PBS配置，濃度為10mg/L。用碘酒棉球擦拭雞胚的氣室端蛋殼，并用無菌鑷子扎一小孔和撕掉內(nèi)殼膜，暴露 CAM。將已滅菌的直徑為5mm的濾紙小圓片浸泡上述各組50 μ 1樣品液后置于CAM表面的中央，加藥完畢用透明膠帶紙封貼。孵育3d后，撕開透明膠帶紙，加入甲醛與丙酮(1 1) 的固定液固定lOmin，取下CAM，將其平鋪于載玻片上，對血管進(jìn)行分類，主干血管定為一級血管，主干血管的分支血管定為二級血管，二級血管以下的分支定為三級血管，計(jì)算濾紙周圍5mm范圍內(nèi)的血管主干和各級分支，以檢測腺病毒介導(dǎo)的VEGF165和Ang-I的促CAM血管形成活性。結(jié)果參見圖13 和表 3，可見Ad-IRES-VEGF165 組、Ad-Ang-1-IRES 組和 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165組較NS組CAM血管生長更旺盛，毛細(xì)血管更豐富，呈彌漫狀、放射狀血管形成，而Ad-IRES空載體組與NS比較無差別；Ad-IRES-VEGF165和Ad-Ang-I-IRES 兩組單基因組比較，其促CAM血管形成活性Ad-Ang-I-IRES要優(yōu)于Ad-IRES_VEGF165 ； Ad-Ang-1-IRES-VEGF165 雙基因組與 Ad-IRES_VEGF165 和 Ad-Ang-I-IRES 兩組單基因組比較，其促CAM血管形成能力均強(qiáng)于Ad-Ang-I-IRES和Ad-IRES_VEGF165單基因組。結(jié)果表明所構(gòu)建的VEGF165和Ang-I重組腺病毒具有明顯的促CAM血管形成活性，且呈顯著的協(xié)同效應(yīng)。表3 VEGF165和Ang-I的促CAM血管形成的比較(X±5D, n = 6)
權(quán)利要求
1.一種含有人VEGF165和人Ang-I雙基因共表達(dá)載體的大腸桿菌，該大腸桿菌的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2010年5月 16 日；保藏編號 CCTCC NO =M 2010117;分類命名大腸桿菌 DH5 α/pAcTTrack-CMV-hAng-l -IRES-hVEGF165 ；Escherichiacoli DH5 α /PAdTrack-CMV-hAng-l-IRES-hVEGF165 ；所述雙基因共表達(dá)載體為 pAcWrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGFieS。
2.一種含有人VEGF165和人Ang-I雙基因共表達(dá)載體，其特征在于，所述雙基因共表達(dá)載體為 pAcWrack-CMV-Ang-1 -IRES-VEGF165。
3.VEGF165和Ang-I雙基因共表達(dá)重組腺病毒，所述雙基因共表達(dá)重組腺病毒為 Ad-Ang-1-IRES-VEGF165。
4.pAdTrack-CMV-Ang-l-IRES-VEGF165雙基因重組轉(zhuǎn)移載體在制備促進(jìn)缺血心肌的血管新生藥物中的應(yīng)用。
5.Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒在制備促進(jìn)缺血心肌的血管新生藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)載體，所述雙基因共表達(dá)載體含有人基因VEGF165和人Ang-1基因，所述雙基因共表達(dá)載體為pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165；將上述雙基因重組轉(zhuǎn)移載體與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1同源重組后，在QBI-293A細(xì)胞中包裝和擴(kuò)增獲得Ad-Ang-1-IRES-VEGF165雙基因共表達(dá)重組腺病毒，然后用攜帶VEGF和Ang-1的雙基因重組腺病毒感染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，可促進(jìn)缺血心肌的血管新生和改善心功能。
文檔編號C12N7/01GK102191209SQ201010263189
公開日2011年9月21日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者馮星, 呂海濤, 周亞鋒, 李紅霞, 楊吉成, 楊向軍, 盛偉華, 謝宇鋒, 韓蓮花 申請人:蘇州大學(xué)