專利名稱：含有豬細(xì)小病毒vp2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，屬于 基因工程疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生長抑素(somatostatin，SS)是一種腦腸肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道 組織中，是一種能夠抑制生長激素(GH)釋放的低分子堿性肽。Brazeau等從羊下丘腦中分 離出了 SS，此后人們對SS的產(chǎn)生、分布及生物活性做了大量研究，并測定了它的一級結(jié)構(gòu) 為一含14個氨基酸的多肽。哺乳動物下丘腦分泌生長激素釋放因子(GHRF)和生長抑素 (SS)，調(diào)節(jié)垂體生長激素(GH)的分泌，進(jìn)而作用于靶器官，如肝臟，產(chǎn)生胰島素樣生長因子 (IGFs)，從而調(diào)節(jié)組織器官的生長發(fā)育。由于GHRF刺激生長激素的釋放，SS抑制GH分泌 細(xì)胞的分泌，因此，在理論上，刺激GHRF或抑制SS的分泌或釋放，或者同時對GHRF釋放進(jìn) 行刺激而對SS的釋放進(jìn)行抑制的技術(shù)路線，就有可能提高垂體GH分泌細(xì)胞的釋放，最終達(dá) 到促進(jìn)動物生長的目的。豬細(xì)小病毒(PPV)基因組編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是￥ 1、￥ 2、￥ 3。其中VP2是構(gòu) 成病毒粒子的主要衣殼蛋白，具有血凝活性，約占病毒衣殼蛋白總量的80 %，VP2蛋白攜帶 主要的抗原決定簇，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，VP2對病毒感染、發(fā)揮其致病性方面 亦起關(guān)鍵作用。VP2蛋白在體外表達(dá)時可自主裝配，能自動形成完整的病毒樣顆粒，具有良 好的免疫原性，成為病毒疫苗研究的主要方向。病毒樣顆粒(virus-like particles VLPs) 是某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白裝配成的空心顆粒，它既具有類似天然病毒的穩(wěn)定性和 免疫原性，又具備攜帶外源蛋白或多肽的潛能，不含有病毒的核酸沒有感染性，使其有望成 為構(gòu)建多價疫苗的良好載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆 粒，既能預(yù)防豬感染細(xì)小病毒又能提高豬生長速度；本發(fā)明同時提供該病毒樣顆粒在制備 預(yù)防豬感染細(xì)小病毒、提高豬生長速度的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，由如下方法 制備而得(1)獲取目的基因采用正向引物Pl和反向引物P2擴增豬細(xì)小病毒VP2基因，采 用人工合成方法獲得兩端分別添加了酶切位點的4拷貝的生長抑素的基因序列，所述4拷 貝的生長抑素的基因序列為SS4 ；所述正向引物Pl的序列為5' -cgggatccagccggctgcaagaacttcttctggaagaccttcacctcctgcactgaattgtctgc a-3，，所述反向引物P2的序列為
5' -cgcctcgagctagtataattttcttggtat-3'；
(2)構(gòu)建及鑒定重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2 ；(3)構(gòu)建及鑒定重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2 ；(4)獲得穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2 ；(5)將所述的病毒rBac-SS4-VP2感染sf_9昆蟲細(xì)胞，獲得含有豬細(xì)小病毒VP2和 生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒。所述4拷貝生長抑素的基因序列5’端添加BamH I酶切位點、3’端添加Bg III酶 切位點。步驟(2)所述重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2構(gòu)建及鑒定方法如下將VP2基因克 隆至轉(zhuǎn)移載體PFastBac HT A中，經(jīng)酶切，測序，鑒定陽性質(zhì)粒命名為pFast-VP2 ；該質(zhì)粒 pFast-VP2經(jīng)酶切、去磷酸化后與SS4連接，再經(jīng)酶切，測序，鑒定為陽性的質(zhì)粒為重組轉(zhuǎn)移 載體 pFast-SS4-VP2。步驟(3)重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2的構(gòu)建與鑒定方法為將重組載體 pFast-SS4-VP2轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭質(zhì)粒Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac中，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選和 PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒即為重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2 ；所述PCR鑒定中采用桿狀病毒 通用引物，上游引物為GTTTTCCCAGTCACGAC，下游引物為CAGGAAACAGCTATGAC。步驟⑷獲得穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2的方法為重組穿梭載體 rBacmid-SS4-VP2轉(zhuǎn)染sf_9昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行重組桿狀病毒的擴增，提取擴增后的重組桿狀 病毒的基因組DNA，經(jīng)PCR鑒定為陽性者即為穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2 ；所述PCR 鑒定中的引物為引物Pl和P2。步驟(5)中將所述病毒rBac-SS4-VP2接種sf_9昆蟲細(xì)胞，收集病變的sf_9昆 蟲細(xì)胞，將該病變細(xì)胞破碎后進(jìn)行離心，獲得上清液，采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行蛋白沉淀；將 所述蛋白沉淀懸浮于緩沖液中，滅活病毒rBacmid-SS4-VP2后除鹽，超濾，得到豬細(xì)小病毒 VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒。本發(fā)明還提供含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒在制備預(yù) 防豬感染細(xì)小病毒、提高豬生長速度的疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，既能預(yù)防豬感染 細(xì)小病毒又能提高豬生長速度；以該病毒樣顆粒作為抗原、以白油或鋁膠作為佐劑的疫苗 免疫清潔級小鼠，加強免疫后2周可以檢測到較高的豬細(xì)小病毒抗體，加強免疫后4周時抗 體升至最高；免疫后血清中生長激素和胰島素樣細(xì)胞因子的含量明顯升高，即表達(dá)的嵌合 蛋白發(fā)揮了促進(jìn)機體生長的作用。本發(fā)明的病毒樣顆粒能夠安全有效的預(yù)防豬細(xì)小病毒、 提高豬生長速度。
四


圖1是重組質(zhì)粒pFast-SS4_VP2的BamH I和Xho I酶切后的電泳圖，圖中 M-Marker DL2000,1-酶切后重組質(zhì)粒 pFast_SS4_VP2。圖 2 是 rBacmid-SS4-VP2 的 PCR 鑒定的電泳圖，圖中M_Marker DL15000, 1-rBacmid-pFast ； 2-rBacmid-SS4_VP2。圖3是rBac-SS4_VP2基因組的PCR鑒定的電泳圖，圖中l(wèi)-rBac_SS4-VP2基因組，M-Marker DL2000圖4是不同感染復(fù)數(shù)條件下獲得重組蛋白SS4-VP2的SDS-PAGE電泳圖，圖中1-空載體Bacmid, 2_感染復(fù)數(shù)0. 01,3-感染復(fù)數(shù)0. 05,4-感染復(fù)數(shù)0. 1,5-感染 復(fù)數(shù)0.5，M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖 5 是嵌合蛋白 SS4-VP2 的 Western-blotting 電泳圖，圖中:1_0· 2M0I 感染 Sf9 細(xì)胞獲得蛋白、2-0. 5M0I感染Sf-9細(xì)胞獲得蛋白，3-野毒感染Sf9細(xì)胞獲得蛋白，M-蛋白 分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6中的A圖是rBacmid-SS4-VP2感染sf_9細(xì)胞的間接免疫熒光(IFA)檢測圖， B圖是空載體Bacmid感染sf_9細(xì)胞的IFA檢測圖，C圖是正常sf_9細(xì)胞的IFA檢測圖。圖7中的A圖是rBacmid-SS4-VP2感染sf_9細(xì)胞后的電鏡觀察圖，B圖是空載體 Bacmid感染sf-9細(xì)胞后的電鏡觀察圖。圖8表示不同免疫時期各試驗組的血清PPV抗體水平。圖9表示不同免疫時期各試驗組的血清生長抑素抗體水平。圖10表示不同時期各試驗組的血清GH水平。
五
具體實施例方式實施例1含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒的制備1)目的基因的獲得參照GenBank 公布的 PPV NJ-I 株的 vp2 基因(登錄號AY781130)，用 Primer Premier 5. 0生物軟件設(shè)計出兩條引物，用于擴增VP2全基因。正向引物Pl為5' -cgggatccagccggctgcaagaacttcttctggaagaccttcacctcctgcactgaattgtctgc a-3，反向引物P2為5， -cgcctcgagctagtataattttcttggtat-3，分別加入BamHI和XhoI酶切位點，以PPV NJ-I株的DNA為模板，以P1，P2為引物 擴增VP2全基因序列，在1 %瓊脂糖凝膠電泳回收，連入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 E. coli DH5 α，堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切及測序鑒定正確，獲得陽性質(zhì)粒pMD18T_VP2。4 拷貝的生長抑素(SS)基因序列 SS4 為AAAAAGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGAC TTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTT GGAAGACTTTTACTTCTTGTGCTGGTTGTAAGAACTTTTTTTGGAAGACTTTTACTTCTTGTo 在 SS4 的 5，端 添加BamH I酶切位點、3’端添加Bg 1 II酶切位點，然后采用人工合成方法制備。2)重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2構(gòu)建及鑒定分別用BamH I禾Π Xho I雙酶切質(zhì)粒pMD18T_VP2和轉(zhuǎn)移載體pFastBac HT A，將 VP2片段和轉(zhuǎn)移載體pFastBac HT A純化后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞， 堿裂解法提取質(zhì)粒，BamH I和Xho I雙酶切及測序鑒定，將陽性質(zhì)粒命名為pFast-VP2。將 4拷貝的生長抑素(SS)基因用BamH I和Bg 1 II酶切，將pFast-VP2用BamH I單酶切，去 磷酸化后用T4DNA連接酶與4拷貝的生長抑素(SS4)基因連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，堿 裂解法提取質(zhì)粒，用BamH I和Blg II雙酶切，電泳圖上出現(xiàn)大小為1900bp左右的片段，則
5該質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，命名為pFast-SS4-VP2，即為重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2 (見圖1中的 編號1)。3)重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2的構(gòu)建與鑒定將重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4_VP2轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭質(zhì)粒Bacmid的100 μ 1 DHlOBac感 受態(tài)細(xì)胞，并涂布X-Gal/IPTG的篩選平板(含慶大霉素、卡那霉素及四環(huán)素抗性)，37°C溫 箱倒置避光培養(yǎng)36-48h，至藍(lán)白菌落出現(xiàn)。將X-Gal/IPTG(Kan/Tet/Gen)平板置于4°C冰 箱中30min，使菌落充分顯色，挑選白色單菌落，接種于含有三抗的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 過夜，涂布X-Gal/IPTG/ (Kan/Tet/Gen)平板，如此進(jìn)行三次藍(lán)白斑篩選，按Bac-to-Bac桿 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說明書中改良的堿裂解提取重組的Bacmid，用桿狀病毒通用引物對所提取 的重組Bacmid進(jìn)行PCR鑒定上游引物GTTTTCCCAGTCACGAC下游引物CAGGAAACAGCTATGAC擴增片段大小為4300bp左右的質(zhì)粒，即為陽性質(zhì)粒，命名為rBacmid-SS4-VP2，即 為重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2(見圖2中的編號2)。4)獲得穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的說明操作，將重組穿梭載體 rBaCmid-SS4-VP2轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的sf-9細(xì)胞，27°C靜置培養(yǎng)3d以上，收集病變細(xì)胞，蛋白 酶K-SDS-酚/氯仿提取擴增后的重組桿狀病毒基因組DNA，經(jīng)VP2特異性引物Pl、P2鑒定， 擴增片段大小為1900bp左右的為穩(wěn)定的重組病毒，命名為rBac-SS4-VP2，即為重組桿狀病 毒rBac-SS4-VP2(見圖3中的編號1)；5)獲得含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒擴增rBac-SS4-VP2，接種sf_9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后收集病變的sf_9昆蟲細(xì)胞，超聲 波裂解后，IOOOOrpm離心15min，收集上清(上清液中含有表達(dá)的嵌合蛋白SS4-VP2)，加入 pH7. 0飽和硫酸銨至終濃度20%，4°C攪拌過夜進(jìn)行沉淀，然后18000rpm離心lOmin，將沉淀 重懸于PBS中。加Triton X-100至濃縮物體積的1 %，Tributyl phosphate (TBP即磷酸三 丁酯)至濃縮物體積的0. 3%，用于滅活病毒rBacmid-SS4-VP2。室溫靜止30min后透析除 鹽，再用超濾管超濾離心，去除雜蛋白，得到嵌合蛋白SS4-VP2，即得到了豬細(xì)小病毒VP2和 生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒。6)嵌合蛋白的病毒樣顆粒的鑒定①重組蛋白SDS-PAGE鑒定及Western-Blot鑒定用rBacmid-SS4-VP2 分別以不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)0. 01、0. 05、0. 1、0. 5 來感染 Sf-9細(xì)胞，96h收集病變Sf-9昆蟲細(xì)胞，用PBS洗滌3次后，加上樣緩沖液煮沸l(wèi)Omin，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮蘭染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖4)，在lane2、lane3、lane4、lane5(分 別對應(yīng)感染復(fù)數(shù)0. 01,0. 05,0. 1,0. 5)中均出現(xiàn)一條大小約為64kD的特異性蛋白質(zhì)帶，與 目的蛋白分子量基本一致，而空載體對照BacmicKlanel)未出現(xiàn)該蛋白質(zhì)帶，幾個感染比 沒有明顯的區(qū)別，證明含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素的嵌合蛋白(SS4-VP2)獲得了表達(dá)。用rBacmid-SS4-VP2以MOI為0. 2,0. 5感染細(xì)胞，制備含有豬細(xì)小病毒VP2和生 長抑素的嵌合蛋白SS4-VP2，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜后，用含10% (質(zhì) 量濃度)脫脂乳的PBST封閉過夜；加入1 100稀釋的豬VP2蛋白陽性血清(武漢科前動
6物生物制品有限責(zé)任公司)室溫作用2h ；PBST洗滌三次，加入1 2000倍稀釋的羊抗豬 IgG-HRP (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)室溫作用2h ；洗三次，DAB (二氨基聯(lián)苯胺)顯色， 觀察特異蛋白條帶(圖5)。結(jié)果表明利用桿狀病毒體外表達(dá)的SS4-VP2蛋白可與豬VP2蛋 白陽性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，表達(dá)的嵌合蛋白具有生物學(xué)活性。②間接免疫熒光檢測將空載體Bacmid，rBacmid-SS4-VP2分別感染對數(shù)期生長的sf_9昆蟲細(xì)胞，待細(xì) 胞完全產(chǎn)生病變后，倒掉上清，用75% (體積濃度)的酒精固定40-60min;用含(質(zhì)量 濃度)BSA的PBS洗3次，自然風(fēng)干；加入1 100稀釋的豬細(xì)小病毒VP2蛋白豚鼠陽性血 清(已與野生桿狀病毒蛋白作用過)，37°C濕盒孵育2h ；用含1 % (質(zhì)量濃度)BSA的PBS 洗3次，自然風(fēng)干；加入1 50稀釋的FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗豚鼠二抗(北 京博奧森生物技術(shù)有限公司)，37°C作用30min ；用含1 % BSA(質(zhì)量濃度)的PBS洗3次， 自然風(fēng)干；熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示對應(yīng)于rBacmid-SS4-VP2的電鏡結(jié)果可見很強的 綠色熒光(對應(yīng)圖6中的A)，原因是重組蛋白SS4-VP2與豬細(xì)小病毒VP2蛋白豚鼠陽性血 清特異性反應(yīng)；而空載體BacmicK對應(yīng)圖6中的B)熒光很弱，正常sf_9細(xì)胞沒有熒光(對 應(yīng)圖6中的C)。結(jié)果表明rBac-SS4-VP2在sf_9細(xì)胞中獲得了表達(dá)。③電鏡觀察病毒樣顆粒用rBacmid-SS4-VP2以MOI為0. 05感染Sf_9細(xì)胞，120h待細(xì)胞完全病變后收毒， 用PBS洗三次，2000rpm離心沉淀細(xì)胞10min，2. 5% (體積濃度)戊二醛固定液(0. Imol/mL 磷酸緩沖液，PH 7. 4，含有2.5%的戊二醛)4°C固定過夜，做超薄切片，電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 在細(xì)胞中有聚集在一起、直徑為20 30nm的球形顆粒，該顆粒的形態(tài)、大小均與PPV的全 病毒粒子相近(圖7中的A圖)，是由SS4-VP2嵌合蛋白形成的病毒樣顆粒(CVLP)。空載 體Bacmid感染Sf9細(xì)胞的電鏡觀察，未見到相同的病毒粒子(圖7中的B圖)。實施例2嵌合蛋白的病毒樣顆粒的免疫原性評價(1)免疫程序選取清潔級小鼠60只，隨機分成4組。各試驗組抗原、佐劑及免疫方式如下表
組 小鼠數(shù)抗原/只佐 抗原/佐劑免疫方式
別 量劑 (ν/ν)
I15
II15
ΠΙ15
IV15
50pg SS4-VP2
50pg SS4-VP2
1111 1111
白油鋁膠 膠
后腿肌肉注 射
后腿肌肉注 射
后腿肌肉注 射
后腿肌肉注 射
5xl05 TCID5ivmlPPV (滅鋁
活)膠
等體積PBS鋁
免疫兩次，每次間隔2周，免疫后每周小鼠眼球采血，常規(guī)分離血清，-20°C保存待用。(2)豬細(xì)小病毒ELISA抗體(即PPV抗體)的檢測使用豬細(xì)小病毒ELISA抗體檢測試劑盒(武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司) 檢測血清中的抗體。將血清1 40稀釋后加入預(yù)包被的微孔板中，每孔加100yL。同樣 1 3稀釋陰、陽性對照血清(PPV抗體陰性、陽性)，陰、陽性對照各設(shè)2孔，每孔lOOyL。 另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加100 μ L稀釋液。37°C溫育30min ；洗滌3次后，每孔加 1 20000倍稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 100 μ L，37°C溫育Ih ；洗滌3次后，每孔加底物A液， B液(是試劑盒中的)各一滴，混勻室溫避光顯色I(xiàn)Omin ；每孔加終止液一滴，IOmin內(nèi)測定 0D·。試驗結(jié)果(見圖8)表明，桿狀病毒表達(dá)的SS4-VP2產(chǎn)生較高的ELISA抗體，鋁膠佐 劑的效果優(yōu)于白油佐劑，全病毒滅活疫苗產(chǎn)生的抗體最高。(3)生長抑素(SS)抗體ELISA檢測結(jié)果以生長抑素合成肽(Syg/mL)包被酶聯(lián)板，100 μ L/孔，將二免后1周、3周、5周小 鼠血清進(jìn)行1 100稀釋，檢測血清中生長抑素抗體水平。結(jié)果(見圖9)為免疫重組蛋 白SS4-VP2/鋁膠組，SS4-VP2/白油組在試驗后期產(chǎn)生了特異性抗體，而PPV對照組與PBS 組沒有特異性抗體產(chǎn)生。SS4-VP2/鋁膠組抗體水平最高。說明SS4-VP2抗原具有良好的免 疫原性，產(chǎn)生較高水平的生長抑素抗體，其中鋁佐劑對抗原的免疫增強作用優(yōu)于白油佐劑。(4)生長激素(GH)的檢測采用放射免疫方法(南京軍區(qū)總醫(yī)院檢測)測定二免后2周、4周小鼠血清中GH 水平。結(jié)果顯示(見圖10)，二免后2周時，SS4-VP2/鋁膠(第II組)、SS4-VP2/白油(第 I組)試驗組血清GH水平明顯高于PBS (第IV組)和PPV滅活苗(第III組)試驗組；二免 4周時，SS4-VP2/鋁膠(第II組)、SS4-VP2/白油(第I組)試驗組血清GH水平略有下降， PBS (第IV組)和PPV滅活苗(第III組)試驗組略有升高。其中第II組(SS4-VP2/鋁膠)試 驗組血清GH水平較高，說明SS4-VP2/鋁膠、SS4-VP2/白油試驗組產(chǎn)生的抗SS特異性的抗 體中和了部分內(nèi)源性的SS，從而使生長激素的濃度升高，這在一定程度上有利于促進(jìn)試驗 動物的生長，達(dá)到促生長的目的。
權(quán)利要求
含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，由如下方法制備而得(1)獲取目的基因采用正向引物P1和反向引物P2擴增豬細(xì)小病毒VP2基因，采用人工合成方法獲得兩端分別添加了酶切位點的4拷貝的生長抑素的基因序列，所述4拷貝的生長抑素的基因序列為SS4；所述正向引物P1的序列為5’ cgggatccagccggctgcaagaacttcttctggaagaccttcacctcctgcactgaattgtctgca 3’，所述反向引物P2的序列為5’ cgcctcgagctagtataattttcttggtat 3’；(2)構(gòu)建及鑒定重組轉(zhuǎn)移載體pFast SS4 VP2；(3)構(gòu)建及鑒定重組穿梭載體rBacmid SS4 VP2；(4)獲得穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac SS4 VP2；(5)將所述的病毒rBac SS4 VP2感染sf 9昆蟲細(xì)胞，獲得含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，其 特征在于所述4拷貝生長抑素的基因序列5’端添加BamH I酶切位點、3’端添加Bg 1 II 酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆 粒，其特征在于(2)所述重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2構(gòu)建及鑒定方法如下將VP2基因 克隆至轉(zhuǎn)移載體PFastBac HTA中，經(jīng)酶切，測序，鑒定陽性質(zhì)粒命名為pFast-VP2 ；該質(zhì)粒 pFast-VP2經(jīng)酶切、去磷酸化后與SS4連接，再經(jīng)酶切，測序，鑒定為陽性的質(zhì)粒為重組轉(zhuǎn)移 載體 pFast-SS4-VP2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒， 其特征在于所述(3)重組穿梭載體rBaCmid-SS4-VP2的構(gòu)建與鑒定方法為將重組載體 pFast-SS4-VP2轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭質(zhì)粒Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac中，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選和 PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒即為重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2 ；所述PCR鑒定中采用桿狀病毒 通用引物，上游引物為GTTTTCCCAGTCACGAC，下游引物為CAGGAAACAGCTATGAC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒， 其特征在于步驟(4)獲得穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2的方法為重組穿梭載體 rBacmid-SS4-VP2轉(zhuǎn)染sf_9昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行重組桿狀病毒的擴增，提取擴增后的重組桿狀 病毒的基因組DNA，經(jīng)PCR鑒定為陽性者即為穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2 ；所述PCR 鑒定中的引物為引物Pl和P2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，其 特征在于步驟(5)中將所述病毒rBac-SS4-VP2接種sf_9昆蟲細(xì)胞，收集病變的sf_9昆 蟲細(xì)胞，將該病變細(xì)胞破碎后進(jìn)行離心，獲得上清液，采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行蛋白沉淀；將 所述蛋白沉淀懸浮于緩沖液中，滅活病毒rBacmid-SS4-VP2后除鹽，超濾，得到豬細(xì)小病毒 VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒。
7.—種權(quán)利要求1 6中任一項所述的含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病 毒樣顆粒在制備預(yù)防豬感染細(xì)小病毒、提高豬生長速度的疫苗的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程疫苗領(lǐng)域，提供一種含有豬細(xì)小病毒VP2和生長抑素嵌合蛋白的病毒樣顆粒，由如下方法制備而得獲取目的基因，構(gòu)建及鑒定重組轉(zhuǎn)移載體pFast-SS4-VP2，構(gòu)建及鑒定重組穿梭載體rBacmid-SS4-VP2，獲得穩(wěn)定的重組桿狀病毒rBac-SS4-VP2，將病毒rBac-SS4-VP2感染sf-9昆蟲細(xì)胞，獲得目的產(chǎn)物。本發(fā)明所述病毒樣顆粒在制備預(yù)防豬感染細(xì)小病毒、提高豬生長速度的疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明的病毒樣顆粒既能預(yù)防豬感染細(xì)小病毒又能提高豬生長速度；本發(fā)明同時提供該病毒樣顆粒在制備預(yù)防豬感染細(xì)小病毒、提高豬生長速度的疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號C12N7/04GK101955917SQ20101024097
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者侯紅巖, 侯繼波, 侯風(fēng)香, 劉超, 張雪花, 李卓, 薛剛, 鄭其升, 陳瑾 申請人:國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心