專利名稱：大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5、其編碼蛋白及 其在植物光周期和開花時間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的農(nóng)作物之一，是植物蛋白質(zhì)、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂 等次生代謝產(chǎn)物的重要來源。因為大豆是短日植物，開花受光周期的嚴(yán)格控制，因而不同區(qū) 域間的優(yōu)異品種不能相互引種、生育期也受環(huán)境光周期的制約。如果能降低大豆對光周期 的敏感性，突破大豆開花對光周期的限制，就能解決大豆的引種問題，從而實現(xiàn)各區(qū)域間優(yōu) 質(zhì)品種的相互交換，豐富各地優(yōu)異種質(zhì)資源，調(diào)節(jié)大豆生育期，提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。雖然 通過傳統(tǒng)的栽培和遺傳育種的方法在一定程度上改變大豆的生長習(xí)性，也獲得一些光周期 適應(yīng)性較廣的品種，但都沒有從根本上改變大豆開花習(xí)性(趙存等，用光周期誘導(dǎo)法篩選 光鈍感的大豆品種(系).大豆科學(xué).1996，15(1) :42-47 ；陳潔敏和楊方人，播期對大豆開 花及產(chǎn)量的影響，大豆科學(xué)，1998，17 (3) 225-230 ；楊志攀和周新安，大豆光周期遺傳育種 研究進(jìn)展，中國油料作物學(xué)報，1999，21 (1) 61-73 ；欒曉燕，滿為群，杜維廣，陳怡，劉鑫磊， 大豆光鈍感種質(zhì)創(chuàng)新與光周期育種途徑的研究，大豆科學(xué)，2004，23 (3) 196-199).其主要 原因是目前對大豆開花分子機(jī)理的了解甚少，從而導(dǎo)致很難從根本上解決大豆的開花習(xí)性 問題。對擬南芥開花分子機(jī)理的研究表明，植物的開花受四條途徑的控制，即光周期途 徑、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑(Mouradov等，2002)，這些途徑的信號最后都匯總到 兩個主要的整合子FT和S0C1，從而促進(jìn)開花(Suarez-Lopez P, Wheatley K, Robson F, Onouchi H,Valverde F,Coupland G,CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of fowering in Arabidopsis. Nature,2001,410 1116-20. ；Hepworth SR, Valverde F, Ravenscroft D, Mouradov A, Coupland G. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOCl by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs. EMBO J. 2002.21(16) 4327-37) 0隱花色素(cryptochrome)是從細(xì)菌到植物和動物三個物種 中都存在的藍(lán)光受體，調(diào)控植物的生長發(fā)育和動植物的生物鐘(Cashmore AR.，Cell 114 537-543(2003).。Lin C.，Shalitin D.，Annu Rev Plant Biol 54 469-496 (2003)) 植物 中至少含有兩種隱花色素CRY1 和 CRY2(Guo H, Yang H, Mockler TC，Lin C.，Science279 1360-1363 (1998))。在擬南芥中CRYl主要調(diào)控藍(lán)光控制的脫黃化作用，而CRY2主要調(diào)節(jié)開 花的光周期活動(KoornneefM，Heynh.，Z Pflanzenphysiol Bd 100 :147_160 (1980))。除擬 南芥外，還對藻類、苔蘚、蕨類植物、番茄、油菜、豌豆和水稻中的隱花色素進(jìn)行了相關(guān)研究。 這些研究表明，在被子植物中，隱花色素調(diào)控生長發(fā)育的方式與擬南芥中的相同(ImmelnD， Schlesinger R，J Biol Chem 282:21720—21728. (2007) ；Imaizumi Τ,Kanegae T,ffadaM., Plant Cell 12:81—96. (2000). ；Imaizumi Τ,Kadota A,Plant Cell 14:373—386. (2002)； Ninu L，等，Plant J18 :551_556. (1999) ；Giliberto L，等，Plant Physiol 137:199—208.(2005). ；Chatterjee M，Sharma P, Plant Physiol 141 61-74. (2006). ；Platten JD, 等，Plant Physiol 139 1472-1482. (2005) ；Matsumoto N, Hirano T, Iwasaki T, Plant Physiol 133 1494-1503. (2003). ；Zhang YC，等，Plant J 46:971-983. (2006))。與其他的 光受體相似，隱花色素與其靶蛋白相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)和生理反應(yīng)(H. -Q. Yang等， Cell 103,815(2000) ；X. Yu 等，Proc Natl Acad Sci US A 104,7289(2007) ；M. F. Ceriani 等，Science 285,553(1999) ；Μ. Ni, J. Μ. Tepperman, P. H. Quail, Cell 95,657(1998))。在 植物體中，CRYs 禾口 CIBl (cryptochrome—interacting basic-helix-loop-helix)藍(lán)光f衣賴 的相互作用是一個早期的光受體信號機(jī)制。CIBl蛋白在酵母和擬南芥中以藍(lán)光特異的方式 與CRY2相互作用，并與其它CIBl相關(guān)的蛋白共同啟動CRY2依賴的花形成。過表達(dá)CIBl的 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的FTmRNA顯著提高，表現(xiàn)為早花(H Liu等，Science 269,968(2008))。 發(fā)現(xiàn)大豆的兩個隱花色素GmCRYla和GmCRY2a的表達(dá)和功能與擬南芥的隱花色素相似，兩 者都影響藍(lán)光抑制細(xì)胞的伸長，但是只有GmCRYla的降解依賴于藍(lán)光和26S蛋白體。與擬 南芥隱花色素相反，GmCRYla而非GmCRY2a表現(xiàn)出很強(qiáng)的促進(jìn)開花的活性，并且GmCRYla 的蛋白表達(dá)水平隨生物鐘的節(jié)律而波動。在大豆中GmCRYla是花周期調(diào)控的主要調(diào)節(jié)子 (Q. Z. Zhang.，等，Proc Natl Acad Sci 2046(2008))。因此推測同屬雙子葉植物的大豆中 的CIBs基因可能與GmCRYla相互作用來調(diào)節(jié)大豆的開花。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5、其編碼蛋白及其在植物光周 期和開花時間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5編碼的蛋白，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5。前述的大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。本發(fā)明還提供含有大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5所述的基因在調(diào)節(jié)植物，尤其是大 豆和擬南芥光周期和開花時間中的應(yīng)用。另夕卜，本發(fā)明提供一種用于擴(kuò)增大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5的引物， 其包括正向弓丨物Fl :5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3‘。GmCIB5是從大豆中分離并獲得功能鑒定的bHLH家族基因，其中的Gm為Glycine max(Linn)Merril 的首字母，CIB 為 cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 的縮寫。根據(jù)擬南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列，在 http:// www. phytozome. net網(wǎng)站中進(jìn)行同源性比對，找到一批大豆同源序列，其中 GmCIB5的CDS序列在大豆基因組上的位置為Glyma08g46040. 1，設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，正向引物 Fl :5 ‘ -ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG-3 ‘和反向引物 Rl 5' -TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 獲得 GmCIB5 全序 列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。GmCIB5基因與擬南芥CIBl基因高度同源，其編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥CIBl蛋白的 一致性達(dá)36. 4 %。(如圖1所示)。將GmCIB5基因在擬南芥野生型中過表達(dá)，轉(zhuǎn)化植株對光周期的敏感性降低，在長 日和短日下均早花。這表明，GmCIB5基因具有與擬南芥CIBl類似的功能，對開花的時間起 著重要的調(diào)節(jié)作用。GmCIB5基因有著重要的應(yīng)用價值，過表達(dá)GmCIB5可以降低植物開花對光周期的 敏感性，可明顯促進(jìn)植物開花，使開花時間縮短，生育期縮短?？捎糜诮鉀Q雜交育種中的花 期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。


圖1為本發(fā)明大豆CIB5蛋白與擬南芥CIBl蛋白的氨基酸序列對比，其中GmCIB5 表示大豆CIB5蛋白，AtCIBl表示擬南芥CIBl蛋白；圖2為擬南芥Col-O野生型與其轉(zhuǎn)GmCIB5基因Tl植株的開花對比，其中，左側(cè)表 示Col-O野生型植株，右側(cè)表示轉(zhuǎn)化植株；圖3為擬南芥Col-O野生型與其轉(zhuǎn)GmCIB5基因T2植株的在長日照(LD)條件下 開花對比，其中，左側(cè)表示Col-O野生型植株，右側(cè)表示轉(zhuǎn)化植株；圖4為擬南芥Col-O野生型與其轉(zhuǎn)GmCIB5基因T2植株的在短日照(SD)條件下 開花對比，其中，右側(cè)表示Co 1-0野生型植株，左側(cè)表示轉(zhuǎn)化植株。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1 GmCIB5基因的分離克隆根據(jù)擬南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列，在 http:// www. phytozome. net網(wǎng)站中進(jìn)行同源性比對，找到一批大豆同源序列，其中 GmCIB5的CDS序列在大豆基因組上的位置為Glyma08g46040. 1，設(shè)計PCR擴(kuò) 增引物，正向引物 Fl :5 ‘ -ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG-3 ‘和反向引物 Rl 5 ‘ -TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 獲得 GmCIB5 全序 列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L，包括大豆 cDNA(50ng) 1 μ L ；dNTP(2. 5mM) 2. 5 μ L ；引物 Fl(IOyM) 1 μ L ；弓| 物 Rl (10 μ Μ) 1 μ L ；LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3 μ L ；IOX 緩沖液 2· 5 μ L ； ddH20 16. 7 μ L，共 25 μ L。PCR 反應(yīng)程序為94 "C 預(yù)變性 5min，95 "C 30s, 53. 5 "C 30s, 72°C 2min,30 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0實施例2 GmCIB5基因的分析鑒定GmCIB5的⑶S序列全長1761bp，編碼一個586AA的蛋白，與擬南芥CIBl蛋白的同 源性為36.4%。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，其C端含有一個basic helix-loop-helix結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域為bHLH族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的保守結(jié)構(gòu)域，通過與DNA中的E-box結(jié)合，來調(diào)控基因的轉(zhuǎn) 錄；蛋白N端還含有一個NLS，該結(jié)構(gòu)域與入核相關(guān)。根據(jù)在NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)上的序列查詢結(jié)果，到目前為止，大豆中尚 無與CIBl相類似的序列信息；而且迄今也沒有公開發(fā)表的涉及其功能研究的論文。因此認(rèn) 為GmCIB5是大豆的一個新基因。實施例3轉(zhuǎn)GmCIB5基因擬南芥的獲得根據(jù)GmCIB5的序列信息，在其CDS兩端設(shè)計PCR擴(kuò)增弓丨物， 正向弓丨物 F 1 :5 ‘ -ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG-3 ‘和反向引物 Rl 5' -TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 獲得 GmCIB5 全序 列。PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L，包括大豆 cDNA(50ng) 1 μ L ； dNTP(2. 5mM)2. 5μ L ；引物 Fl(IOyM) 1 μ L ；弓I 物 Rl(IOyM) 1 μ L ；LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3 μ L ；IOX 緩沖液 2. 5 μ L ； ddH20 16. 7 μ L，共 25 μ L。PCR 反應(yīng)程序為95 "C 預(yù)變性 5min，94 "C 30s, 53. 5 "C 30s, 72°C 2min，30個循環(huán)；最后72°C IOmin0重復(fù)上述PCR程序三次，將三次PCR產(chǎn)物合并后進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收獲得純化的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到含有Gateway接頭的pGWC載體(陳其軍、王學(xué)臣等，使用與 Gateway技術(shù)兼容的T載體獲得入門克隆，2004. 31 (10)，951-954)上，經(jīng)測序鑒定得到 與目的GmCIB5完全相同的序列。通過LR反應(yīng)將GmCIB5構(gòu)建至過表達(dá)載體pLeela(購 自Invitrogen)上，獲得載體35S: :GmCIB5。將過表達(dá)載體35S: :GmCIB5導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌 株GV3101 :90RK (購自Invitrogen)中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法(Steven J. Clough and Andrew F. Bent. Floral dip :A Simpled Method for Agrobacterium-mediated Transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 1998. 16 (6), 735-743.)
盛花期的擬南芥，將轉(zhuǎn)化植株收獲的種子進(jìn)行播種，播種7-10d后待子葉完全張開時噴灑 稀釋1000倍的除草劑Basta (購自Chem Service Lot :395_85A)進(jìn)行篩選，獲得抗Basta 的過表達(dá)GmCIB5的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株20株。實施例4 GmCIB5基因功能分析按照實施例3的方法獲得的20株GmCIB5擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，其Tl植株表現(xiàn)為早 花(圖2)。選擇其中的5株轉(zhuǎn)基因植株分別種植在長日照和短日照下，T2植株在長日和短 日下均為早花(圖3和圖4)。表明轉(zhuǎn)化植株對光周期的敏感性降低，說明了 GmCIB5基因具 有與擬南芥CIBl類似的功能，對開花的時間起著重要的調(diào)節(jié)作用。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
一種用于擴(kuò)增大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5的引物，其包括正向引物F15′ ATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATG 3′和反向引物R15′ TCATAGGGGTTCTTGATTTGAGC 3′。
2.大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No. 2 所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求2所述蛋白的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的載體。
6.含有權(quán)利要求5所述載體的宿主細(xì)胞。
7.含有權(quán)利要求3或4所述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
8.權(quán)利要求3或4所述的基因在調(diào)節(jié)植物光周期和開花時間中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的植物為大豆。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5及其編碼蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。過表達(dá)大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB5可明顯促進(jìn)植物(擬南芥)開花，使開花時間縮短，生育期縮短?？捎糜诮鉀Q雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C12N15/29GK101921753SQ20101024104
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者孟穎穎, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所