專利名稱：大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4、其編碼蛋白及 其在植物光周期和開花時(shí)間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆是重要的農(nóng)作物之一，是植物蛋白質(zhì)、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂 等次生代謝產(chǎn)物的重要來源。因?yàn)榇蠖故嵌倘罩参?，開花受光周期的嚴(yán)格控制，因而不同區(qū) 域間的優(yōu)異品種不能相互引種、生育期也受環(huán)境光周期的制約。如果能降低大豆對(duì)光周期 的敏感性，突破大豆開花對(duì)光周期的限制，就能解決大豆的引種問題，從而實(shí)現(xiàn)各區(qū)域間優(yōu) 質(zhì)品種的相互交換，豐富各地優(yōu)異種質(zhì)資源，調(diào)節(jié)大豆生育期，提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。雖然 通過傳統(tǒng)的栽培和遺傳育種的方法在一定程度上改變大豆的生長(zhǎng)習(xí)性，也獲得一些光周期 適應(yīng)性較廣的品種，但都沒有從根本上改變大豆開花習(xí)性(趙存等，用光周期誘導(dǎo)法篩選 光鈍感的大豆品種(系).大豆科學(xué).1996，15(1) :42-47 ；陳潔敏和楊方人，播期對(duì)大豆開 花及產(chǎn)量的影響，大豆科學(xué)，1998，17 (3) 225-230 ；楊志攀和周新安，大豆光周期遺傳育種 研究進(jìn)展，中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，1999，21 (1) 61-73 ；欒曉燕，滿為群，杜維廣，陳怡，劉鑫磊， 大豆光鈍感種質(zhì)創(chuàng)新與光周期育種途徑的研究，大豆科學(xué)，2004，23 (3) 196-199).其主要 原因是目前對(duì)大豆開花分子機(jī)理的了解甚少，從而導(dǎo)致很難從根本上解決大豆的開花習(xí)性 問題。對(duì)擬南芥開花分子機(jī)理的研究表明，植物的開花受四條途徑的控制，即光周期途 徑、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑(Mouradov等，2002)，這些途徑的信號(hào)最后都匯總到 兩個(gè)主要的整合子FT和S0C1，從而促進(jìn)開花(Suarez-Lopez P, Wheatley K, Robson F, Onouchi H,Valverde F,Coupland G,CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis. Nature, 2001,410 1116-20. ；Hepworth SR, Valverde F, Ravenscroft D, Mouradov A, Coupland G. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOCl by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs. EMBO J. 2002.21(16) 4327-37) 0隱花色素(cryptochrome)是從細(xì)菌到植物和動(dòng)物三個(gè)物種 中都存在的藍(lán)光受體，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和動(dòng)植物的生物鐘(Cashmore AR.，Cell 114 537-543(2003).。Lin C.，Shalitin D.，Annu Rev Plant Biol 54 469-496 (2003)) 植物 中至少含有兩種隱花色素CRY1 和 CRY2(Guo H, Yang H, Mockler TC，Lin C.，Science279 1360-1363 (1998))。在擬南芥中CRYl主要調(diào)控藍(lán)光控制的脫黃化作用，而CRY2主要調(diào)節(jié)開 花的光周期活動(dòng)(KoornneefM，Heynh.，Z Pflanzenphysiol Bd 100 :147_160 (1980))。除擬 南芥外，還對(duì)藻類、苔蘚、蕨類植物、番茄、油菜、豌豆和水稻中的隱花色素進(jìn)行了相關(guān)研究。 這些研究表明，在被子植物中，隱花色素調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的方式與擬南芥中的相同(ImmelnD， Schlesinger R, J Biol Chem282 21720-21728. (2007) ；Imaizumi T, Kanegae T, WadaM., Plant Celll2 81-96. (2000). ；Imaizumi T, Kadota A, Plant Cell 14:373—386. (2002)； Ninu L，等，Plant J 18:551-556. (1999) ；Giliberto L，等，Plant Physiol 137:199—208.
3(2005). ；Chatterjee M, Sharma P, Plant Physioll4161-74. (2006). ；Platten JD, 等，Plant Physiol 139 1472-1482. (2005) ；Matsumoto N, Hirano T, Iwasaki T, Plant Physiol 133 1494-1503. (2003). ；Zhang YC，等，Plant J 46:971-983. (2006))。與其他的 光受體相似，隱花色素與其靶蛋白相互作用來調(diào)控基因的表達(dá)和生理反應(yīng)(H. -Q. Yang等， Cell 103,815(2000) ；X. Yu等，Proc Natl Acad Sci U S A 104,7289(2007) ；M. F. Ceriani 等，Science 285,553(1999) ；Μ. Ni, J. Μ. Tepperman, P. H. Quail, Cell 95,657(1998))。在 植物體中，CRYs 禾口 CIBl (cryptochrome—interacting basic-helix-loop-helix)藍(lán)光f衣賴 的相互作用是一個(gè)早期的光受體信號(hào)機(jī)制。CIBl蛋白在酵母和擬南芥中以藍(lán)光特異的方式 與CRY2相互作用，并與其它CIBl相關(guān)的蛋白共同啟動(dòng)CRY2依賴的花形成。過表達(dá)CIBl的 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的FTmRNA顯著提高，表現(xiàn)為早花(H Liu等，Science 269,968(2008))。 發(fā)現(xiàn)大豆的兩個(gè)隱花色素GmCRYla和GmCRY2a的表達(dá)和功能與擬南芥的隱花色素相似，兩 者都影響藍(lán)光抑制細(xì)胞的伸長(zhǎng)，但是只有GmCRYla的降解依賴于藍(lán)光和26S蛋白體。與擬 南芥隱花色素相反，GmCRYla而非GmCRY2a表現(xiàn)出很強(qiáng)的促進(jìn)開花的活性，并且GmCRYla 的蛋白表達(dá)水平隨生物鐘的節(jié)律而波動(dòng)。在大豆中GmCRYla是花周期調(diào)控的主要調(diào)節(jié)子 (Q. Z. Zhang.，等，Proc Natl Acad Sci 2046(2008))。因此推測(cè)同屬雙子葉植物的大豆中 的CIBs基因可能與GmCRYla相互作用來調(diào)節(jié)大豆的開花。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4、其編碼蛋白及其在植物光周 期和開花時(shí)間調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4編碼的蛋白，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4。前述的大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。本發(fā)明還提供含有大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4所述的基因在調(diào)節(jié)植物，尤其是大 豆和擬南芥光周期和開花時(shí)間中的應(yīng)用。另夕卜，本發(fā)明提供一種用于擴(kuò)增大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4的引物， 其包括正向弓丨物Fl :5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3‘。GmCIB4是從大豆中分離并獲得功能鑒定的bHLH家族基因，其中的Gm為Glycine max(Linn)Merril 的首字母，CIB 為 cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 的縮寫。根據(jù)擬南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列，在 http:// www. phytozome. net網(wǎng)站中進(jìn)行同源性比對(duì)，找到一批大豆同源序列，其中 GmCIB4的CDS序列在大豆基因組上的位置為Glymal6gl0620. 1，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增弓丨物，正向弓丨物5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 獲得 GmCIB4 全序 列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。GmCIB4基因與擬南芥CIBl基因高度同源，其編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥CIBl蛋白的 一致性達(dá)36.1%。(如圖1所示)。將GmCIB4基因在擬南芥野生型中過表達(dá)，轉(zhuǎn)化植株對(duì)光周期的敏感性降低，在長(zhǎng) 日和短日下均早花。這表明，GmCIB4基因具有與擬南芥CIBl類似的功能，對(duì)開花的時(shí)間起 著重要的調(diào)節(jié)作用。GmCIB4基因有著重要的應(yīng)用價(jià)值，過表達(dá)GmCIB4可以降低植物開花對(duì)光周期的 敏感性，可明顯促進(jìn)植物開花，使開花時(shí)間縮短，生育期縮短。可用于解決雜交育種中的花 期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。


圖1為本發(fā)明大豆CIB4蛋白與擬南芥CIB1蛋白的氨基酸序列對(duì)比，其中Gm CIB4 表示大豆CIB4蛋白，AtCIBl表示擬南芥CIBl蛋白；圖2為擬南芥Col-O野生型與其轉(zhuǎn)GmCIB4基因Tl植株的開花對(duì)比，其中，左側(cè)表 示Col-O野生型植株，右側(cè)表示轉(zhuǎn)化植株；圖3為擬南芥Col-O野生型與其轉(zhuǎn)GmCIB4基因T2植株的在長(zhǎng)日照(LD)條件下 開花對(duì)比，其中，左側(cè)表示Col-O野生型植株，右側(cè)表示轉(zhuǎn)化植株；圖4為擬南芥Col-O野生型與其轉(zhuǎn)GmCIB4基因T2植株的在短日照(SD)條件下 開花對(duì)比，其中，左側(cè)表示Co 1-0野生型植株，右側(cè)表示轉(zhuǎn)化植株。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 GmCIB4基因的分離克隆根據(jù)擬南芥CIBl 基因的 CDS (code sequence)序列，在 http:// www. phytozome. net網(wǎng)站中進(jìn)行同源性比對(duì)，找到一批大豆同源序列，其中 GmCIB4的CDS序列在大豆基因組上的位置為Glymal6gl0620. 1，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò) 增弓丨物，正向弓丨物5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘ 和反向引物Rl 5' -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 獲得 GmCIB4 全序 列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。PCR 反應(yīng)總體系為 25 μ L，包括大豆 cDNA (50ng) 1 μ L ；dNTP (2. 5mM) :2· 5 μ L ； 引物 Fl(IOyM) =IyL ；引物 Rl(IOyM) =IyL5LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3μ L ；IOX 緩沖 液:2· 5 μ L ；ddH20 16. 7 μ L，共 25 μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 "C 預(yù)變性 5min，95 "C 30s, 52. 5°C 30s, 72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin0實(shí)施例2 GmCIB4基因的分析鑒定GmCIB4的⑶S序列全長(zhǎng)1647bp，編碼一個(gè)548AA的蛋白，與擬南芥CIBl蛋白的同 源性為36. 1%。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，其C端含有一個(gè)basic helix-loop-helix結(jié)構(gòu)，該結(jié)
5構(gòu)域?yàn)閎HLH族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的保守結(jié)構(gòu)域，通過與DNA中的E-box結(jié)合，來調(diào)控基因的轉(zhuǎn) 錄；蛋白N端還含有一個(gè)NLS，該結(jié)構(gòu)域與入核相關(guān)。根據(jù)在NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)上的序列查詢結(jié)果，到目前為止，大豆中尚 無與CIBl相類似的序列信息；而且迄今也沒有公開發(fā)表的涉及其功能研究的論文。因此認(rèn) 為GmCIB4是大豆的一個(gè)新基因。實(shí)施例3轉(zhuǎn)GmCIB4基因擬南芥的獲得根據(jù)GmCIB4的序列信息，在其CDS兩端設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引 物，正向弓丨物 5 ‘ -ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG-3 ‘和反向引物 Rl 5 ‘ -TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG-3 ‘。以大豆總 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 獲得 GmCIB4 全序 列。PCR 反應(yīng)總體系為 25μ L，包括大豆 cDNA(50ng) 1 μ L ;dNTP(2. 5mM) 2. 5μ L ； 引物 Fl(IOyM) =IyL ；引物 Rl(IOyM) 1 μ L ；LATaq 酶(5U/ μ L) 0. 3μ L ；IOX 緩沖 液:2· 5 μ L ；ddH20 16. 7 μ L，共 25 μ L。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 "C 預(yù)變性 5min，94 "C 30s, 52. 5°C 30s, 72°C 2min，30個(gè)循環(huán)；最后72°C IOmin0重復(fù)上述PCR程序三次，將三次PCR產(chǎn) 物合并后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收獲得純化的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到含有Gateway接頭的pGWC載體(陳其軍、王學(xué)臣等，使用與 Gateway技術(shù)兼容的T載體獲得入門克隆，2004. 31 (10)，951-954)上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與 目的GmCIB4完全相同的序列。通過LR反應(yīng)將GmCIB4構(gòu)建至過表達(dá)載體pLeela上(購自 Invitrogen)，獲得載體35S: :GmCIB4。將過表達(dá)載體35S: :GmCIB4導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101 90RK(購自Invitrogen)中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法(Steven J. Clough and Andrew F.Bent.Floral dip :A Simpled Method for Agrobacterium—mediated Transformation of Arabidopsis thaiiana. Plant Journal. 1998. 16 (6)，735-743.)轉(zhuǎn)化盛花期的擬南芥， 將轉(zhuǎn)化植株收獲的種子進(jìn)行播種，播種7-10d后待子葉完全張開時(shí)噴灑稀釋1000倍的除草 劑Basta (購自Chem Service Lot :395_85A)進(jìn)行篩選，獲得抗Basta的過表達(dá)GmCIB4的 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株15株。實(shí)施例4 GmCIB4基因功能分析按照實(shí)施例3的方法獲得的15株GmCIB4擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，其Tl植株表現(xiàn)為早 花(圖2)。選擇5株轉(zhuǎn)基因植株分別種植在長(zhǎng)日照和短日照條件下觀察其開花時(shí)間，T2植 株在長(zhǎng)日和短日下均為早花(圖3和圖4)。表明轉(zhuǎn)化植株對(duì)光周期的敏感性降低，說明了 GmCIB4基因具有與擬南芥CIBl類似的功能，對(duì)開花的時(shí)間起著重要的調(diào)節(jié)作用。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
一種用于擴(kuò)增大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4的引物，其包括正向引物F15′ ATGGGAATTCAACTAACAGTTATG 3′和反向引物R15′ TCAGAGCTCAACTTTCATCTGTG 3′。
2.大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No. 2 所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求2所述蛋白的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的載體。
6.含有權(quán)利要求5所述載體的宿主細(xì)胞。
7.含有權(quán)利要求3或4所述基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
8.權(quán)利要求3或4所述的基因在調(diào)節(jié)植物光周期和開花時(shí)間中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的植物為大豆。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4及其編碼蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。過表達(dá)大豆開花調(diào)節(jié)基因GmCIB4可明顯促進(jìn)植物(擬南芥)開花，使開花時(shí)間縮短，生育期縮短?？捎糜诮鉀Q雜交育種中的花期不遇問題、各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題、光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101921754SQ20101024104
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者孟穎穎, 李宏宇, 林辰濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所