專利名稱：一種h9亞型禽流感病毒熒光定量rt-pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。
背景技術：
禽流感是由正粘病毒科禽流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病，根據(jù)其血凝素HA 和神經氨酸酶NA的抗原性將禽流感病毒分成不同亞型，包括15種特異的HA亞型和9種特 異的NA亞型，兩者的不同組合形成不同亞型禽流感病毒。根據(jù)毒株致病性的不同，禽流感 可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感兩大類。H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，產 蛋家禽感染后，可引起產蛋率下降，軟殼蛋、無殼蛋增多，嚴重的將會停止產蛋。種禽感染 后，除上述癥狀外，還表現(xiàn)出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雛禽出殼困難，出殼 后的雛禽弱雛增多。雛禽在一周內死亡率較高，且易感染大腸桿菌，治療較困難。H9亞型禽 流感混合感染其他病原時，可導致發(fā)病率和死亡率的大幅度提高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。 近年來，H9亞型禽流感病毒感染人的病例也時有發(fā)生，因此它也是不容忽視的人獸共患病 病原。H9亞型禽流感傳播快，危害大，因此早期快速診斷就成為預防和控制該病的前提 條件。根據(jù)其流行特點、臨診表現(xiàn)和病理變化可作出初步診斷，確診還需要進行實驗室診 斷，傳統(tǒng)的實驗室檢測方法主要是血清學檢測。血清學檢測具有精確、敏感的優(yōu)點，但操作 繁瑣，耗時較長，約需要一周左右的時間才能確診?；诜肿由飳W技術的熒光定量RT-PCR 方法，能夠快速準確的對樣品進行檢測，對疾病的早期治療及疫情的控制提供參考。

發(fā)明內容
本發(fā)明建立了靈敏度高、特異性強、操作簡單的H9亞型禽流感熒光定量RT-PCR檢 測方法，該方法速度快、高通量，能大大縮短檢測周期，為疾病的治療和疫情的控制提供保 障，并能避免檢測過程中可能造成的生物污染。本發(fā)明的具體步驟是1、引物設計參照GenBank中公開發(fā)表的H9亞型禽流感病毒HA基因序列，應用Primer Premier 5. 0軟件設計了特異性引物序列名稱核苷酸序列(5，-3，)位置
H9F-1ACCAGTGCATGGAGACAATTC1484--1504
H9R-1CAAATGTTGCATCTGCAAGAC1709--1689
H9F-2AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA1576--1600
H9R-2ATTGGACATGGCCCAGAACA1609--1639
H9-probeFAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG-TAMRA1686--16672、病毒RNA提取①取H9N2亞型禽流感病毒懸液250 μ L，加入750 μ LTrizol液，混勻；
②室溫放置5min，然后以每Iml Trizol液加入0. 2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心
管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；③取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0. 5ml異丙醇的比例加入異 丙醇，室溫放置IOmin, 12000g離心IOmin ；④棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，混勻，4°C下 7500g 離心 5min ；⑤重復④中的操作；⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5-lOmin，注意不要干燥過分，否則會降低RNA 的溶解度； ⑦然后將RNA溶于無RNA酶水中，放置IOmin。提取的RNA須在2h內進行PCR擴 增，若需長期保存須放置-70°C冰箱。3、RT-PCR 擴增①反轉錄合成cDNA 反轉錄反應體系包括10 X RT mix 2 μ 1，2. 5mM dNTPs 2 μ 1， 2μ 1 U-12禽流感通用反轉錄引物(5~-AGCAAAAGCAGG-3~)，Quant Reverse Transcriptase 1μ 1，5μ 1已制備的RNA，DEPC水8μ 1。37°C作用lh，即反轉錄完成。②PCR 擴增PCR 總體系為 25μ 1，其中 IOXBuffer 2. 5 μ 1,2. 5mM Mg2+2 μ 1,2. 5mM dNTPs 2 μ 1，上、下游引物(H9F-1 和 H9R-1)各 0.5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，模板 1 μ 1， 余下用滅菌ddH20補足。反應條件為:95°C預變性5min，然后94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 30s, 進行30個循環(huán)，最后72°C延伸6min。反應結束后，取5μ1 PCR產物于1 %瓊脂凝膠中電 泳。4、質粒標準陽性模板的制備①確定陽性質粒PCR產物于瓊脂凝膠中電泳后，用膠回收試劑盒提取DNA，按 照常規(guī)方法將目的片段與PMD18-T載體連接，并轉化DH5ci感受態(tài)細胞中，于氨芐青霉素 酶培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉化長出的菌落進行單克隆培養(yǎng)，EcoR I和Pst I雙酶切鑒 定挑取的陽性質粒，并通過序列測定進行分析，測定的序列與Genebank上的標準毒株序列 對比分析，確定陽性質粒。②陽性質粒濃度的測定將質粒提取物用超純水IOX稀釋后，在260nm與280nm 波長下測定液體中質粒的含量，并根據(jù)公式計算每微升液體中質粒DNA的拷貝數(shù)。
質粒濃度X 6.023 XIO23
質粒DNA拷貝數(shù)=質粒DiVZ分子量注每個堿基的平均分子量為6605、熒光定量PCR標準曲線繪制提取上述陽性質粒DNA做熒光定量標準品，熒光定量標準品為位于HA基因上 1484 1709之間、大小約為226bp的基因片段的質粒。倍比稀釋(107 102copies/μ L)用 于熒光定量PCR標準曲線繪制，擴增反應體系20 μ 1，其中2. 5 XrealMasterMix 8μ 1，上下 游引物(H9F-2 和 H9R-2)各 0. 8μ 1，探針 0. 8μ l，20XProbe Enhancer solution Ι.ΟμΙ， 模板 2μ 1，超純水 6. 6μ 1。反應條件為95°C Imin ;95°C 10s,60°C 15s，68°C 34s，40 個循 環(huán)。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在
(1)靈敏度高通過倍比稀釋質粒標準品進行靈敏度檢測可知檢測到最低濃度為looC。pieS／reaCti。n。
(2)特異性強除H9亞型的毒株均能檢測到陽性的熒光信號外，而其他亞型流感病毒H1、H3、H5、H7等均為陰性，新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒均為陰性。
(3)重復性好選擇不同濃度的4個質粒標準品進行熒光定量PCR檢測，每個標準品在同一反應條件下重復3次作為同一批次內重復試驗，然后在另一時間再重復一次作為不同批次間重復試驗，通過計算得出，批次內變異系數(shù)的mean I-S．D．為0．82 I-0．64％，批次間變異系數(shù)的mean I-S．D．為1．15 I-0．17％。
說明書附圖

圖l是H9亞型禽流感病毒熒光定量PCR標準品擴增曲線
圖2是H9亞型禽流感病毒熒光定量PCR標準曲線
具體實施例方式 參照GenBank中公開發(fā)表的H9亞型禽流感病毒Iu基因序列，設計了特異性引物序列
名稱核苷酸序列(5’一3’)
H9F—lACCAGTGCATGGAGACAATTC
H9R—lCAAATGTTGCATCTGCAAGAC
H9F一一2AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA
H9R一一2ATTGGACATGGCCCAGAACA
H9一probeFAM—ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG—TAMRA
實施例一以已知H9N2亞型禽流感病毒為檢測材料，并以超純水為陰性對照。
l、H9N2亞型禽流感病毒RNA提取
①取H9N2亞型禽流感病毒懸液250 u L，加入750 u LTrizol液，混勻；
②室溫放置5min，然后以每lml Trizol液加入0．2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；
⑧取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0．5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min；
④棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少lml的比例加入75％乙醇，混勻，4℃下7500g離心5min；
⑤重復④中的操作；
⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5—10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度；
⑦然后將RNA溶于無RNA酶水中，放置10min。提取的RNA須在2h內進行PCR擴增，若需長期保存須放置一70℃冰箱。
2、反轉錄合成cDNA
反轉錄反應體系包括lo×R／mix 2 u l，2．5nN dNTPs 2 u l，2 u l U—12禽流感通用反轉錄引物(5~-AGCAAAAGCAGG-3~)，Quant Reverse Transcriptase 1μ1，5μ1 已制備 的RNA，DEPC水8μ 1。37°C作用lh，即反轉錄完成。3、熒光定量PCR檢測取上述反轉錄獲得的cDNA為模板，進行熒光定量PCR檢測，同時制定標準曲線，反 應體系 20 μ 1，其中 2. 5 XrealMasterMix 8 μ 1，上下游引物(H9F-2 和 H9R-2)各 0. 8μ 1，探 針 0. 8 μ 1，20XProbe Enhancer solution 1· 0 μ 1，模板 2 μ 1，超純水 6· 6 μ 1。反應條件 為95°C Imin ；95°C 10s,60°C 15s，68°C 34s，40個循環(huán)。最后根據(jù)標準曲線分析被檢材 料中的病毒核酸量(copies)。結果說明本方法能有效地檢測H9亞型禽流感病毒核酸量。實施例二 待檢病料(病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子)中H9亞型禽流感病毒的熒光 定量PCR檢測。1、樣品制備病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子品在混合器上充分混合后，用滅菌鑷子將拭子中的液 體擠出，室溫放置30min，取上清液轉入無菌的1.5mL Eppendorf管中，編號備用。2、病毒RNA提?、偃∩鲜鲆后w250 μ L，加入750 μ LTrizol液，混勻；②室溫放置5min，然后以每Iml Trizol液加入0. 2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心
管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；③取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0. 5ml異丙醇的比例加入異 丙醇，室溫放置IOmin, 12000g離心IOmin ；④棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，混勻，4°C下 7500g 離心 5min ；⑤重復④中的操作；⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5-lOmin，注意不要干燥過分，否則會降低RNA 的溶解度；⑦然后將RNA溶于無RNA酶水中，放置IOmin。提取的RNA須在2h內進行PCR擴 增，若需長期保存須放置-70°C冰箱。3、反轉錄合成cDNA反轉錄反應體系包括10X RT mix 2 μ 1,2. 5mM dNTPs 2μ1，2μ1 U-12 禽流感通 用反轉錄引物(5~-AGCAAAAGCAGG-3~)，Quant Reverse Transcriptase 1μ1，5μ1 已制備 的RNA，DEPC水8μ 1。37°C作用lh，即反轉錄完成。4、熒光定量PCR檢測取上述反轉錄獲得的cDNA為模板，進行熒光定量PCR檢測，同時制定標準曲線，反 應體系 20 μ 1，其中 2. 5 XrealMasterMix 8 μ 1，上下游引物(H9F-2 和 H9R-2)各 0. 8μ 1，探 針 0. 8 μ 1，20XProbe Enhancer solution 1· 0 μ 1，模板 2 μ 1，超純水 6· 6 μ 1。反應條件 為95°C Imin ；95°C 10s,60°C 15s，68°C 34s，40個循環(huán)。最后根據(jù)標準曲線分析被檢材 料中的病毒核酸量(copies)。結果說明本方法能敏感地檢測病料中H9亞型禽流感病毒核酸量。
權利要求
一種H9亞型禽流感病毒熒光定量RT PCR檢測方法，其特征在于該檢測方法包括下步驟(1)引物設計參照H9亞型禽流感病毒HA基因序列設計特異性引物，引物序列；(2)病毒RNA提?、偃9N2亞型禽流感病毒懸液250μL，加入750μL Trizol液，混勻；②室溫放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；③取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min；④棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混勻，4℃下7500g離心5min；⑤重復④中的操作；⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5 10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度；⑦然后將RNA溶于無RNA酶水中，放置10min；(3)RT PCR擴增①反轉錄合成cDNA反轉錄反應體系包括10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl U 12禽流感通用反轉錄引物(5` AGCAAAAGCAGG 3`)，Quant Reverse Transcriptase1μl，5μl已制備的RNA，DEPC水8μl；37℃作用1h，即反轉錄完成；②PCR擴增PCR總體系為25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg2+2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上、下游引物(H9F 1和H9R 1)各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用滅菌ddH2O補足；反應條件為95℃預變性5min，然后94℃ 30s，45℃30s，72℃30s，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸6min；反應結束后，取5μl PCR產物于1％瓊脂凝膠中電泳；(4)質粒標準陽性模板的制備①確定陽性質粒PCR產物于1％瓊脂凝膠中電泳后，用膠回收試劑盒提取DNA，按照常規(guī)方法將目的片段與pMD18 T載體連接，并轉化DH5α感受態(tài)細胞中，于氨芐青霉素酶培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉化長出的菌落進行單克隆培養(yǎng)，EcoR I和Pst I雙酶切鑒定挑取的陽性質粒，并通過序列測定進行分析，測定的序列與Genebank上的標準毒株序列對比分析，確定陽性質粒；②陽性質粒濃度的測定將質粒提取物用超純水10×稀釋后，在260nm與280nm波長下測定液體中質粒的含量，并根據(jù)公式計算每微升液體中質粒DNA的拷貝數(shù)；注每個堿基的平均分子量為660(5)熒光定量PCR標準曲線繪制提取上述陽性質粒DNA做熒光定量標準品，倍比稀釋(107～102copies/μL)用于熒光定量PCR標準曲線繪制，擴增反應體系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H9F 2和H9R 2)各0.8μl，探針0.8μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超純水6.6μl；反應條件為95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40個循環(huán)；通過倍比稀釋質粒標準品進行靈敏度檢測可知檢測到最低濃度為100copies/reaction。FSA00000201952300021.tif
2.根據(jù)權利要求1所述的H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于 所述的特異性引物及引物序列如下H9F-1 :ACCAGTGCATGGAGACAATTC ； H9R-1 CAAATGTTGCATCTGCAAGAC ； H9F-2 :AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA ； H9R-2 :ATTGGACATGGCCCAGAACA ；H9-probe :FAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG_TAMRA。
3.根據(jù)權利要求1所述的H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于 所述的熒光定量標準品為位于HA基因上1484 1709之間、大小為226bp的基因片段的質
全文摘要
本發(fā)明涉及H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法是采用TaqMan技術，設計一組僅在H9亞型禽流感病毒血凝素基因間保守的特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針，應用熒光定量檢測儀對樣品進行檢測。該方法靈敏度高、特異性強，操作簡單，能大大縮短檢測周期，并能避免檢測過程中可能造成的生物污染。
文檔編號C12Q1/70GK101914632SQ201010234168
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權日2010年7月20日
發(fā)明者呂靜, 姚美玲, 柴同杰 申請人:山東農業(yè)大學