專利名稱：轉cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別是涉及一種鑒別轉cry2A基因水稻品系T2A-1的 轉化體特異性PCR方法及其應用。
背景技術：
水稻作為世界上超過一半人口的主食，是最重要的糧食作物之一。在過去的半個 多世紀里，水稻育種取得了巨大的成功。水稻的單位產(chǎn)量實現(xiàn)了翻番，部分地方甚至提高至 3倍，這為保障世界糧食安全作出了巨大的貢獻。但近十幾年來水稻的產(chǎn)量停滯不前，這一 方面是由于在育種技術上沒有新的突破以及遺傳多樣性在栽培品種中的逐步變窄，另一方 面也是因為頻繁發(fā)生的病蟲害以及旱災等自然災害使得水稻生產(chǎn)損失慘重。然而，世界人 口的持續(xù)增長以及社會經(jīng)濟的快速發(fā)展導致對糧食的需求不斷增加。針對這些問題，我國學者圍繞水稻抗病蟲、抗旱、營養(yǎng)高效利用、優(yōu)質、高產(chǎn)等五大 重要性狀，利用轉基因技術這種新興的育種手段對水稻品種進行全面改良以實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的 可持續(xù)發(fā)展。目前我國已經(jīng)有多個轉基因水稻品系進行了生產(chǎn)性實驗，申請生產(chǎn)應用生 物安全證書。其中，華中農(nóng)業(yè)大學研發(fā)的轉crylAb/crylAc基因水稻華恢1號和Bt汕優(yōu) 63的生產(chǎn)應用生物安全證書于2009年8月獲得了批準(http://www. stee. agri. gov. cn/ biosafety/spxx/P020091127591594596689. pdf，審批編號農(nóng)基安證字(2009)第 072 號和 第73號)，成為我國首批允許商業(yè)化種植的轉基因水稻。使用不同Bt基因的轉基因水稻是延緩昆蟲抗性產(chǎn)生，提高Bt水稻使用壽命的一 種重要策略。Chen等人培育了轉人工合成的cry2A基因的水稻品系T2A-l(Chen H，Tang W, Xu C G, etal. Transgenic indica rice plants harboring a synthetic cry2A*gene of Bacillus thuringiensis exhibitenhanced resistance against lepidopteran rice pests. Theor Appl Genet, 2005, 111 :1330_1337)，其田間實驗表現(xiàn)出了對螟蟲的高度抗 性，為發(fā)展Bt水稻提供了新的種質資源材料。2006年，該品系獲準在湖北省進行環(huán)境釋放 (轉Cry2A基因抗蟲水稻T2A-1在湖北省的環(huán)境釋放安全審批書.農(nóng)基安審字(2006)第 005號)，2009年獲準在湖北省進行生產(chǎn)性實驗(轉cry2A基因抗蟲水稻T2A-1在湖北省的 生產(chǎn)性試驗安全審批書.農(nóng)基安審字(2009)第007號)(http://new. croplab. org/web/ detail, jsp ？ i_ = 554)。轉cry2A基因水稻品系T2A-1在通過生產(chǎn)性試驗獲得生產(chǎn)應用 安全證書后，將可能成為我國又一個即將在生產(chǎn)上商業(yè)化種植的轉基因水稻。進行轉基因成分檢測是對轉基因植物進行有效監(jiān)督管理，保障其健康發(fā)展的重要 技術基礎。PCR技術是轉基因成分檢測中應用最為廣泛的技術。在應用這種技術進行轉基 因作物定性檢測時，根據(jù)其擴增的靶標區(qū)域和特異性將其分為四類一、篩選檢測，以轉基 因通用的外源啟動子和終止子為靶標區(qū)域；二、基因特異性檢測，以特異的外源目的基因為 靶標區(qū)域；三、構建特異性檢測，以轉基因元件之間的特異構建為靶標區(qū)域；四、轉化體特 異性檢測，以轉化體特異性片段為靶標區(qū)域。這四類檢測方法對轉基因作物的品系檢測特 異性是逐漸增加的。這四類檢測方法對轉基因作物的檢測特異性是逐漸增加的，轉化體特異性檢測是目前對轉基因品系檢測特異性最高的檢測方法，也是目前轉基因檢測中最常用 的身份檢測方法，這種檢測方法甚至能夠區(qū)分同一轉化載體產(chǎn)生的不同轉化植株品系。目前已經(jīng)有部分專利和文獻報道了我國轉基因水稻品系的轉化體特異性片段序 列和檢測方法，例如謝家建等人于2007年和2008年分別利用TAIL-PCR、genome walking 和LD-PCR等方法獲得了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優(yōu)63、科豐6號和科豐8號的轉化體特異 性片段序列，并建立了轉化體特異性的檢測方法。然而，在對現(xiàn)有的專利和文獻的分析中發(fā) 現(xiàn)，還沒有任何關于轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化體特異性片段序列和轉化體特異 性檢測方法的文章和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述領域中的空白，提供了轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化體特異性序 列以及鑒別轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化體特異性PCR方法，該PCR方法能利用普 通的PCR儀器、試劑快速準確鑒別出轉cry2A基因水稻品系T2A-1，以及以轉cry2A基因水 稻品系T2A-1為親本的水稻品系。轉cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR檢測方法，其特征在于PCR反應中的正向引 物依據(jù)SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的1-473位堿基序列設計，反向引物依據(jù)SEQ ID NO. 1 所示核苷酸序列的474-708位堿基序列設計。所述正向引物為T2A-1-F1 :5 ‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3，，所述反向引物為T2A-1-R1 :5 ‘-TGATACTCCGTTTGCATTGC-3，，擴增區(qū)域為擴增SEQ ID NOl的266-496位，擴增產(chǎn)物大小為231bp。所述PCR檢測方法在鑒別T2A-1以及以T2A-1為親本的水稻品種上的應用。本發(fā)明發(fā)明人采用TAIL-PCR方法，即以T2A-1的基因組的模板，根據(jù)轉cry2A基 因水稻品系T2A-1的T-DNA(圖1)邊界區(qū)域設計三個巢式特異性PCR引物bar-Tl、bar-T2 和bar-T3，依次與8個簡并引物AD2 AD6、AD8、AD9和ADll分別組合進行三次PCR擴 增(引物序列見表1)，PCR擴增產(chǎn)物在0. 8%的瓊脂糖膠上進行電泳，采用QIAquick Gel Extraction kit 回收擴增片段，連接到 pGEM-T easy (Promega, Madison, Wis.)，采用 ABI PRISM 1300Genetic Analyzer 進行序列測定。采用 vectorNTI 10. 0 (Invitrogen)比較和 分析測定的序列與載體序列相似性，在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)中 用BLASTN檢索相似的水稻基因組序列。分析結果表明8個AD引物中只有AD8的第三級 獲得了擴增產(chǎn)物(圖2)?；厥找顰D8的第三級擴增片段，連到載體上，進行序列測定，經(jīng) 序列測定擴增的條帶大小為708bp，如SEQ ID NO. 1所示。將如SEQ ID NO. 1提交NCBI數(shù) 據(jù)庫比對分析，其中l(wèi)_473bp為轉化載體序列，474-708bp為水稻基因組序列。即該系列為 T2A-1的轉化體特異性序列，即T2A-1這個轉基因品種說唯一擁有的序列。這種唯一性由外 源轉化載序列以及外源轉化載體在宿主基因組的特定插入位置決定。在轉基因過程中，外 源基因可能插入到宿主基因組的很多個位置，外源基因插入位置不同將得到不同的轉基因 品系，即得到不同的轉化體特異性。本發(fā)明獲得的轉化體特異性序列的5’端1 473bp為 外源轉化載體序列，3’端474-708bp為宿主水稻的基因組序列。基于轉化體特異性片段與 轉基因品系的一一對應性，通過在該特異性序列上設計引物，正向引物設計在1 473bp位 置，反向引物設計在3’端474-708bp位置，采用這對正反向引物對待測品系的基因組進行-1及其子代的有效手段。在檢測中，由于設 計的正反向引物的正確靶標序列就是其設計所依據(jù)的轉化體特異性序列，即SEQ ID NO. 1， 即事先已經(jīng)非常清楚引物在靶標序列上的識別位置和靶標序列片段長度，因此能夠預先計 算出擴增產(chǎn)物應該為多長，當某個待測品系的基因組擴增產(chǎn)物出現(xiàn)相應長度的擴增片段 時，說明該品系就是T2A-1或者以T2A-1為親本的水稻品種。本發(fā)明的核心貢獻在于獲得并向公眾提供了 T2A-1的轉化體特異性序列，基于轉 化體特異性序列與轉基因品系的一一對應性，提供了其在檢測T2A-1上的應用，即根據(jù)其 設計特異性引物來鑒別待測品系是否是T2A-1或其子代。而根據(jù)一段已知序列采用引物常 規(guī)設計規(guī)則來設計擴增該段序列的引物，對于本領域普通技術人員來說是普遍掌握的常規(guī) 技能，本發(fā)明的檢測方法不限于采用哪一對特異性引物，不同的人根據(jù)SEQ ID NO. 1即本發(fā) 明的檢測方法中的設計思路可能會設計出不同的引物對，但都是基于本發(fā)明提供了轉化體 特異性序列SEQ IDN0.1所示的序列這個前提，因此都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。發(fā)明人同時 也提供了采用一對自已設計的特異性引物T2A-1-F1/T2A-1-R1進行檢測的方法。由于轉cry2A基因水稻品系T2A-1在通過生產(chǎn)性試驗獲得生產(chǎn)應用安全證書后， 將可能成為我國又一個即將在生產(chǎn)上商業(yè)化種植的轉基因水稻品系。因此本發(fā)明為特異性 鑒定轉cry2A基因水稻品系T2A-1提供了便利，該方法的優(yōu)點在于快速、靈敏度高、特異性 好、所需實驗條件不高，因此有非常高的實用價值。


圖1轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化載體T-DNA區(qū)構建圖譜圖2轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化體特異性序列TAIL-PCR擴增圖譜M =DNA Marker DL2000，大小依次為 2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，IOObp ； 1-8 引物AD2 AD6、AD8、AD9和ADll的TAIL-PCR第三級擴增反應產(chǎn)物圖3轉cry2A基因水稻品系T2A-1轉化體特異性PCR檢測結果M =DNA Marker DL2000 ；1 轉 cry2A 基因水稻品系 T2A-1，2 空白對照，3-6 :4 個市 場水稻樣品。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等的分子克隆實驗室手冊(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實施例1轉cry2A基因水稻品系T2A_1轉化體特異性序列的克隆1實驗材料1. 1植物材料轉基因水稻轉cry2A基因水稻品系T2A-1 (華中農(nóng)業(yè)大學研發(fā))，本實驗室有保 存，自申請日起二十年內(nèi)，可向公眾發(fā)放用于實驗研究。1. 2酶與試劑
分子生物學試劑，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物 工程有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術有限責任公 司合成。1. 3實驗儀器PCR iTimiX :Eppendorf Mastercycle gradient (Eppendorf co.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測序儀(Applied Biosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA 電泳分析系統(tǒng)Kodak EDAS 290 (Kodak co.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實驗方法和過程2. 1水稻基因組DNA提取與檢測2. 1. 1水稻基因組DNA的提取取苗期水稻葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公 司)的操作手冊，進行水稻材料總DNA的提取。2.1.2水稻基因組DNA檢測取5μ 1提取的DNA溶液，以0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判 斷提取DNA的質量。采用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。2. 2轉cry2A基因水稻品系T2A-1轉化體特異性序列的分離TAIL-PCR用于擴增已知區(qū)域的側翼序列。根據(jù)轉cry2A基因水稻品系T2A-1的 T-DNA邊界區(qū)域設計三個巢式特異性PCR引物bar-Tl、bar_T2和bar_T3，依次與8個簡并 引物402 406、408、409和々011分別組合進行三次PCR擴增，引物序列見表1。PCR反應 條件見表2。表1用于TAIL-PCR擴增的特異性引物和簡并引物 表2TAIL-PCR反應程序和條件 2. 3序列測定和分析PCR擴增產(chǎn)物在0. 8 %的瓊脂糖膠上進行電泳，采用QIAquick Gel Extraction kit 回收擴增片段，連接到 pGEM-T easy (Promega，Madison, Wis.)，采用 ABI PRISM 1300Genetic Analyzer進行序列測定。采用vectorNTI 10. 0 (Invitrogen)比較和分析測定 的序列與載體序列相似性，在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中用BLASTN 檢索相似的水稻基因組序列。3實驗結果3. 1轉cry2A基因水稻品系T2A-1轉化體特異性序列測定轉cry2A基因水稻品系T2A-1的T-DNA邊界TAIL-PCR擴增結果表明，8個AD引物 中只有AD8的第三級獲得了擴增產(chǎn)物(圖2)?；厥找顰D8的第三級擴增片段，連到載體 上，進行序列測定。經(jīng)序列測定擴增的條帶大小為708bp。3. 2轉cry2A基因水稻品系T2A-1轉化體特異性序列分析將獲得的708bp序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，其中l(wèi)_473bp為轉化載體序列，474-708bp為水稻基因組序列。實施例2本發(fā)明的轉化體特異性PCR方法應用于鑒別轉cry2A基因水稻品系T2A-11實驗材料1. 1植物材料轉基因水稻轉cry2A基因水稻品系T2A-14個水稻材料，購自市場。1.2酶與試劑分子生物學試劑，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker等購自大連寶生物生物工程 有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術有限責任 公司合成。1. 3實驗儀器PCR 擴增儀Mastercycle gradient (Eppendorf co.)核酸電泳儀=DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA 電泳分析系統(tǒng)Kodak EDAS 290 (Kodak co.)其它儀器包括離心機，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實驗方法和過程2. 1水稻基因組DNA提取與檢測見實施例1中2. 1水稻基因組DNA提取與檢測。2. 2鑒別轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化體特異性PCR方法本發(fā)明的PCR方法應用于鑒別水稻樣品中是否含有轉cry2A基因水稻品系T2A-1。 采用引物T2A-1-F1/T2A-1-R1組合(序列見表4)，檢測購自市場的4個水稻樣品，見圖2。 實驗結果表明，轉cry2A基因水稻品系T2A-1能特異性擴增出231bp的產(chǎn)物，檢測的4個市 場樣品中均未能擴增獲得相同大小的片段?？寺∞Dcry2A基因水稻品系T2A-1的擴增片段，按實施例1中“2. 3序列測定和分 析”進行序列分析。序列分析結果表明，擴增片段序列與序列SEQ ID NOl的266-496位完
全一致。檢測結果表明本發(fā)明提供的PCR方法能很好地鑒別出水稻樣品中是否含有轉 cry2A基因水稻品系T2A-1。PCR 反應體系為0. 25 μ L rTaq (5U/ μ L)，5 μ L 10XPCR Buffer (Mg2+Plus)，4 μ L dNTP (各2. 5mM)，引物各2 μ L(IOyM),模板各2 μ L(20ng/ μ L)，加滅菌蒸餾水補足體積至 50 μ L0擴增程序為94 V預變性4min ；94 V變性30sec，52 °C退火30sec，72 V延伸 30sec，35 個循環(huán)；72°C IOmin0表4.鑒別轉cry2A基因水稻品系T2A-1的轉化體特異性PCR引物
權利要求
轉cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR檢測方法，其特征在于PCR反應中的正向引物依據(jù)SEQID NO.1所示核苷酸序列的1-473位堿基序列設計，反向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的474-708位堿基序列設計。
2.根據(jù)權利要求1所述的PCR檢測方法，所述正向引物為 T2A-1-F1 5 ‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3，，所述反向引物為T2A-1-R1 5 ‘-TGATACTCCGTTTGCATTGC-3，，擴增區(qū)域為擴增SEQ IDNOl的266-496位，擴增產(chǎn)物大小為231bp。
3.權利要求1或2所述PCR檢測方法在鑒別T2A-1以及以T2A-1為親本的水稻品種上 的應用。
全文摘要
本發(fā)明“轉cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR檢測方法及其應用”，涉及生物技術領域。本發(fā)明轉cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR檢測方法，其特征在于PCR反應中的正向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-473位堿基序列設計，反向引物依據(jù)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的474-708位堿基序列設計。能利用普通的PCR儀器、試劑快速準確鑒別出轉cry2A基因水稻品系T2A-1，以及以轉cry2A基因水稻品系T2A-1為親本的水稻品系。
文檔編號C12Q1/68GK101880725SQ201010233830
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權日2010年7月19日
發(fā)明者彭于發(fā), 謝家建 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所