專利名稱：一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧行業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是利用TLR2 (Toll-like rec印tor2)基 因特異啟動子鑒別海福(Hereford)特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)2003年出版的《中國畜禽遺傳資源狀況》的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國黃牛有69個 品種，其中地方品種52個，培育品種5個，引入品種12個，是世界上牛品種最多的國家。中 國本地黃牛曾經(jīng)長期以役用為主，它具有肉品質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(邱懷等， 1986年)。然而，我國黃牛品種的絕大部分個體尚不具備優(yōu)良肉牛品種的體型結(jié)構(gòu)特點，存 在產(chǎn)肉性能較低、生長速度較慢、飼料報酬較低、母牛的泌乳性能較低等缺點，為了克服中 國黃牛的缺陷，幾十年來，我國先后引進(jìn)了 28個國外肉牛品種與當(dāng)?shù)攸S牛進(jìn)行雜交，均取 得了一定的效果，其中，引進(jìn)的品種有西門塔爾牛、夏洛來、利木贊、海福特牛等。然而，許多 地方出現(xiàn)了盲目雜交，輕視選育的現(xiàn)象。企業(yè)和養(yǎng)殖戶為了追求一時的高產(chǎn)，采取大量、盲 目的雜交改良，致使全國性牛品種混雜，固有品種的優(yōu)良基因庫與基因組合體系因雜交而 混亂，甚至解體。此外，近年來，由于一些品種缺乏肉用選育和導(dǎo)入改良的統(tǒng)一規(guī)劃，進(jìn)行 導(dǎo)入雜交時引入國外良種肉牛品種比較雜亂，甚至，在引種時，可能引入的個體就是雜種個 體，而非純種牛個體。由于一些優(yōu)良種質(zhì)特性的基因資源丟失，從而導(dǎo)致種質(zhì)和產(chǎn)肉性能的 下降。海福特(Hereford)牛原產(chǎn)于英國，是世界上最古老的早熟中小型肉牛品種，具有 生長快、早熟易肥、肉質(zhì)好、飼料報酬高等優(yōu)良的種質(zhì)特性，它在世界肉牛業(yè)發(fā)展中起了重 要作用。我國于1964、1973和1974年分別從英國引進(jìn)，1995-1996年又從北美引進(jìn)大型海 福特牛品種(許尚忠等，2009)。純種海福特牛具有典型的“六白”(四肢下部、腹下部、頸下 部、耆甲和尾帚呈白色)的外貌特征，海福特牛與我國黃牛雜交效果較好，然而，半數(shù)一代 雜種海福特牛還具有“六白”特征，因此，僅依據(jù)其外貌特征，很難鑒別純種海福特牛和雜種 的海福特牛。那么，如何識別純種海福特牛和雜種海福特牛，是一個亟待解決的問題，其在 品種的引進(jìn)、品種的雜交改良與選育，以及牛肉貿(mào)易的標(biāo)示等方面，具有非常重要的作用。 特有等位基因是指品種在所研究的座位上特有，而其它品種沒有的等位基因。它在畜禽的 遺傳多樣性、品種起源、品種識別、產(chǎn)品追溯中發(fā)揮著越來越重要的作用。TLR2 (Toll-like receptor2)基因是 Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLR)蛋 白基因家族重要成員之一，TLR2能夠識別多種病原微生物及其產(chǎn)物，介導(dǎo)天然免疫，通過細(xì) 胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動獲得性免疫(Stevens等，2008)。牛TLR2基因定位在17號染色體上， 含有2個外顯子，基因全長約13. 2kb，其mRNA長度約為3. 5kb，編碼784個氨基酸(White 等，2003)。目前，已有相關(guān)研究報道了 TLR2基因的外顯子和3’非翻譯區(qū)的遺傳變異在在中 國荷斯坦牛、渤海黑牛、魯西黃牛、挪威紅牛、瘤牛等群體中的遺傳多樣性，單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)及其單倍型與牛乳腺炎的關(guān)系(馬騰壑等，2007 ；Opsal等，2008 ；張翠霞等，2009 ； 劉利等，2009 ；Mariotti等，2009 ；Seabury等，2010)。但是，以上研究與相關(guān)文獻(xiàn)報道中，還沒有關(guān)于TLR2基因啟動子區(qū)的相關(guān)研究，更沒有利用LTR2基因啟動子區(qū)的特異等位基因 來鑒別海福特純種牛、海福特雜種牛及其它品種牛的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用TLR2 (Toll-like receptor2)基因特異啟動子鑒別海福特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實現(xiàn)的，本發(fā)明的鑒別海福特(Hereford)純種 牛和雜種牛的方法，是先獲得目標(biāo)測試牛的基因，設(shè)計該基因TLR2基因的啟動子區(qū)基因的 上游引物和下游引物，建立PCR反應(yīng)體系，通過PCR方法來擴(kuò)增TLR2基因的啟動子區(qū)片段， 對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過鑒定TLR2基因啟動子區(qū)的300bp 307bp位點的基因型，來 鑒別海福特純種牛和雜種牛，還是其它品種的牛。當(dāng)TLR2基因啟動子區(qū)片段為627bp，且 300bp 307bp位點為AATGAATG/AATGAATG的純合子時，則為純種的海福特牛；當(dāng)TLR2基 因啟動子區(qū)片段為627bp，且300bp 307bp位點為AATGAATG/AATGCTTC雜合子時，則為雜 種的海福特牛；當(dāng)TLR2基因啟動子區(qū)片段為623bp，且300bp 307bp位點為AATGAATG/ AATGCTTC的純合子時，則為其它品種的牛。所述的擴(kuò)增TLR2基因啟動子區(qū)的上游引物序列為SEQ ID NO. 4，下游引物序列 為SEQ ID NO. 5。所述的PCR反應(yīng)體系是總體系為20 μ 1，其中包括10 IOOng的基因組DNA、 Ι.Ομ 1濃度為lOpmol/μ 1的上游引物、1. 0μ 1濃度為IOpmol/μ 1的下游引物，2.0μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 濃度為 0. 25mM 的 dNTPs、2. OU 酶活單位的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所述的PCR方法擴(kuò)增TLR2基因的啟動子區(qū)的反應(yīng)程序是94°C預(yù)變性4min ；94°C 變性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是海福特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的TLR2基因的啟動子存在多態(tài)性差 異，通過對相關(guān)位點的檢測，即利用鑒定品種特異的TLR2基因啟動子，可以鑒別海福特純 種牛、海福特雜種牛和其它品種的牛。本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確、方便地鑒別海福特純種牛和雜種牛，并且易于實驗室操作， 污染少，成本低，具有較強(qiáng)的實用性。本發(fā)明的方法在海福特牛的品種引進(jìn)、海福特牛肉的進(jìn)出口貿(mào)易、與本地牛的雜 交改良、肉牛新品系的培育、牛肉產(chǎn)品溯源等方面具有很好的應(yīng)用前景，能夠產(chǎn)生可觀的經(jīng) 濟(jì)效益和良好的社會效益。


附圖1是本發(fā)明的實施例一的測序圖；附圖2是本發(fā)明的實施例二的測序圖；附圖3是本發(fā)明的實施例三的測序圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法作以 下詳細(xì)說明。本發(fā)明是通過對不同牛品種TLR2基因的啟動子區(qū)序列和單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 分析來揭示海福特純種牛、海福特雜種牛及它品種牛的TLR2基因的啟動子的遺傳多樣性 差異。研究對象包括，海福特牛純種牛、海福特雜交1代牛、西門塔爾牛、利木贊牛、夏洛來 牛、娟姍牛、利木贊與魯西黃牛的雜交牛、魯西黃牛、渤海黑牛、海南黑牛、南陽牛、荷斯坦牛 奶牛等品種牛共425個體。采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從牛的血液中提取基因組DNA，用分光光度計或1 %的 瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA的濃度和純度。從UCSC網(wǎng)站下載牛TLR2基因上游的2kb以及 5’-UTR(非翻譯區(qū))的序列作為參考序列，使用Matlnspector軟件預(yù)測序列的啟動子區(qū)域， 利用Primerf. 0軟件設(shè)計特異性引物擴(kuò)增牛TLR2基因的啟動子區(qū)片段(627bp)。之后，采 用PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序序列結(jié)果利用ChromasPro vl. 41軟件進(jìn)行 分析，然后采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對分析，尋找品種間的重要SNPs和品種特異的啟動 子區(qū)。結(jié)果表明海福特純種牛、海福特雜種牛和其它品種牛的TLR2基因啟動子區(qū)SNP位點 存在多樣性，并且存在品種特異的啟動子。實施例1采用酚-氯仿抽提法從第一目標(biāo)牛血液中提取基因組DNA，設(shè)計特異性引物用于 擴(kuò)增TLR2基因啟動子區(qū)片段，所用的引物序列為上游引物序列為=SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3，；下游引物序列為=SEQ ID NO. 5 TLR2-promoter_R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反應(yīng)體系如下總體系為20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基 因組 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. 0 μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所用的PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測后進(jìn)行測序，得到SEQ ID N0. 1，測序峰圖如附 圖1，片段長度為627bp，該序列中300bp 307bp的基因是AATGAATG的表現(xiàn)型為AA的純 合子，鑒定結(jié)果為海福特純種牛。實施例2采用酚-氯仿抽提法從第二目標(biāo)牛血液中提取基因組DNA，設(shè)計特異性引物用于 擴(kuò)增TLR2基因啟動子區(qū)片段，所用的引物序列為上游引物序列為SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3‘；下游引物序列為=SEQ ID N0. 5 TLR2-promoter-R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反應(yīng)體系如下總體系為20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基因組 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. O μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所用的PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測后進(jìn)行測序，得到SEQ ID NO. 2，測序峰圖如附 圖2，片段長度為627bp，測序峰圖中自300bp往后的測序峰程套峰，此現(xiàn)象說明該序列中 300bp 307bp的正鏈基因是AATGAATG，其互補(bǔ)鏈?zhǔn)乔八奈换蚴荰TAC且后四位基因缺失 的互補(bǔ)鏈的基因型，主鏈長度為627bp，互補(bǔ)鏈長度為623bp的表現(xiàn)型為AB的雜合子，鑒定 結(jié)果為海福特雜種牛。實施例3采用酚-氯仿抽提法從第三目標(biāo)牛血液中提取基因組DNA，設(shè)計特異性引物用于 擴(kuò)增TLR2基因啟動子區(qū)片段，所用的引物序列為上游引物序列為=SEQ ID NO. 4 TLR2-promoter_F :5，-ggattctccaggcaagaaca-3，；下游引物序列為=SEQ ID N0. 5 TLR2-promoter-R :5，_agtcctgtggtggtcccttt_3，。所用的PCR反應(yīng)體系如下總體系為20微升(μ 1)，其中，包括10 IOOng的基 因組 DNA、1. 0μ 1 上游引物(lOpmol/μ 1)、1.0μ 1 下游引物(IOpmol/μ 1)，2. 0 μ 1 10XPCR Buffer (含鎂離子 Mg2+)，2 μ 1 的 dNTPs (0. 25mM)、2. OU 的 Taq DNA 聚合酶和滅菌水。所用的PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延 伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1 %瓊脂糖電泳檢測后進(jìn)行測序，得到SEQ ID N0. 3，測序峰圖如附圖 3，片段長度為623bp，該序列中300bp 307bp位點為AATGAATG/AATGCTTC的表現(xiàn)型為BB 的純合子時，則為其它品種的牛。實施測序序列結(jié)果利用ChromasPro vl. 41軟件進(jìn)行分析，然后采用DNAMAN軟件 進(jìn)行序列比對分析，尋找品種間的重要SNPs和品種特異的啟動子區(qū)。表1.不同牛品種TLR2基因啟動子區(qū)的測序結(jié)果與300bp 307bp位點的基因型
權(quán)利要求
一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于先獲得目標(biāo)測試牛的基因，設(shè)計該基因TLR2基因的啟動子區(qū)的上游引物和下游引物，建立聚合酶鏈反應(yīng)PCR體系，通過PCR方法來擴(kuò)增TLR2基因的啟動子區(qū)片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過鑒定TLR2基因啟動子區(qū)的300bp～307bp位點的基因型，來鑒別海福特純種牛和雜種牛，還是其它品種的牛。當(dāng)TLR2基因啟動子區(qū)片段為627bp，且300bp～307bp位點為AATGAATG/AATGAATG的純合子時，則為純種的海福特牛；當(dāng)TLR2基因啟動子區(qū)片段為627bp，且300bp～307bp位點為AATGAATG/AATGCTTC雜合子時，則為雜種的海福特牛；當(dāng)TLR2基因啟動子區(qū)片段為623bp，且300bp～307bp位點為AATGAATG/AATGCTTC的純合子時，則為其它品種的牛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于所述的 擴(kuò)增TLR2基因啟動子區(qū)的上游引物序列為=SEQ ID NO. 4，下游引物序列為=SEQ ID NO. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于所述 的PCR反應(yīng)體系是總體系為20 μ 1，其中包括10 IOOng的基因組DNA、1. 0 μ 1濃度為 IOpmol/μ 1 的上游引物、Ι.Ομ 1 濃度為 IOpmol/μ 1 的下游引物，2. Ομ 1 IOXPCR Buffer, 2 μ 1濃度為0. 25mM的dNTPs、2. OU酶活單位的Taq DNA聚合酶和滅菌水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其特征在于所述的 PCR方法擴(kuò)增TLR2基因的啟動子區(qū)的反應(yīng)程序是94°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，60°C退 火30s，72°C延伸45s，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒別海福特純種牛和雜種牛的方法，其檢測牛的TLR2基因的啟動子區(qū)627bp的300bp～307bp位點來鑒定是海福特純種?；蛘呤请s種牛，還是其它品種的牛。本發(fā)明的方法具有簡便快速、準(zhǔn)確可靠、成本低等特點，具有較強(qiáng)的實用性。本發(fā)明的方法在海福特牛的品種引進(jìn)、海福特牛肉的進(jìn)出口貿(mào)易、與本地牛的雜交改良、肉牛新品系的培育、肉牛產(chǎn)品的分子標(biāo)識與溯源等方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101955999SQ20101023358
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者仲躋峰, 侯明海, 劉利, 李建斌, 李秋玲, 李榮嶺, 王澤英, 王長法, 鞠志花, 黃金明 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心