專利名稱：韭蔥黃條病毒檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus，LYSV)是馬鈴薯 Y 病毒屬 Poij^i^/s 的典型成員，是侵染大蒜的主要病毒。LYSV由蚜蟲以非持久方式傳播，廣泛分布于世界各大 蒜種植區(qū)，嚴(yán)重影響大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)。由于大蒜為無性繁殖作物，隨著種植年限的增加病 毒病危害愈加嚴(yán)重，給大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重影響。目前最有效的防治方法是大蒜脫 毒苗的使用，而病毒檢測技術(shù)貫穿始終。目前，大蒜病毒病的檢測技術(shù)主要有生物學(xué)檢測、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。 由于大蒜病毒往往都是復(fù)合侵染大蒜，具有相似的特征，試驗(yàn)寄主范圍較重疊，并且在感病 寄主上表現(xiàn)相似的癥狀，所以，很難通過生物學(xué)方法對大蒜病毒進(jìn)行分離與鑒定。血清學(xué)方 法仍是鑒定大蒜病毒的常用方法，但已有研究表明，同一屬內(nèi)不同病毒間⑶基因氨基酸序 列同源性較高，抗血清常常會產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而造成假陽性的出現(xiàn)，不能將這些病毒有效 的區(qū)分開；而且當(dāng)病毒含量比較低的時候血清學(xué)方法很難檢測到病毒。分子檢測技術(shù)是發(fā) 展趨勢，尤其是RT-PCR分子檢測技術(shù)給大蒜病毒的早期診斷提供了更加快捷、準(zhǔn)確的檢測 手段。目前，我國已有關(guān)于LYSV的RT-PCR分子檢測體系的建立，但還沒有用于LYSV檢測 的兩步RT-PCR檢測試劑盒的研制。一旦需要時，主要從國外進(jìn)口，由于價(jià)格昂貴，又不能及 時供應(yīng)，所以在國內(nèi)推廣有一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有大蒜病毒病的檢測方法存在的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確以 及檢測成本高的問題，而提供了韭蔥黃條病毒檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明韭蔥黃條病毒檢測試劑盒由20yL濃度為lOymol/L的Oligo dT (18)、 40 μ L 濃度為 10mmol/L 的 d NTPs,20 μ L 濃度為 200mmol/L 的 DTT、20 μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、 10μ L 濃度為 40u/y L RNase 抑制齊[J、40 μ LlOX M-MLV Reaction BufferUOy L Taq DNA Polymerase、200 μ LlOXTaq Buffer,200 μ L 濃度為 25mmol/LMgCl2、20 μ L 濃度為 10 μ mol/L β -actin上游引物和20 μ L濃度為10 μ mol/L β -actin下游引物組成；其中 β -actin 上游引物序列為 5‘ -CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3‘，β -actin 下游引物 序列為 5' -CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3'。本發(fā)明韭蔥黃條病毒檢測方法按照以下步驟進(jìn)行一、向PCR管中依次加入 2 5 μ g待測樣品的RNA、1 μ L濃度為10 μ mol/L的Oligo dT α8)、1 μ L濃度為10mmol/L的 d NTPs，而后加入DEPC-H2O補(bǔ)足至總體積為15. 5 μ L，在65°C條件下保溫5min，然后冰 浴5min;二、向步驟二反應(yīng)后的產(chǎn)物中依次加入0.5 4 1^濃度為4011/^1^ RNase抑制劑、 2 μ LlOXAMVReaction Buffer、1 μ L濃度為 200mmol/L 的 DTT、1 μ L逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)混勻后， 在2000rpm的條件下離心20s，然后在42°C條件下保溫1 h后在70°C條件下保溫15min得到cDNA模板；三、向離心管中依次加入35. 5 μ L滅菌雙蒸水、5 μ LlOXTaq Buffer、l μ L濃 度為 l(kimol/L 的 dNTPs、lyL 濃度為 10 μ mol/Lβ-actin 上游引物、1 μ L濃度為 IOymol/ L^ -actin 下游引物、2 μ LcDNA 模板、0. 5 μ L Taq DNA Polymerase 和 4 μ L MgCl2 混勻， 在2000rpm條件下離心20s后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5 min, 94°C變性 30 s，45 65°C退火45s，72°C延伸1 min，共25 35個循環(huán)，72°C延伸10 min，4°C保溫； 四、PCR反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即實(shí)現(xiàn)了韭蔥黃條病毒的檢測。本發(fā)明韭蔥黃條病毒檢測試劑盒為工作液形式，原料價(jià)格低廉，且本發(fā)明方法對 實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，極大的降低了檢測成本，且經(jīng)過與DAS-ELISA方法、進(jìn)口植物病毒RT-PCR 檢測試劑盒進(jìn)行了比對試驗(yàn)，用本發(fā)明的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒進(jìn)行檢測的結(jié)果穩(wěn)定性 很好；本發(fā)明的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒也進(jìn)行了不同實(shí)驗(yàn)人員的比對試驗(yàn)，檢測結(jié)果穩(wěn) 定一致；本發(fā)明的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒還有不同的PCR儀進(jìn)行了比對試驗(yàn)，檢測結(jié)果 穩(wěn)定一致；本發(fā)明的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒也進(jìn)行了不同實(shí)驗(yàn)室的比對試驗(yàn)，檢測結(jié)果 穩(wěn)定一致。最后組裝成試劑盒，用對試劑盒進(jìn)行了田間樣品檢測試驗(yàn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定性非常 好。本發(fā)明的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒檢測結(jié)果準(zhǔn)確。


圖1為具體實(shí)施方式
二中檢測結(jié)果的電泳圖，圖中M表示DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量，1表 示陰性對照，2表示陽性對照，3 6表示待測樣品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式韭蔥黃條病毒檢測試劑盒由20yL、濃度為 10 μ mol/L 的 Oligo dT (18)、40 μ L 濃度為 IOmmol/L 的 d NTPs>20 μ L 濃度為 200mmol/ L 的 DTT、20y L 逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、10y L 濃度為 40u/y L RNase 抑制齊[J、40 μ LlOX M-MLV Reaction BufferUOy L Taq DNA Polymerase>200 μ LlOXTaq Buffer>200y L 濃度為 25mmol/LMgCl2、20 μ L 濃度為 10 μ mol/L^ -actin 上游引物和 20 μ L 濃度為 10 μ mol/ L^-actin下游引物組成；其中β -actin上游引物序列為5' -CCGAATTCATGTTTGAGTATCAA GCCGG-3‘，β-actin 下游引物序列為 5' -CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3‘。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式韭蔥黃條病毒檢測方法按照以下步驟進(jìn)行一、向 PCR管中依次加入2 5 μ g待測樣品的RNA、1 μ L濃度為10 μ mol/L的Oligo dT(18)、1 μ L濃 度為10mmol/L的d NTPs，而后加入DEPC-H2O補(bǔ)足至總體積為15. 5 μ L，在65°C條件下 保溫5min，然后冰浴5min ；二、向步驟二反應(yīng)后的產(chǎn)物中依次加入0. 5 μ L濃度為40u/μ L RNase 抑制劑、2 μ LlOXAMVReaction Buffer、1 μ L 濃度為 200mmol/L 的 DTT、lyL 逆轉(zhuǎn)錄 酶(AMV)混勻后，在2000rpm的條件下離心20s，然后在42°C條件下保溫1 h后在70°C條件 下保溫15min得到cDNA模板；三、向離心管中依次加入35. 5 μ L滅菌雙蒸水、5 μ LlOXTaq Buffer、l μ L 濃度為 l(kimo 1/L 的 d NTPs、l μ L 濃度為 10 μ mol/L β-actin 上游引物、1 μ L 濃度為 10ymol/L3-actin 下游引物、2yLcDNA 模板、0.5yL Taq DNA Polymerase 禾口 4 μ L MgCl2混勻，在2000rpm條件下離心20s后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，45 65°C退火45s，72°C延伸1 min，共25 35個循環(huán)，72°C延伸 10 min，4°C保溫；四、PCR反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即實(shí)現(xiàn)了的檢測；步驟三中的 β-actin 上游引物序列為 5' -CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3‘，β-actin 下游引物 序列為 5' -CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3'。本實(shí)施方式中涉及的藥品距為韭蔥黃條病毒檢測試劑盒的組分，其中韭蔥黃條 病毒檢測試劑盒韭蔥黃條病毒檢測試劑盒由20 μ L、濃度為lOymol/L的Oligo dT (18)、 40 μ L 濃度為 10mmol/L 的 d NTPs,20 μ L 濃度為 200mmol/L 的 DTT、20 μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、 10μ L 濃度為 40u/y L RNase 抑制齊[J、40 μ LlOX M-MLV Reaction BufferUOy L Taq DNA Polymerase>200 μ LlOXTaq Buffer>200y L 濃度為 25mmol/LMgCl2、20 μ L 農(nóng)度為 10 μ mol/L β -actin上游引物和20 μ L濃度為10 μ mol/L β -actin下游引物組成；其中 β -actin 上游引物序列為 5‘ -CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3‘，β -actin 下游引物 序列為 5' -CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3'。本實(shí)施方式的檢測方法的電泳結(jié)果呈陽性，即可確定為感染了韭蔥黃條病毒。本實(shí)施方式的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒也進(jìn)行了不同實(shí)驗(yàn)人員的比對試驗(yàn)，檢測 結(jié)果穩(wěn)定一致；本實(shí)施方式的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒還有不同的PCR儀進(jìn)行了比對試 驗(yàn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定一致；本實(shí)施方式的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒也進(jìn)行了不同實(shí)驗(yàn)室的比 對試驗(yàn)，檢測結(jié)果穩(wěn)定一致。最后組裝成試劑盒，用對試劑盒進(jìn)行了田間樣品檢測試驗(yàn)，檢 測結(jié)果穩(wěn)定性非常好。本實(shí)施方式的韭蔥黃條病毒檢測試劑盒檢測結(jié)果準(zhǔn)確。以感染LYSV的大蒜葉片為待測樣品(3飛個樣品)，提取感染LYSV的大蒜葉片總 RNA，用本實(shí)施方式的檢測方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，從圖可以看出，電泳圖中有一條 異性片段，長度約為885 bp，而陰性對照無此特異條帶，檢測結(jié)果與本實(shí)施方式的結(jié)論相 符。
權(quán)利要求
韭蔥黃條病毒檢測試劑盒，其特征在于韭蔥黃條病毒檢測試劑盒由20μL、濃度為10μmol/L的Oligo dT(18)、40μL濃度為10mmol/L的d NTPs、20μL濃度為200mmol/L的DTT、20μL逆轉(zhuǎn)錄酶、10μL濃度為40u/μL RNase抑制劑、40μL10× M MLV Reaction Buffer、10μL Taq DNA Polymerase、200μL10×Taq Buffer、200μL 濃度為25mmol/LMgCl2、20μL濃度為10μmol/Lβ actin上游引物和20μL濃度為10μmol/Lβ actin下游引物組成；其中β actin上游引物序列為5′ CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG 3′，β actin下游引物序列為5′ CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT 3′。
2.韭蔥黃條病毒檢測方法，其特征在于韭蔥黃條病毒檢測方法按照以下步驟進(jìn)行 一、向PCR管中依次加入2 5 μ g待測樣品的RNA、1 μ L濃度為10 μ mol/L的Oligo dT (18)、 IyL濃度為10mmol/L的d NTPs，而后加入DEPC-H2O補(bǔ)足至總體積為15. 5 μ L，在65°C條 件下保溫5min，然后冰浴5min ；二、向步驟二反應(yīng)后的產(chǎn)物中依次加入0. 5 μ L濃度為40u/ μ L RNase 抑制劑、2 μ LlO XAMVReaction Buffer、1 μ L 濃度為 200mmol/L 的 DTT、1 μ L 逆 轉(zhuǎn)錄酶混勻后，在2000rpm的條件下離心20s，然后在42°C條件下保溫1 h后在70°C條件 下保溫15min得到cDNA模板；三、向離心管中依次加入35. 5 μ L滅菌雙蒸水、5 μ LlOXTaq Buffer、l μ L 濃度為 l(kimo 1/L 的 d NTPs、l μ L 濃度為 10 μ mol/L β-actin 上游引物、1 μ L 濃度為 10μ mol/L β-actin 下游引物、2μ LcDNA 模板、0· 5μ L Taq DNA Polymerase 禾口 4 μ L MgCl2混勻，在2000rpm條件下離心20s后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性 5 min，94°C變性30 s，45 65°C退火45s，72°C延伸1 min，共25 35個循環(huán)，72°C延伸 10 min，4°C保溫；四、PCR反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即實(shí)現(xiàn)了的檢測；步驟三中的 β-actin 上游引物序列為 5' -CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3‘，β-actin 下游引物 序列為 5' -CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3'。
全文摘要
韭蔥黃條病毒檢測試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明涉及檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有大蒜病毒病的檢測方法存在的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確以及檢測成本高的問題。試劑盒由OligodT(18)、dNTPs、DTT、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、10×M-MLVReactionBuffer、TaqDNAPolymerase、10×TaqBuffer、濃度為25mmol/LMgCl2、β-actin上游引物和β-actin下游引物組成。方法待測樣品經(jīng)RT反應(yīng)、PCR反應(yīng)、電泳檢測即實(shí)現(xiàn)了韭蔥黃條病毒的檢測。本發(fā)明的方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測成本低。
文檔編號C12Q1/68GK101985663SQ201010233658
公開日2011年3月16日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者孟憲欣, 張威, 申宇, 白艷菊, 耿宏偉, 范國權(quán), 高艷玲 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所