專利名稱：一種對吉西他濱耐藥的人胰腺癌細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及一種對吉西他濱耐藥的人胰腺癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后極差的惡性腫瘤。在歐洲，2009年胰腺癌新發(fā)病人60，000例，死亡人數(shù)59，000例，躍居歐洲惡性腫瘤死亡率第五；在美國，胰腺癌的年新發(fā)病例數(shù)約為42，470例，排在第八，但是胰腺癌死亡人數(shù)為35，240例，已經(jīng)在惡性腫瘤中成為第三位死因；在我國，胰腺癌是消化道惡性腫瘤的三大死亡原因之一，其病死率呈逐年上升趨勢。胰腺癌不易在早期發(fā)現(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異的臨床表現(xiàn)和腫瘤標(biāo)志物，影像學(xué)特征亦不典型；而且由于胰腺解剖學(xué)和生物學(xué)特征，易侵犯周圍臟器和發(fā)生轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者在確診時(shí)，已經(jīng)是疾病晚期，并轉(zhuǎn)移至肝、肺、脊柱、腎或腎上腺等器官，只能行探查或姑息性手術(shù)，但遠(yuǎn)期效果不理想，患者大多死于肝轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)。手術(shù)切除是提高胰腺癌病人生存率的唯一希望，但是85%的病人在就診時(shí)已屬晚期，僅10% 30%左右可行手術(shù)治療，并且術(shù)后5年生存率平均不超過5 %。除手術(shù)治療外，化療仍是目前治療進(jìn)展期胰腺癌， 預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)，延長病人生存時(shí)間和提高生活質(zhì)量的重要手段之一。1996年鹽酸吉西他濱(健擇)在美國上市。今天吉西他濱(Gemcitabine)已在 90多個(gè)國家獲得批準(zhǔn)使用，成為治療胰腺癌的一線藥物。但在長期的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)吉西他濱治療胰腺癌的效果仍不理想。近年來吉西他濱的耐藥情況越來越嚴(yán)重，現(xiàn)在吉西他濱用于治療胰腺癌的有效率下降到20%以下了。原因主要在于胰腺癌細(xì)胞獲得性或者內(nèi)在的耐藥性，這使得許多接受吉西他濱治療的患者在遭受了化療毒副作用的同時(shí)，卻沒有得到較好的治療效果。目前，有關(guān)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚，也缺少用于胰腺癌發(fā)生機(jī)理及抗胰腺癌藥物開發(fā)的接近臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。運(yùn)用臨床腫瘤組織直接建立細(xì)胞系的成功率較低，因此，通過運(yùn)用臨床腫瘤標(biāo)本先建立動(dòng)物模型， 進(jìn)而通過原代培養(yǎng)建立的人源腫瘤細(xì)胞更接近于腫瘤的臨床生物學(xué)特性，對藥物的耐藥性及敏感性將具有更好的預(yù)測性。對吉西他濱高度耐藥的胰腺癌細(xì)胞株將是研究胰腺癌原發(fā)性耐藥和尋找耐藥的特征生物標(biāo)記物的良好試驗(yàn)材料，然而目前研究使用的多為誘導(dǎo)耐藥的細(xì)胞株，缺乏原發(fā)性耐藥胰腺癌細(xì)胞株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的人胰腺癌細(xì)胞系存在的生物多樣性低， 與臨床上胰腺癌的生物學(xué)性狀相差較大，吉西他濱的耐藥情況嚴(yán)重的不足，提供一種新的人胰腺癌細(xì)胞系及其用途，該細(xì)胞系對吉西他濱耐藥，是研究胰腺癌耐藥和尋找耐藥的特征生物標(biāo)記物的良好試驗(yàn)材料。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種對吉西他濱耐藥的人胰腺癌細(xì)胞，其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :C201010。本發(fā)明還提供如上所述的人胰腺癌細(xì)胞的子代細(xì)胞。本發(fā)明還提供如上所述的人胰腺癌細(xì)胞的用途，用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生胰腺癌。 所述的哺乳動(dòng)物可以是各種哺乳動(dòng)物，優(yōu)選裸小鼠。所述的裸小鼠優(yōu)選BALC/c裸小鼠。所述的胰腺癌優(yōu)選胰低分化或中分化腺癌。本發(fā)明還提供一種上述人胰腺癌細(xì)胞系的建立方法，包括以下步驟，1)獲得新鮮的臨床胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本，切成20 50mg的小塊，皮下穿刺接種哺乳動(dòng)物；2)穿刺接種80 100天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。其中，所述的哺乳動(dòng)物、所述的胰腺癌都如上所述。所述的新鮮的臨床胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本較佳的用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液或生理鹽水漂洗后再進(jìn)行接種。較佳的用新鮮的HBSS緩沖液(含500U/ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml兩性霉素B)漂洗。所述的接種的方式可以是皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內(nèi)接種。對于胰腺癌較佳的是進(jìn)行皮下穿刺接種。所述的原代培養(yǎng)方法可以是常規(guī)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。較佳的包括以下步驟將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，于37°C孵箱5% CO2條件下培養(yǎng)；次日，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶內(nèi)加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含5%胎牛血清，10 μ g/ml重組人胰島素，6. 7ng/ml亞硒酸鈉，5. 5 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，2 μ g/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100y g/ ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素B)，靜置培養(yǎng)；所述的傳代培養(yǎng)方法可以是常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法。較佳的包括以下步驟吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的0. 05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細(xì)胞，用無菌細(xì)胞刮刀輕輕掛擦培養(yǎng)瓶表面，收集全部細(xì)胞，離心，分別接種于新的培養(yǎng)瓶；當(dāng)細(xì)胞傳代到第五代以后，將培養(yǎng)液更換為RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清， 10 μ g/ml重組人胰島素，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素 B)。本發(fā)明還提供一種篩選治療胰腺癌的候選藥物的方法，包括以下步驟將測試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致胰腺癌癥狀改善或治愈的測試化合物就是治療胰腺癌的候選化合物，其中所述的動(dòng)物模型具有如上所述的人胰腺癌細(xì)胞所導(dǎo)致的胰腺癌腫瘤。具體的，本發(fā)明的篩選治療胰腺癌的候選藥物的方法包括以下步驟(1)將所述的胰腺癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于哺乳動(dòng)物皮下，進(jìn)行飼養(yǎng)，獲得人胰腺癌動(dòng)物模型；(2)將測試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致胰腺癌癥狀改善或治愈的測試化合物就是治療胰腺癌的候選化合物。其中，所述的動(dòng)物模型優(yōu)選裸小鼠。所述的裸鼠優(yōu)選BALB/C裸小鼠。較佳的可采用細(xì)胞懸液注射來建立動(dòng)物模型。在施用步驟中，將測試化合物通過尾靜脈注射、口服、腹腔注射或于腫瘤局部用藥等方式施用于胰腺癌荷瘤動(dòng)物。較佳的使用對照實(shí)驗(yàn)，一種優(yōu)選的方式是同時(shí)還使用不含測試化合物的溶劑施用于胰腺癌荷瘤動(dòng)物作為對照。所述的化合物較佳的是治療耐藥型人胰腺癌的候選藥物。本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的人胰腺癌細(xì)胞性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，為胰腺癌研究提供新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。本發(fā)明的細(xì)胞系具有高度成瘤性，可以成功制備胰腺癌動(dòng)物模型，所制的得動(dòng)物模型可以用于基礎(chǔ)研究及藥物篩選。通過與裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤相比較，可用來分析體外、體內(nèi)藥物敏感性及耐藥性的相關(guān)性，進(jìn)而可以建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的抗胰腺癌藥物篩選平臺。也可用于研究胰腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)理，進(jìn)而可以尋找胰腺癌轉(zhuǎn)移特征生物標(biāo)志物。是人胰腺癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞系。特別的，本發(fā)明的細(xì)胞系對吉西他濱原發(fā)性耐藥， 屬于原發(fā)性耐藥，可用于胰腺癌耐藥創(chuàng)分子機(jī)制研究，篩選治療耐藥型人胰腺癌的候選藥物，和尋找耐藥的特征生物標(biāo)記物，從這一點(diǎn)上來說，具有突出的意義。牛物材料的保藏本發(fā)明的人胰腺癌細(xì)胞，于2010年3月31日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)(武漢，中國)，培養(yǎng)物名稱為人源胰腺癌細(xì)胞PAXC-002，保藏編號為CCTCC NO C201010。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1. PAXC-002細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(100X)。圖2. PAXC-002細(xì)胞的染色體分析。A. PAXC-002細(xì)胞；B.小鼠細(xì)胞染色體(參照)。圖3. PAXC-002細(xì)胞免疫組化染色(DAB法)Α·細(xì)胞角蛋白Cytokeratin (200Χ)； B. CA19-9(200X) ； C.癌胚抗原 CEA QOO X)。圖4. PAXC-002細(xì)胞倍增時(shí)間曲線。圖5.體外測試PAXC-002細(xì)胞對吉西他濱的反應(yīng)性圖6. PAXC-002細(xì)胞的成瘤性。A. PAXC-002細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)生長曲線(腫瘤體積)；B.實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)腫瘤重量。圖7.腫瘤的病理組織切片。A.臨床上取得的腫瘤標(biāo)本(100X) ；B.裸小鼠體內(nèi)親本腫瘤(100X) ；C. PAXC-002細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)成瘤(100X)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1PAXC-002細(xì)胞的制備裸小鼠5只裸小鼠，雌性，體重16.0 士 l.Og，鼠齡5周，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。裸小鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。
從上海市長海醫(yī)院獲得新鮮的臨床胰腺癌切除標(biāo)本(女，56歲，阻塞性黃疸胰頭癌，病理診斷結(jié)果為胰頭部低至中分化導(dǎo)管腺癌)，立即浸入預(yù)冷的無菌HBSS緩沖液中 (含500U/ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml兩性霉素B)。在生物安全柜中，用新鮮的無菌HBSS緩沖液沖洗標(biāo)本，切成20 50mg的小塊，穿刺接種裸小鼠腋背部皮下。動(dòng)物接種后，健康狀態(tài)良好，行為正常。接種40天后，通過觸摸發(fā)現(xiàn)在接種部位皮下有腫瘤小結(jié)節(jié)，小結(jié)節(jié)于接種50天后開始生長明顯，至接種后80天時(shí)，腫瘤體積超過300mm3。原代培養(yǎng)皮下穿刺接種人胰腺癌80 100天后，將荷瘤裸小鼠用過量二氧化碳?xì)怏w麻醉處死，無菌解剖，取出腫瘤組織，進(jìn)行原代培養(yǎng)，方法如下用HBSS緩沖液(含 500U/ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml兩性霉素B)漂洗腫瘤組織快3次， 去除結(jié)締組織和壞死組織；用無菌手術(shù)刀片將腫瘤組織剪切成約Imm3小塊；將剪切好的組織塊用接種針?biāo)腿肱囵B(yǎng)瓶，并均勻擺置，間隔0. 5cm，蓋好瓶蓋；輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底向上，于37°C孵箱5% CO2條件下培養(yǎng)；次日，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶內(nèi)加入IOml DMEM/ F12培養(yǎng)液(含5%胎牛血清，10 μ g/ml重組人胰島素，6. 7ng/ml亞硒酸鈉，5. 5 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，2 μ g/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素 B)，靜置培養(yǎng)；原代培養(yǎng)每3天換液一次，去除已漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。傳代培養(yǎng)當(dāng)由組織塊中長出的細(xì)胞布滿培養(yǎng)瓶底部后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，具體步驟如下吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入Iml新鮮的0. 05%胰蛋白酶溶液，輕輕潤洗貼壁細(xì)胞層， 吸棄，再加入Iml新鮮的0. 05%胰蛋白酶溶液，于37°C孵箱中孵育，觀察到細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，待細(xì)胞脫落后，加入3ml新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細(xì)胞，用無菌細(xì)胞刮刀輕輕掛擦培養(yǎng)瓶表面， 收集全部細(xì)胞，離心，計(jì)數(shù)，分別接種于新的培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞傳代到第5代以后，將培養(yǎng)液逐步更換為RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，10 μ g/ml重組人胰島素，100U/ml青霉素 GUOO μ g/ml硫酸鏈霉素)，細(xì)胞生長良好，形態(tài)較為均一。傳代至50代以上。在本發(fā)明中，來源于腫瘤組織的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)細(xì)胞呈上皮樣，細(xì)胞形態(tài)較為均一，無接觸抑制，初期生長速度較為緩慢；隨著傳代次數(shù)的增加，生長速度逐步加快； 將該細(xì)胞系命名為PA)(C-002，提交保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201010。實(shí)施例2PAXC-002細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用本發(fā)明采用含有胎牛血清和胰島素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAXC-002細(xì)胞，使其能體外長期生長和穩(wěn)定傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至20代以上，細(xì)胞性狀逐漸穩(wěn)定，進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)、遺傳學(xué)和組織來源鑒定，直至第50代都具有相同的穩(wěn)定的性狀。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察與驗(yàn)證， 體外生長的PAXC-002細(xì)胞具有典型的上皮樣形態(tài)，失去接觸生長抑制，呈惡性生長。遺傳學(xué)研究證實(shí)該細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。該 PAXC-002細(xì)胞能在裸小鼠體內(nèi)形成腫瘤，具有致瘤性。該P(yáng)AXC-002細(xì)胞和其來源的臨床胰腺癌腫瘤標(biāo)本、裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤形成對應(yīng)關(guān)系，可以為研究體外、體內(nèi)和臨床抗癌藥物敏感性及耐藥性的相關(guān)性，以及胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和生物標(biāo)志物提供新的試驗(yàn)材料。具體如下a.形態(tài)學(xué)觀察將培養(yǎng)PAXC-002細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，在明視野下進(jìn)行拍照。結(jié)果見圖Ι(ΙΟΟΧ)，可見，PAXC-002細(xì)胞失去了接觸抑制，呈惡性生長，具有重疊生長的特點(diǎn)，貼
6壁生長部分呈扁平狀，以不規(guī)則鋪路石樣為主，符合上皮樣細(xì)胞的特點(diǎn)。b.染色體的鑒定將培養(yǎng)的PAXC-002細(xì)胞置于4°C孵育12小時(shí)后，加入秋水仙素，使其終濃度為 0. 4μ g/ml，再于37°C孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。采集分裂中期的細(xì)胞，用固定液進(jìn)行固定， 然后將細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的載物片上，用Giemas染色液染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)。 結(jié)果見圖2，可見，PAXC-002細(xì)胞連續(xù)傳代后，染色體仍保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，表現(xiàn)為多倍體，染色體眾數(shù)(M)集中在76 84之間，占73. 08%，存在多數(shù)中央及亞中央著絲粒染色體(圖2A，1000 X)；而小鼠細(xì)胞的染色體數(shù)2n = 40，且均為頂端著絲粒(圖 2Β，1000Χ)，據(jù)此可與人類染色體相區(qū)別?？梢娫揚(yáng)AXC-002細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。c.組織來源鑒定將PAXC-002細(xì)胞接種在蓋玻片上培養(yǎng)，待細(xì)胞伸展后，用4%甲醛固定，進(jìn)行免疫組化染色(DAB顯色法)。結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin，圖3A，200X)和CA19_9(圖 3B,200X)為強(qiáng)陽性，癌胚抗原(CEA，圖3C，200X)為弱陽性，結(jié)合病理診斷，該細(xì)胞為胰腺
癌細(xì)胞。d.細(xì)胞動(dòng)力學(xué)將PAXC-002細(xì)胞以2000/孔的密度接種在96孔板中，進(jìn)行培養(yǎng)，分別在M小時(shí)， 36小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)和96小時(shí)固定細(xì)胞，并進(jìn)行PI染色，用高內(nèi)涵細(xì)胞篩選儀Acumen 測量每孔細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，PAXC-002細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為47. 65小時(shí) (圖 4)。e.體外對吉西他濱的反應(yīng)性體外測定胰腺癌一線治療藥物吉西他濱對該細(xì)胞的生長抑制作用。將PAXC-002 細(xì)胞以6000/孔的密度(接種密度根據(jù)生長曲線確定)接種在96孔板中，給藥不同濃度的吉西他濱四天后(起始濃度20 μ M，5倍稀釋)，用Promega公司的CellTiter Glo試劑盒測定各藥物濃度下的細(xì)胞活力，經(jīng)XLFit軟件計(jì)算IC50 (半數(shù)抑制濃度)，發(fā)現(xiàn)PAXC002 的IC50值大于20 μ M(圖5Α)。而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吉西他濱在體外對胰腺癌細(xì)胞株的 IC50 一般為2到20ηΜ，和本發(fā)明人在另一株胰腺癌細(xì)胞株P(guān)AXC003(已申請專利，申請?zhí)?201010178581. X)上獲得結(jié)果類似(PAXC-003細(xì)胞接種密度為4000/孔，IC50為14. 4nM，圖 5B)。因此PAXC002細(xì)胞對吉西他濱的IC50是普通胰腺癌細(xì)胞的1000倍以上，表明PAXC002 細(xì)胞對吉西他濱高度耐藥；并且該患者在切除手術(shù)前未經(jīng)藥物治療，并且該細(xì)胞的耐藥性未經(jīng)藥物誘導(dǎo)，屬于原發(fā)性耐藥。f.細(xì)胞的成瘤性體外培養(yǎng)和收集PAXC-002細(xì)胞，皮下接種BALB/C裸小鼠(每只動(dòng)物接種5. 0 X IO6 個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液和Matrigel以1 1混合，共接種8只動(dòng)物)，每周兩次調(diào)查動(dòng)物體重和腫瘤大小。接種約10天后，腫瘤開始形成并生長。繪制腫瘤生長曲線，其中腫瘤體積=(長X 寬X寬)+2(見圖6A)。在第32天結(jié)束實(shí)驗(yàn)處死動(dòng)物，腫瘤重量為1.98g 士 0.66g(見圖 6B)。可見該P(yáng)AXC-002細(xì)胞能在裸小鼠體內(nèi)形成腫瘤，具有致瘤性。g.腫瘤的病理學(xué)鑒定將實(shí)施例1的從上海市長海醫(yī)院獲得新鮮的臨床胰腺癌切除標(biāo)本、穿刺接種于裸小鼠背部皮下90天后皮下長出的腫瘤、和上述f步驟中PAXC-002細(xì)胞在裸小鼠皮下接種 10天后形成的腫瘤，進(jìn)行石蠟包埋切片和H&E染色，結(jié)果見圖7。它們的病理診斷結(jié)果見下表1?？梢娕R床標(biāo)本、裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤和PAXC-002細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)所成腫瘤的結(jié)構(gòu)類似，形成對應(yīng)關(guān)系。表1.各腫瘤標(biāo)本的病理診斷結(jié)果
標(biāo)本名稱病理診斷結(jié)果臨床手術(shù)標(biāo)本胰頭部低至中分化導(dǎo)管腺癌(圖7A，200X )裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤胰低至中分化導(dǎo)管腺癌(圖7B，200X )PAXC-002細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)所成腫瘤胰低至中分化導(dǎo)管腺癌(圖7C，200X ) 應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種對吉西他濱耐藥的人胰腺癌細(xì)胞，其特征在于，其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :C201010o
2.如權(quán)利要求1所述的人胰腺癌細(xì)胞的子代細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的人胰腺癌細(xì)胞的用途，其特征在于，用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生胰腺癌。
4.如權(quán)利要求3所述的人胰腺癌細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是裸小鼠。
5.一種如權(quán)利要求1或2所述的人胰腺癌細(xì)胞的建立方法，其特征在于，包括以下步驟，1)獲得新鮮的臨床胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本，切成20 50mg的小塊，皮下穿刺接種哺乳動(dòng)物；2)穿刺接種80 100天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是裸小鼠。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的新鮮的臨床胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本用新鮮的HBSS緩沖液(含500U/ml青霉素G、500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml兩性霉素 B)漂洗后，再進(jìn)行皮下穿刺接種。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的原代培養(yǎng)方法包括以下步驟將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，于37°C孵箱5% CO2條件下培養(yǎng)；次日，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶內(nèi)加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含5%胎牛血清，10 μ g/ml重組人胰島素，6. 7ng/ml亞硒酸鈉，5. 5 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，2 μ g/ml乙醇胺，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素和 0. 25 μ g/ml兩性霉素B)，靜置培養(yǎng)；所述的傳代培養(yǎng)方法包括以下步驟吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的0. 05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；少量在瓶壁上變圓但沒有脫落的細(xì)胞，用無菌細(xì)胞刮刀輕輕掛擦培養(yǎng)瓶表面，收集全部細(xì)胞，離心，分別接種于新的培養(yǎng)瓶；當(dāng)細(xì)胞傳代到第五代以后，將培養(yǎng)液更換為RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，10 μ g/ml重組人胰島素，100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素B)。
9.一種篩選治療胰腺癌的候選藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟將測試化合物施用于動(dòng)物模型，施用后導(dǎo)致胰腺癌癥狀改善或治愈的測試化合物就是治療胰腺癌的候選化合物，其中所述的動(dòng)物模型具有權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的人胰腺癌細(xì)胞所導(dǎo)致的胰腺癌腫瘤。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的動(dòng)物模型是裸小鼠。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種原發(fā)性對吉西他濱(Gemcitabine)耐藥的人胰腺癌細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。該人胰腺癌細(xì)胞保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOC201010。該人胰腺癌細(xì)胞可用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生人胰腺癌，制備人胰腺癌模型，并且該細(xì)胞對胰腺癌一線治療藥物吉西他濱高度耐受，屬于原發(fā)性耐藥，可用于胰腺癌耐藥創(chuàng)分子機(jī)制研究，和篩選治療耐藥型人胰腺癌的候選藥物。本發(fā)明的人胰腺癌細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代。體外傳代自第20代至第50代性狀保持穩(wěn)定。本發(fā)明的人胰腺癌細(xì)胞系具有臨床上人胰腺癌的生物學(xué)性狀，為胰腺癌研究提供新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)生性的實(shí)驗(yàn)材料。
文檔編號C12R1/91GK102329775SQ20101022574
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者朱明華, 湯旭蓁, 秦宵然, 胡剛, 謝付波, 聞丹憶 申請人:上海睿智化學(xué)研究有限公司, 上海長海醫(yī)院