專利名稱：鴨源性冠狀病毒及其分離培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種鴨源性冠狀病毒(Avian infectiousbronchitis virus, IBV) ZZ2004 及其分離培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1937年，冠狀病毒(Coronaviruses)首先從雞身上分離出來。1965年，分離出第 一株人的冠狀病毒。由于在電子顯微鏡下可觀察到其外膜上有明顯的棒狀粒子突起，使其 形態(tài)看上去像中世紀歐洲帝王的皇冠，因此命名為“冠狀病毒”。根據(jù)病毒的血清學特點和 核苷酸序列的差異，目前冠狀病毒科分為冠狀病毒和環(huán)曲病毒兩個屬。冠狀病毒科的代表 株為禽傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。該病毒為有囊 膜、呈中等多形性球狀或橢圓形的病毒粒子，表面有桿狀突起。禽傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒科的禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的 一種常見多發(fā)的急性高度接觸性傳染病，表現(xiàn)為呼吸型、腎型、腸型、腺胃型等多種病型。該 病可感染所有日齡的雞，導(dǎo)致生長遲緩、死亡、增重和飼料報酬降低。IBV往往引起復(fù)合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可繼發(fā)細菌性疾病，如 大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重了對雞群的危害。據(jù)《世界家禽》1999年資料，全世界 的禽病中，以呼吸系統(tǒng)疾病最為嚴重，其中IB是世界大多數(shù)地區(qū)危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病。 1988年以來，IB在我國大部分地區(qū)相繼流行，疫區(qū)的發(fā)病率可達100%，死亡率可達10 30%。國內(nèi)外已報道的IBV有26種以上血清型，因血清型及新變型眾多，不同血清型之間 缺乏交叉保護，新的變異株不斷出現(xiàn)和流行，是造成雞群免疫失敗的原因。這使得IB對養(yǎng) 雞業(yè)造成的威脅持續(xù)存在。而掌握流行毒株的生物學特性和流行特點是正確使用疫苗的前 提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是分離出了一種變異程度大、對動物的感染譜更廣的鴨 源性冠狀病毒ZZ2004，并給出了其分離培養(yǎng)方法與應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是分離出一種鴨源性冠狀病毒(Avianinfectious bronchitis virus)ZZ2004，其 微生物保藏編號為CGMCC N0. 3842。上述鴨源性冠狀病毒的一種分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)在無菌條件下，采集感染IBV并發(fā)病的家禽的腎臟、支氣管、法氏囊等組織臟 器，加少量滅菌PBS緩沖液反復(fù)洗滌2 3次，研磨至乳狀再加少量滅菌PBS稀釋液；(2)分裝入凍存管，反復(fù)凍融2 4次，過濾除菌；(3)將濾液經(jīng)尿囊腔接種于9 11日齡SPF雞胚數(shù)枚，37°C培養(yǎng)72h，棄去24h 內(nèi)的死胚，無菌條件下收獲尿囊液并連續(xù)盲傳5代以上，培養(yǎng)至雞胚表現(xiàn)發(fā)育不良，呈蜷縮 胚、胚體出血；
(4)對分離毒株不同代次雞胚尿囊液做雞紅細胞凝集試驗，取病變明顯、紅細胞凝 集試驗為陰性的雞胚尿囊液；(4)對分離毒株不同代次雞胚尿囊液做雞紅細胞凝集試驗，取病變明顯紅細胞凝 集試驗為陰性的雞胚尿囊液；(5)取陰性的尿囊液用滅菌PBS作1 10稀釋，取0. 2ml接種于9日齡的SPF雞 胚絨毛尿囊腔內(nèi)，37°C孵化36 48h，置4°C下12h后收獲雞胚尿囊液即可。在上述步驟(5)之后還包括濃縮步驟取50ml上述雞胚尿囊液于滅菌的離心管3 管，5000rpm離心20min ；分別棄沉淀，取上清于另一滅菌的離心管中，12000rpm離心20min ； 分別棄沉淀，取上清加入50ml的超速離心管，不足的以滅菌PBS補足，40000rpm離心4小 時；棄上清液，取沉淀以Iml滅菌PBS懸浮后_20°C保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鲽喸葱怨跔畈《驹谥苽銲BV疫苗中的應(yīng)用。鴨源性冠狀病毒ZZ2004可用于制備滅活疫苗、弱毒疫苗、活載體疫苗等常規(guī)疫 苗，也可以其Sl、M、N基因的真核表達質(zhì)粒pIBVSl、pIBVM、pIBVN，制備IBV質(zhì)粒DNA疫苗、 脂質(zhì)體/DNA疫苗、殼聚糖/DNA疫苗等。上述鴨源性冠狀病毒在制備防治雞傳染性支氣管炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明具有積極有益的效果此前還未有關(guān)家鴨感染IBV的報道，本病毒(鴨源性冠狀病毒ZZ2004)分離株來 源于雞鴨混養(yǎng)的養(yǎng)殖場，本病毒不僅可以引起雞的大批發(fā)病及死亡，還可嚴重影響家鴨的 生長發(fā)育，同時引起部分鴨的死亡；本病毒的與其它禽類的冠狀病毒相比，其變異程度大， 對動物的感染譜更廣，開展對本病毒分離株的研究，對于揭示IBV變異規(guī)律，區(qū)分不同的血 清型，制備出防治雞傳染性支氣管炎的新型IBV疫苗與藥物，進而徹底防治IBV有著重要的
眉、ο本發(fā)明所述鴨源性冠狀病毒(Avianinfectious bronchitis virus, IBV) ZZ2004，已于2010年4月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其 簡稱為CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，該鴨源 性冠狀病毒的保藏編號為CGMCC NO. 3842。


圖1為IBV ZZ2004株接種10日齡SPF雞胚于18日齡觀察到的結(jié)果，圖中a 接 毒雞胚，b 對照雞胚。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護內(nèi)容并不局限于下述具 體實施例。下述實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的 試驗材料，如無特別說明，均購自常規(guī)生化試劑商店。實施例1病毒分離培養(yǎng)2004年5月，河南省鄭州某養(yǎng)殖場發(fā)生了以腹瀉和生長遲緩為主要癥狀的疑似IB 疾病，感染雞主要表現(xiàn)精神沉郁，下痢，生長緩慢及抵抗力下降，發(fā)病率為100%，死亡率達 10%以上，感染雞群的生產(chǎn)性能顯著降低。調(diào)查中顯示，與雞舍相距僅150m左右處有一個1700只的肉鴨群，在第一批雞發(fā)病前約10天左右鴨群發(fā)生過類似癥狀的疾病，但沒有造成 大量死亡。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落，腺胃乳頭腫 大、粘膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈“花斑腎”， 肺臟無明顯變化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌 及肝臟出血為主要特征。在同地區(qū)的其他雞場也發(fā)生了同樣癥狀的疾病，雖然經(jīng)過多種IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學院動物科學學院預(yù)防獸醫(yī)學實驗室隨即開 展了此種病毒的分離培養(yǎng)研究，在無菌條件下，采集發(fā)病鴨的腎臟等組織，加少量滅菌PBS 緩沖液反復(fù)洗滌2 3次，研磨至乳狀再加少量滅菌PBS緩沖液，分裝入凍存管，反復(fù)凍融 3次(_701/30°0，用0. 22 μ m —次性濾器過濾除菌，將濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞 胚5枚，37 °C培養(yǎng)72h (棄去24h內(nèi)的死胚)，無菌收獲尿囊液并連續(xù)盲傳5代以上，至雞胚 表現(xiàn)發(fā)育不良，呈蜷縮胚、胚體出血等。對分離毒株不同代次雞胚尿囊液做雞紅細胞凝集試 驗。取病變明顯紅細胞凝集試驗為陰性的雞胚尿囊液做試驗用種毒。結(jié)果從發(fā)病鴨體內(nèi)分 離到一株新病毒，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株。實施例2病毒鑒定(1)雞胚半數(shù)致死量(ELD5tl)測定將上述所得種子毒(鴨源性冠狀病毒ZZ2004)按10倍遞增稀釋，取10_3 10_7 的稀釋液接種雞胚，每個稀釋度接種5枚9 11日齡SPF雞胚，37°C培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死 亡雞胚，每天觀察記錄死胚數(shù)，觀察至18胚齡。按Reed-Muench方法計算ELD5tl (Reed and Muench,1938)。(2)病毒 ΖΖ2004 株的 RT-PCR 鑒定設(shè)計引物序列如下上游引物5 ‘ -GACCGCTTGTCAAGCAAATT-3 ‘，下游引物 5' -TGAGTACTAAGAGTGCAATT-3‘。ΖΖ2004株的濃縮方法取ΖΖ2004株感染的尿囊液用滅菌PBS作1 10稀釋，取0. 2ml接種于9日齡的 SPF雞胚絨毛尿囊腔內(nèi)，37°C孵化36 48h，置4°C 12h后收獲雞胚尿囊液。分別取50ml ZZ2004株感染的SPF雞胚尿囊液于滅菌的離心管3管，5000rpm離心 20min ；分別棄沉淀，取上清液于另一滅菌的離心管中，12000rpm離心20min ；分別棄沉淀， 取上清加入50ml的超速離心管，不足的以滅菌PBS補足，40000rpm離心4小時；棄上清，取 沉淀用Iml滅菌PBS懸浮后_20°C保存?zhèn)溆?。ZZ2004 株總 RNA 的提取用 DNA/RNA 提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/ DNAExtraction Kit Ver. 3. 0)提取RNA，參照試劑盒說明書進行。ZZ2004株基因片段的RT-PCR擴增①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在0. 2ml Microtube管中配制下列混合液(表1)，同時設(shè)空白對照。表1模板RNA/引物等的混合液制備
5

在PCR儀上進行變性、退火反應(yīng)65°C 5min，4°C保存。 離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底t 在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，如表2所示。 表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
在PCR儀上按下列反應(yīng)條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 300C IOmin,42°C 30min，95°C 5min，4°C保存。 ②PCR反應(yīng)
按下列組成在Microtube管中配制PCR反應(yīng)液(表3)，同時設(shè)空白對照 表3PCR反應(yīng)液
10XPCR Buffer II5μ L
dNTP Mixture (IOmM each)2 μ L
上游引物IuL
下游引物IuL
TaKaRa Ex Taq HS (5u/ul)0. 5 μ L
上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液4. 5 μ L 瞬時離心后，置PCR儀上擴增。反應(yīng)條件為94°C，5min ;94°C lmin，55°C lmin， 72°C lmin，共35個循環(huán)，最后于72°C延伸lOmin，反應(yīng)產(chǎn)物與pMD_18_T連接。結(jié)果ZZ2004株病毒接種SPF雞胚后出現(xiàn)明顯的蜷縮胚，見圖3，故命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株。毒價測定結(jié)果ELD5tl = 10_5_670. 2ml實施例3病毒的理化試驗(1)病毒對乙醚及氯仿的敏感性試驗①病毒對20%乙醚的敏感性試驗取ZZ2004病毒800ul于一無菌印管中，加入 200ul乙醚，置4°C冰箱中處理18 24h，不時充分震蕩，后經(jīng)4°C 2500rpm離心20min，取 下層液體反復(fù)吹打使乙醚揮發(fā)干凈。用無菌生理鹽水稀釋測定其EID5tl，同時設(shè)病毒對照組。 試驗結(jié)果見表4。②病毒對0. 5%氯仿敏感性試驗取CSISV病毒995ul于一無菌印管中，加入5ul 氯仿，置4°C冰箱中處理20min，不時充分震蕩，后經(jīng)4°C下2500rpm離心20min，取上層液體 用無菌生理鹽水稀釋測定其EID5tl，同時設(shè)病毒對照組。試驗結(jié)果見表4。(2)病毒對溫度敏感性試驗取1ml CSISV病毒于一無菌印管中，置56°C水浴中感作30min，用無菌生理鹽水 稀釋測定其EID5tl，同時設(shè)病毒對照組。用無菌生理鹽水將CSISV病毒稀釋成IOOEID5q分裝于印管中，分別置60°C、70°C、 80 V、90 V水浴中感作30min，分別接種10枚10日齡SPF雞胚，0. 2ml/枚，37 °C孵化培養(yǎng)， 每日照蛋1次，記錄死亡胚數(shù)量，棄去24h內(nèi)死亡胚，直至18日齡。18日齡時全部打開剩余 雞胚，觀察雞胚矮化數(shù)量，同時設(shè)同劑量病毒對照組及生理鹽水對照組各10枚。試驗結(jié)果 見表5。(3)病毒對酸堿敏感性試驗①病毒對酸敏感性試驗取IOmLCSISV病毒懸液3000r/min離心20min后，將上清液等量分裝于7個小試管 里，每個小試管里2mL。用lmol/L HCl將其中3個小試管中病毒液的pH值分別調(diào)至3. 0、 2. 5和2. 0，同時用lmol/L HCl將同樣的滅菌生理鹽水的pH值分別調(diào)至3. 0,2. 5和2. 0作 為對照。置37°C恒溫水浴鍋中水浴2h，再用5. 6% NaHCO3溶液將pH值調(diào)至7. 2左右。將 樣品和對照液梯度稀釋至10_2，IO-3……ΙΟ"70然后分別接種6枚10日齡SPF雞胚，0.2mL/ 枚。37°C孵化，棄去24h內(nèi)死亡胚，每24h照蛋1次，記錄死亡胚，直至18日齡時全部打開 雞胚，觀察雞胚矮化數(shù)量。同時設(shè)病毒對照組，重復(fù)三次，以病毒毒力(EID5tl)下降滴度和病 毒是否滅活為評價標準。試驗結(jié)果見表6。②病毒對堿敏感性試驗取IOmL CSISV病毒懸液3000r/min離心20min后，將上清液等量分裝于7個小試 管里，每個小試管里2mL，用lmol/L NaOH將其中3個小試管中病毒液的pH值調(diào)至10. 0、 11. 0和11. 5。并用lmol/L NaOH將同樣滅菌生理鹽水的pH值調(diào)至11和11. 5作為對照。 置37°C恒溫水浴鍋中感作2h，再用lmol/L HCl溶液將pH值調(diào)至7. 2左右。將樣品和對照 液梯度稀釋至ΙΟ"2,10_3……ΙΟ"70然后分別接種6枚10日齡SPF雞胚，0. 2mL/枚。37°C孵 化，棄去24h內(nèi)死亡胚，每24h照蛋1次，記錄死亡胚，直至18日齡時全部打開雞胚，觀察雞 胚矮化數(shù)量。同時設(shè)病毒對照組，重復(fù)三次，以滅活率達到99. 9%以上作為判定完全滅活的 標準。試驗結(jié)果見表6。表4 ZZ2004理化特性結(jié)果 表5 ZZ2004對溫度的敏感性

注感染胚包括死亡胚和矮化胚表6 ZZ2004經(jīng)酸堿處理后EID5tl測定結(jié)果 實施例4 IBV ZZ2004株病毒對SPF雞的致病性取2日齡的SPF雞隨機分為兩組，其中試驗組30只(公母各半，I組)，對照組20 只(公母各半，II組)，I組用ZZ2004株雞胚尿囊毒經(jīng)滴鼻接種，劑量106ELD5(l/0. 5ml/只。 II組用滅菌生理鹽水作同樣處理。感染后定期觀察雞群發(fā)病以及致死情況，發(fā)病雞觀察其 發(fā)病癥狀，致死雞進行剖檢觀察并記錄器官病變，分析死亡原因。收集試驗組和對照組雞的 肝、脾、肺、法氏囊及腎等用于組織學觀察及RT-PCR檢測。感染后于25d對實驗組及對照組 雞逐只稱重，試驗結(jié)果見表7、表8。表7人工感染ZZ2004株后SPF雞的發(fā)病情況 表8人工感染ZZ2004株后25日齡SPF雞的體重情況1日齡(克)
25日齡(克)增重率(％)
SPF雞試驗組 SPF雞對照組 差異率(%)
45. 50±1.87 45. 33+ 1.94 -0. 37 > 0. 05
161.83±5.67255.7
253. 67±4. 05459.6 36.2 <0.01注差異率(％)=[(對照組平均體重-實驗組平均體重對照組平均體 重]X100%實施例5 IBV ZZ2004主要的特異性蛋白的氨基酸序列同源性比對IBV粒子含有3種特異性蛋白，即核衣殼蛋白(N)，膜蛋白(M)和纖突蛋白(S) ；S 蛋白位于病毒粒子表面，由等摩爾的Sl和S2兩個亞單位組成。S蛋白是IBV最重要的保 護性抗原，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，在病毒吸附細胞過程中發(fā)揮作用，在血清學分類上起 決定性作用。IBV ORFla蛋白基因編碼IBV非結(jié)構(gòu)蛋白，其相應(yīng)表達的產(chǎn)物大小為440KD， 根據(jù)普遍存在于冠狀病毒的核糖體移碼規(guī)律，Ia與Ib蛋白基因共同表達一個約741KD的 Ia Ib的融合多肽，后經(jīng)細胞內(nèi)蛋白酶裂解為相應(yīng)功能的蛋白。用DNAstar軟件將IBV ZZ2004毒株M基因推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank登錄的 7個參考毒株比較結(jié)果表明ZZ2004毒株M基因氨基酸推導(dǎo)序列與參考毒株同源率分別為 93. 9 91. 1% ；ZZ2004毒株M蛋白與經(jīng)典毒株Beaudette株比較其變異區(qū)域主要集中在 3 16aa，211 222aa兩個區(qū)域內(nèi)，其他區(qū)域仍存在部分散在的點突變；與同源率最高的 SAIBK株比較，其變異區(qū)段主要集中在3 17aa區(qū)域，其他區(qū)域還有一些散在的點突變。IBV ZZ2004毒株Sl蛋白的氨基酸序列與6個參考毒株的同源率介于73. 7% 85. 9%之間，其裂解位點的氨基酸序列為RRHRR，明顯不同于其他參考毒株(RRF/SRR)；與 經(jīng)典毒株Beaudette株比較其變異區(qū)域主要集中在3 26aa，53 57aa，62 81aa，88 136aa, 199 209aa，270 294aa，382 395aa，487 538aa等區(qū)域內(nèi)，其他區(qū)域仍存在較 多散在的點突變；與同源率最高的SAIBK株比較，其變異區(qū)段主要集中在23 25aa，62 82aa，89 131aa，175 202aa，455 538aa等區(qū)域，其他區(qū)域還有一些散在的點突變，而 大多數(shù)變異位于前4個區(qū)域內(nèi)，即在前300個氨基酸殘基內(nèi)，這符合IBV Sl基因變異的特 征。IBV ZZ2004株Ia基因與IBV參考毒株比較同源率在85. 6% 93. 1%。與經(jīng)典毒 株Beaudette株比較，其變異區(qū)段主要集中在698 703nt，1079 llOOnt，1220 1233nt， 1730 2254nt，2900 2930nt，2944 2948nt，3231 3542nt，3840 3865nt，3970 3991nt，4988 4996nt，5370 5412nt，5503 5520nt，7325 7400nt 等區(qū)域，其他區(qū) 域仍有很多散在的點突變；與同源率最高的SAIBK株比較，其變異區(qū)段主要集中在2888 2889nt,2911 2942nt，3280 3300nt，7918 7919nt，7930 7980nt，9907 9927nt， 9941 9943nt等區(qū)域，其他區(qū)域還有一些散在的點突變。用DNAstar軟件將IBV ZZ2004毒株N基因推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank登錄的 7個參考毒株比較結(jié)果表明ZZ2004毒株N基因氨基酸推導(dǎo)序列與參考毒株同源率分別為 98. 5 90. ；分離株N蛋白與經(jīng)典毒株Beaudette株比較其變異區(qū)域主要集中在5 8aa, 184 202aa，220 247aa，322 336aa等區(qū)域內(nèi)，其他區(qū)域還存在部分散在的點突變。
9
權(quán)利要求
一種鴨源性冠狀病毒(Avian infectious bronchitis virus)ZZ2004，其微生物保藏編號為CGMCC NO.3842。
2.權(quán)利要求1所述的鴨源性冠狀病毒的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)在無菌條件下，采集感染所述IBV并發(fā)病的家禽的腎臟組織lg，加3 5ml滅菌 PBS緩沖液反復(fù)洗滌2 3次，研磨至乳狀再加3 5ml滅菌PBS緩沖液；(2)分裝入凍存管，反復(fù)凍融2 4次，過濾除菌；(3)將濾液經(jīng)尿囊腔接種于9 11日齡SPF雞胚數(shù)枚，37°C培養(yǎng)72h，棄去24h內(nèi)的死 胚，無菌條件下收獲尿囊液并連續(xù)盲傳5代以上，培養(yǎng)至雞胚表現(xiàn)發(fā)育不良，呈蜷縮胚、胚 體出血；(4)對分離毒株不同代次雞胚尿囊液做雞紅細胞凝集試驗，取病變明顯紅細胞凝集試 驗為陰性的雞胚尿囊液；(5)取陰性的尿囊液用滅菌PBS作1 10稀釋，取0.2ml接種于9日齡的SPF雞胚絨 毛尿囊腔內(nèi)，37°C孵化36 48h，置4°C下12h后收獲雞胚尿囊液即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨源性冠狀病毒的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步 驟(5)之后還包括濃縮步驟取50ml上述雞胚尿囊液于滅菌的離心管3管，5000rpm離心 20min;分別棄沉淀，取上清液于另一滅菌的離心管中，12000rpm離心20min ；分別棄沉淀， 取上清液加入50ml的超速離心管，不足的以滅菌PBS補足，40000rpm離心4小時；棄上清 液，取沉淀以Iml滅菌PBS懸浮后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.權(quán)利要求1所述鴨源性冠狀病毒在制備防治雞傳染性支氣管炎疫苗中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述鴨源性冠狀病毒在制備防治雞傳染性支氣管炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及鴨源性冠狀病毒ZZ2004及其分離培養(yǎng)方法與應(yīng)用。其微生物保藏編號為CGMCC No.3842；其分離培養(yǎng)方法無菌條件下采集感染發(fā)病的家禽腎臟，加滅菌PBS反復(fù)洗滌后，研磨至乳狀再加滅菌PBS稀釋液后，分裝入凍存管，反復(fù)凍融數(shù)次，過濾除菌，將濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)72h，收獲尿囊液并連續(xù)盲傳5代以上，取紅細胞凝集試驗為陰性的雞胚尿囊液。本病毒分離株來源于雞鴨混養(yǎng)的養(yǎng)殖場，與其它禽類的冠狀病毒相比，其變異程度大，對動物的感染譜更廣，本病毒的發(fā)現(xiàn)與研究對于揭示IBV變異規(guī)律，區(qū)分不同的血清型，制備出防治雞傳染性支氣管炎的新型IBV疫苗與藥物，有著重要的意義。
文檔編號C12N7/00GK101906404SQ20101022557
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者劉興友, 劉金華, 姚四新, 王麗榮, 王憲文, 王自良, 趙坤, 趙樸, 趙淑秋, 陳仕鈞 申請人:河南科技學院