專利名稱：一種提高無錫他汀產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)無錫他汀的方法，尤其是一種采用分階段PH控制提高無錫 他汀產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，目前高血脂和冠心病患者數(shù)量不斷增加。 心血管疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率始終居高不 下，接近世界人口總死亡的1/4，是人類健康的頭號(hào)殺手。他汀類藥物屬于羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，為降脂藥物中的 首選藥物，也是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)在專利號(hào)為=200410044893. 6，專利名稱為 一種擬無枝酸菌及其生物轉(zhuǎn)化洛伐他汀為無錫他汀的技術(shù)中公開了一種生產(chǎn)無錫他汀的 方法，無錫他汀由洛伐他汀經(jīng)擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.) CGMCC NO. 1149轉(zhuǎn)化產(chǎn)生， 其抑制作用為洛伐他汀的4倍，是一種新型高效HMG-CoA還原酶抑制劑。現(xiàn)有的發(fā)酵方法是將靜置培養(yǎng)48h的種子液接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中進(jìn)行菌體培養(yǎng)， 48h后加入洛伐他汀至發(fā)酵結(jié)束。轉(zhuǎn)化條件自始至終保持不變，最終的底物轉(zhuǎn)化率不高。本 發(fā)明通過兩階段PH控制，提高了無錫他汀的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高無錫他汀產(chǎn)量的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為以擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 1149)為生產(chǎn)菌株，通 過兩階段PH控制，提高無錫他汀的產(chǎn)量。所述兩階段控制包括階段一 pH為7. 0-7. 5 ；階段二 pH為5. 5-6. O。階段一的發(fā)酵條件為按0. 8g/L-l. 5g/L的濃度向轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液加入洛伐他汀溶 液，30°C發(fā)酵20h生成產(chǎn)物I。階段一最佳pH為7. 5。階段二的發(fā)酵條件為按0. 3/L-O. 6g/L的濃度向轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液加入產(chǎn)物I，30°C發(fā) 酵15h生成無錫他汀。階段二最佳pH為5. 5。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液的制備以10%接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床150r/min， 30°C培養(yǎng) 48h。所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為(g/L)可溶性淀粉50，Hycase SF 2，玉米漿5，去離子水 1000mL。無錫他汀含量檢測(cè)方法將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液離心，微膜過濾后利用HPLC監(jiān)測(cè)樣 品，將無錫他汀峰的峰面積代入已有公式(利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得)含量計(jì)算公式
產(chǎn)物含量=峰面積*樣品稀釋倍數(shù)*10_6/34. 606 (g/L)本發(fā)明提出了酵生產(chǎn)無錫他汀的方法，通過兩階段pH控制，使無錫他汀的轉(zhuǎn)化率 提高了 16%，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1洛伐他汀生物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物I及無錫他汀的轉(zhuǎn)化途徑示意圖；A 洛伐他汀 B:產(chǎn)物I C:無錫他汀
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將斜面擬無枝酸菌Amycolatopsi sp. CGMCC NO. 1149接到種子培養(yǎng)基(250mL三 角瓶裝50mL)中，28°C靜止培養(yǎng)48h。種子液通過兩層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收集 的濾液為孢子種子液。按10%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，回轉(zhuǎn)式搖床150r/min，3(TC培養(yǎng) 48h制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液。調(diào)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液pH為7. 5，按0. 8g/L的濃度向轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中加入洛伐 他汀溶液，轉(zhuǎn)化20h后將發(fā)酵液在4°C下SOOOrpm離心，取上清液。將大孔吸附樹脂以適量的95%乙醇充分浸泡24h后，用95%乙醇沖洗至流出液 加水(1 5)不呈渾濁，然后用蒸餾水洗至無醇味。再依次用2% NaOH溶液、蒸餾水、5% HCl溶液沖洗，最后用蒸餾水沖洗至中性，保持分離使用前的狀態(tài)。填料裝柱后，先將上清液 以1. 5BV/h的流速上樣進(jìn)柱，而洗脫流速為0. 8BV/h。先用清水洗去樣液中的大部分色素， 再以甲醇含量分別為10%，30%，50%的洗脫液洗去部分雜質(zhì)，而產(chǎn)物I集中在甲醇含量為 60%-70%的洗脫液中，含產(chǎn)物I的洗脫液為無色，其回收率達(dá)70%。發(fā)酵液中殘留的洛伐 他汀則將在甲醇含量達(dá)到90%以上時(shí)才會(huì)被大量洗脫下來。因此收集甲醇含量為60-70% 的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得產(chǎn)物I的濃縮液，并微孔過濾除菌備用。調(diào)新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液pH至5. 5，按0. 3g/L的濃度加入提純的產(chǎn)物I，發(fā)酵15h。種子培養(yǎng)基組成為(g/L)=KNO3I,無水 K2PO4O. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5， FeSO4 · 7H20 0. 01，可溶性淀粉 20，去離子水 lOOOmL，pH 7. 2-7. 4。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為(g/L)可溶性淀粉50，Hycase SF 2，玉米漿5，去離子水 lOOOmL。無錫他汀含量檢測(cè)方法將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液離心，微膜過濾后利用HPLC監(jiān)測(cè)樣 品，將無錫他汀峰的峰面積代入已有公式(利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得)。含量計(jì)算公式產(chǎn)物含量=峰面積*樣品稀釋倍數(shù)*10_6/34. 606 (g/L)發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對(duì)比技術(shù)方法提高了 16%。對(duì)比技術(shù)方案為專利號(hào)為200410044893. 6中公布的技術(shù)方案，其采取恒定pH單 階段發(fā)酵，無錫他汀產(chǎn)量低，耗時(shí)長(zhǎng)。實(shí)施例2階段一 pH為7. 0，按，按1. 5g/L的濃度加入洛伐他汀溶液。階段二 pH為5. 5，按0. 6g/L的濃度加入提純的產(chǎn)物I。其他條件同實(shí)施例1，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對(duì)比技術(shù)方法提
4高了 15%。實(shí)施例3階段一 pH為7. 5，按1. 2g/L的濃度加入洛伐他汀溶液。階段二 pH為6. 0，按0. 6g/L的濃度加入提純的產(chǎn)物I。其他條件同實(shí)施例1，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對(duì)比技術(shù)方法提 高了 13%。實(shí)施例4將斜面擬無枝酸菌Amycolatopsis sp. CGMCC NO. 1149接到種子培養(yǎng)基(250mL三 角瓶裝50mL)中，28°C靜止培養(yǎng)48h。種子液通過兩層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收 集的濾液為孢子種子液。按10%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床150r/min，3(TC 培養(yǎng)48h，制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液。調(diào)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液pH至7. 5，按0. 8g/L的濃度加入洛伐他汀溶液， 轉(zhuǎn)化20h后將發(fā)酵液在4°C下SOOOrpm離心，濃縮上清液。調(diào)新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液pH至5. 5，按 0. 5g/L產(chǎn)物I濃度加入濃縮后的發(fā)酵液，發(fā)酵15h。種子培養(yǎng)基組成同實(shí)施例1。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為同實(shí)施例1。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對(duì)比技術(shù)方法提高了 10%。對(duì)比技術(shù)方案如實(shí)施例1所述。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于以擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1149)為生產(chǎn)菌株，通過兩階段pH控制，提高無錫他汀的產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于所述兩階段控制包 括階段一 PH 為 7. 0-7. 5 ；階段二 pH 為 5. 5-6. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于階段一的發(fā)酵條件 為活化擬無枝酸菌，制備轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液，按0. 8g/L-l. 5g/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30°C 發(fā)酵20h生成產(chǎn)物I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于階段一最佳pH為7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于階段二的發(fā)酵條件 為向新鮮制備的擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中，按0. 3g/L-0. 6g/L產(chǎn)物I的濃度加入階段一發(fā) 酵液或提純物，30°C發(fā)酵15h生成無錫他汀。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，其特征在于階段二最佳pH為5 · 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明以擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1149)為生產(chǎn)菌株，通過兩階段pH控制，優(yōu)化發(fā)酵條件，使無錫他汀的產(chǎn)量提高了16％，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101906446SQ201010225950
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者方慧英, 牟琳, 諸葛健, 諸葛斌 申請(qǐng)人:江南大學(xué)