專利名稱：與肝細(xì)胞癌發(fā)生相關(guān)的1p36.22區(qū)域的多態(tài)性的檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞癌Ofepatocellular carcinoma, HCC)的人群預(yù)防中的個(gè)體易感性及其遺傳學(xué)檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及與HBV相關(guān)HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的易感基因組區(qū)域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的rsl7401966基因型的檢測方法；本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述易感基因組區(qū)域基因型的檢測試劑盒；另外，本發(fā)明還涉及上述易感基因組區(qū)域、相關(guān)檢測方法和檢測試劑盒在HCC的預(yù)防和控制以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
HCC是最常見的癌癥之一，居全球癌癥死亡原因的第五位。HCC很少能夠在早期得到診斷，并且通常在確診后的幾個(gè)月內(nèi)死亡。據(jù)估計(jì)，全世界每年有超過50萬新發(fā)HCC病例 1O HCC的發(fā)病率與致病因素在不同地區(qū)存在顯著差別2’3。盡管在歐洲、北美和日本，與慢性丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)感染相關(guān)的HCC的發(fā)病率越來越高，但在全球范圍內(nèi)慢性乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)感染仍是HCC發(fā)生的最重要的原因。尤其是在中國和非洲等高度流行的地區(qū)，慢性HBV感染導(dǎo)致至少80%的HCC病例2。然而，只有一小部分慢性HBV攜帶者在其一生中發(fā)生HCC4。和其他常見的癌癥一樣，慢性HBV攜帶者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)在不同個(gè)體之間存在差異，這種差異也是由遺傳和環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用而導(dǎo)致的5。針對(duì)HBV相關(guān)的HCC進(jìn)行的分離分析(Segregation analysis)提示了這一惡性腫瘤的多基因遺傳背景6’7。與連鎖研究策略相比，基于候選基因的病例_對(duì)照關(guān)聯(lián)研究對(duì)鑒定新的易感基因位點(diǎn)具有更大的效能。這種研究已經(jīng)鑒定了與HBV相關(guān)HCC 的多個(gè)易感基因(如ESR1)及遺傳變異位點(diǎn)8’9。但是，總體而言，鑒定與HCC的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的易感基因的進(jìn)展仍然十分緩慢。1ρ36區(qū)域發(fā)生雜合缺失(Loss of heterozygosity, L0H)的現(xiàn)象在人類惡性腫瘤包括HCC中廣泛存在12_14。值得關(guān)注的是，新近一項(xiàng)研究提示1ρ36. 21-36. 32發(fā)生的LOH 可能是肝癌致病機(jī)制中的早期事件，提示在此區(qū)域存在潛在的抑癌基因14。特別地，在包含 UBE4B-KIF1B-PGD 的 1ρ36. 22 區(qū)域，發(fā)明人運(yùn)用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)的方法檢測了其蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與配對(duì)HCC組織相比，癌旁非腫瘤肝組織中總KIFlB(包括KIFlB α和KIFlBP )、KIFlBa和P⑶的表達(dá)水平更高(η = 20例，Wilcox P值分別為 0. 0020,0. 046和0. 0039)。而且，在癌旁非腫瘤肝組織中，與rsl7401966AA攜帶者相比，G等位攜帶者總KIFlB表達(dá)水平更高(P = 0.0084)。此外，發(fā)明人在67例無關(guān)個(gè)體來源的EBV 轉(zhuǎn)化外周血淋巴細(xì)胞中，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法檢測KIFlBii的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果清楚表明在G等位攜帶者中，KIFlBii轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(P = 3.7X10_4)?？偟恼f來， 這些結(jié)果與早先報(bào)道的KIFlB β作為潛在的抑癌基因是一致的，且包含UBE4B-KIF1B-P⑶ 的1ρ36. 22區(qū)域可能在HBV相關(guān)HCC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。但是，目前尚沒有基因組區(qū)域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態(tài)性與HBV相關(guān)HCC 發(fā)生的易感性之間存在相關(guān)性的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，提供一種HBV相關(guān)HCC的易感基因、易感多態(tài)性位點(diǎn)、多態(tài)性位點(diǎn)的檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用。通過基于病例對(duì)照人群和核心家系的大樣本遺傳關(guān)聯(lián)研究以及大量的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)判明，與在基因組1ρ36. 22區(qū)域(UBE4B-KIF1B-P⑶)攜帶rsl7401966G等位的慢性HBV 攜帶者相比，攜帶rsl7401966A等位的慢性HBV攜帶者更易罹患HCC ；與攜帶rsl7401966GG 基因型的慢性HBV攜帶者相比，攜帶AA或AG基因型的慢性HBV攜帶者更易罹患HCC。因此本發(fā)明鑒定了一個(gè)與HBV相關(guān)HCC發(fā)生關(guān)聯(lián)的新的易感基因組區(qū)域、易感等位和易感基因型，該易感基因組區(qū)域1ρ36. 22包括但不限于UBE4B、KIF1B、P⑶等易感基因。本發(fā)明還提供了一種檢測與HBV相關(guān)HCC發(fā)生關(guān)聯(lián)的易感多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966 的方法，該方法包括但不限于SNPstream分型或TaqMan分型等。本發(fā)明還提供了一種通過檢測rsl7401966多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來判斷個(gè)體對(duì) HCC是否易感的方法。本發(fā)明還提供了用于檢測多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的引物和探針。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測與HBV相關(guān)HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的rsl7401966的試劑盒，以及上述試劑盒在人群中預(yù)防與控制HCC的應(yīng)用。一、如上所述，本發(fā)明提供了檢測與HCC易感性關(guān)聯(lián)的1ρ36. 22區(qū)域 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的方法，該方法包括但不限于SNPstream分型和TaqMan分型等方法。1、SNPstream分型，包括如下步驟，其特征在于對(duì)rsl7401966進(jìn)行基因型判別1)對(duì)包含多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因組區(qū)域，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物；2)用1)中的特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；3)以1)中的特異性延伸引物在每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行延伸反應(yīng)，生成特異性的延伸產(chǎn)物；4)延伸產(chǎn)物與檢測板雜交，掃描成像并生成基因型。2、TaqMan分型，包括如下步驟，其特征在于對(duì)rsl7401966進(jìn)行基因型判別1)對(duì)包含多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因組區(qū)域，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物對(duì)和探針；2)用1)中的特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)熒光探針?biāo)a(chǎn)生信號(hào)的不同即可得知rsl7401966的基因型。二、本發(fā)明還提供了與HBV相關(guān)HCC發(fā)生關(guān)聯(lián)的易感等位和易感基因型，即 1ρ36. 22區(qū)域(UBE4B-KIF1B-P⑶)多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966A等位為HCC的易感等位，AA或 AG為HCC的易感基因型。并提供了通過檢測rsl7401966來判定人群或個(gè)體對(duì)HCC發(fā)生的易感性的方法。該方法包括但不限于SNPstream分型或TaqMan分型等。其特征在于1、針對(duì)樣本基因組DNA，采用SNPstream分型或TaqMan分型的方法判定 rsl7401966的基因型；2、當(dāng)某一個(gè)體的rsl7401966表現(xiàn)為AG基因型或AA基因型(即攜帶1個(gè)或2個(gè)A等位)，則表明該個(gè)體患HCC的可能性更高。三、本發(fā)明還提供了檢測多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966基因型的特異性引物和探針的序列，其特征在于能夠特異性地?cái)U(kuò)增出包含rsl7401966的DNA片段，并準(zhǔn)確鑒定rsl7401966的基因型。正反向引物序列根據(jù)序列互補(bǔ)的原則在待檢測多態(tài)性位點(diǎn) (rsl7401966)的上下游設(shè)計(jì)，一般而言，引物長度為20bp左右，所擴(kuò)增的目的片段(包含 rsl7401966)的長度為IOObp左右。設(shè)計(jì)軟件包括但不限于autoprimer或primer3等。優(yōu)選地，引物和探針序列為SNPstream 分型正向引物5‘ -CTTCAGCCTCATTTTTTTTTTATAC-3 ‘反向引物5,-TTCCCTGCTTTGAAAATTTG-3 ‘延伸引物5'-GTGATTCTGTACGTGTCGCCAAACACATAGTGCCTCTATGAGTCC-3'TaqMan 分型正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，
反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，MGB 探針 1:5' (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘MGB 探針 2:5' (HEX) -TATGAGTCCGTATTGAGT-3 ‘四、本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測與HBV相關(guān)HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的易感基因組區(qū)域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的試劑盒，其特征在于裝有一個(gè)或多個(gè)容器，容器內(nèi)裝有用以檢測多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966基因型的一種或多種組分。與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府食品與藥品監(jiān)督管理部門審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售方面的信息。以基于TaqMan分型方法檢測rsl7401966的試劑盒為例，在DNA的PCR 擴(kuò)增方法實(shí)施中，檢測樣品的多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因型的試劑盒，含有PCR的引物對(duì)和探針(正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，，反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，，MGB 探針 1 5 ‘ (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘，MGB 探針 2 5 ‘ (HEX) -TATGAGTCCGTATTGAGT-3 ‘)，以及用于 PCR 反應(yīng)的包含 dNTPs 和 DNA 聚合酶在內(nèi)的預(yù)混緩沖液等。使用方法說明如下對(duì)樣品基因組DNA，用本發(fā)明提供的引物和探針，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增5μ 1反應(yīng)體系為IOng/μ 1基因組DNA 1 μ 1，20 μ M的上下游引物各0. 25 μ 1， ΙΟμΜ 的探針各 0. 125μ 1，以及 2. 5μ 1 2Χ 預(yù)混緩沖液(Applied Biosystems TaqMan Genotyping MasterMix ；包括 dNTP 及 Taq DNA 聚合酶)。PCR 條件為50°C 2 分鐘；95°C 10 分鐘；950C 15秒和60°C 1分鐘,共計(jì)40循環(huán)。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀上完成，并即時(shí)得到基因型。具體見實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上所列分型方法及試劑盒的組分僅是示意性的，可包括發(fā)明內(nèi)容1-3中任一項(xiàng)提到芯片、雜交板、引物、探針、dNTPs、各種酶制劑及各種緩沖液及其它溶液的一種或多種。 五、本發(fā)明還提供了與HBV相關(guān)HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的易感基因組區(qū)域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966基因型的檢測方法及其在HBV相關(guān)HCC人群預(yù)防和控制中的應(yīng)用。例如，由于本發(fā)明證實(shí)了 rsl7401966基因型與HBV相關(guān)HCC發(fā)生的易感性存在關(guān)聯(lián)，因此，在HBV相關(guān)HCC人群的預(yù)防和控制中，就需要對(duì)所咨詢的對(duì)象開展rsl7401966基因型的檢測，以判斷該對(duì)象是否攜帶有HBV相關(guān)HCC易感基因型rsl7401966AG或AA (即攜帶1個(gè)或2個(gè)A等位，表現(xiàn)為對(duì)HBV相關(guān)HCC具有更高的易感性)。對(duì)具有基因型rsl7401966AG或AA的個(gè)體，則可對(duì)之進(jìn)行科學(xué)的干預(yù)，例如建議及早進(jìn)行治療性預(yù)防等，這樣可以針對(duì)性地降低這些易感人群的HBV相關(guān)HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。


圖1 :rsl7401966在合并所有六個(gè)人群后進(jìn)行薈萃分析得到的森林圖O^orest plot)。圖中顯示了每個(gè)人群的OR值(藍(lán)色方塊所處位置)和95% CI (藍(lán)色水平線)。垂直虛線表示六個(gè)人群中的最終OR值。上面6行分別代表六個(gè)人群的數(shù)據(jù)，其下方的藍(lán)色菱形代表合并效應(yīng)值。每個(gè)藍(lán)色方塊的面積與該人群在薈萃分析中的權(quán)重成正比。薈萃分析指出聯(lián)合 P 值為 1. 7 X IO"18,聯(lián)合 OR 值為 0. 61 (95% CI = 0. 55-0. 67))。P異質(zhì)性=0. 60。圖2 :rsl7401966基因型與診斷年齡之間的關(guān)聯(lián)分析。豎線表示標(biāo)準(zhǔn)差。風(fēng)險(xiǎn)基因型攜帶者的HCC診斷年齡提前了 1. 1歲(AA vs. AG+GG，P = O. 020，t檢驗(yàn))。圖3 :1ρ36. 22區(qū)域的局部關(guān)聯(lián)圖。rsl7401966及其周圍SNP對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)是其所在的基因組位置(NCBI組裝版本36)，縱坐標(biāo)是關(guān)聯(lián)P值(-IogltlP)。rsl7401966在薈萃分析中的P值以藍(lán)色菱形顯示，在GWAS階段的P值以大的紅色菱形表示。其它位點(diǎn)的顏色代表其與rs17401966之間的LD程度紅色表示r2 ^ 0. 8，橙色表示0. 5 < r2 < 0. 8，黃色表示0. 2 < r2 < 0. 5，白色表示r2 < 0. 2。淺藍(lán)色線表示估計(jì)的重組率(來自HapMap計(jì)劃)。從 Santa Cruz GenomeBrowser (http //Renome. ucsc. edu/)基因組瀏覽器中得出基因的位置(NCBI組裝版本36)。rsl7401966位于KIFlB基因的內(nèi)含子M。圖的下部顯示了 rsl7401966(紅色箭頭所示)前后共約1Mb范圍內(nèi)的LD結(jié)構(gòu)，以廣西病例對(duì)照人群共707 個(gè)個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)計(jì)算。SNP之間的LD值以r2估計(jì)，同時(shí)紅色的程度表示r2值的大小， 最深的紅色表示r2 = 1。重組圖和LD結(jié)構(gòu)都清晰顯示出重組熱點(diǎn)的邊界。rsl7401966定位于一個(gè)約2441Λ范圍的LD區(qū)域，該區(qū)域包括了 KIF1B、P⑶和UBE4B基因的3，端。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1該實(shí)施例設(shè)計(jì)并合成了一套擴(kuò)增引物對(duì)和一條延伸引物，并且在這些引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種檢測與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的易感基因組區(qū)域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966基因型的方法。1、基因組DNA的提取采取本領(lǐng)域酚/氯仿法提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA。1)取檸檬酸鈉或EDTA-Na2抗凝全血5ml (盡量不用肝素抗凝)，置于50ml有蓋離心管；2)加入3-5倍體積冷蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，冰中放置5分鐘，4°C 2000rpm離心 20分鐘；3)緩慢傾倒上清，沉淀加入預(yù)冷的0. 1 % Triton-XlOO (體積同上)，輕柔混勻沉淀，如上離心，棄上清；4)沉淀加入裂解液(50Mm Tris-Cl-IOmM EDTA, pH8. 0)，徹底打碎沉淀，然后加入10% SDS至終濃度為0. 5%，混勻；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度為200 μ g/ml，混勻，55°C 3小時(shí)或37°C過夜消化(以過夜消化為佳)；6)加入等體積平衡酚，倒轉(zhuǎn)混勻，4000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)有蓋離心管；7)轉(zhuǎn)移上層水相，重復(fù)酚抽提一次；8)轉(zhuǎn)移上層水相，加入等體積的氯仿異戊醇04 1)，倒轉(zhuǎn)混勻，4000rpm離心 10分鐘；9)轉(zhuǎn)移上層水相，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5. 2)和2. 5倍體積預(yù)冷的無水乙醇混勻；10)置液氮冷凍10分鐘或-20°C 60分鐘后，4000rpm離心10分鐘；11)以70%乙醇洗滌沉淀1 2次，吹干或真空抽干；12)以 0.5ml TE (IOmM Tris-Cl-EDTA，pH8. 0)或蒸餾水溶解 DNA 沉淀，電泳檢測 DNA片段大小，或測^0Λ80ηπι OD比值。2、引物設(shè)計(jì)、合成及準(zhǔn)備1)使用 autoprimer 軟件(http:// www. autoprimer. com/, Beckman 公司提供)對(duì) rsl7401966進(jìn)行12重引物設(shè)計(jì)。因此，除了 rsl7401966之外，最多還可加入其它11個(gè)SNP 位點(diǎn)并同時(shí)進(jìn)行分型檢測。所有引物序列由上海英駿公司合成，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAG^純化。2)利用SNPstream分型的PCR條件對(duì)每對(duì)PCR引物進(jìn)行測試，確保引物特異性。 PCR程序?yàn)?5°C 15分鐘預(yù)變性，接下來的45個(gè)循環(huán)中包括三步，即94°C 30秒、55°C 20秒和72°C 1分鐘，PCR結(jié)束后保持在4°C待用。電泳檢測PCR擴(kuò)增的效率和產(chǎn)物的特異性(產(chǎn)物的特異性由測序結(jié)果最終確定)。3)配制PCR引物池(共12X2個(gè))，每條引物終濃度為10 μ M。4)配制延伸引物池(共12個(gè))，每條延伸引物終濃度為10 μ Μ。3、多重PCR反應(yīng)1)準(zhǔn)備12重PCR反應(yīng)混合液。按照一個(gè)384孔板的用量，各組分體積如下PCR 引物池 11. 25μ l，dNTP 67. 50 μ 1，10XPCR Buffer II 225. 00 μ 1,MgCl2 (25mM) 450. 00 μ 1, AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/ μ 1) 45. 00 μ 1, ddH20 551. 25 μ 1，共計(jì) 1350. 00 μ 1。2)向384孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入3 μ 1配好的PCR反應(yīng)混合液，再將稀釋好的IOng/ μ 1基因組DNA加入到對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，每孔加2 μ 1。3) 200g離心后，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)?5°C 15分鐘預(yù)變性，接下來的 45個(gè)循環(huán)中包括三步，即94°C 30秒、55 °C 20秒和72 °C 1分鐘，PCR結(jié)束后保持在4°C待用。3、多重PCR產(chǎn)物的純化1)配制Clean-up混合液。按照一個(gè)384孔板的用量，各組分體積如下Exo I (20U/ μ 1)45 μ 1，SAP(lU/y 1)448 μ 1，10XSAP Buffer 135 μ 1，ddH20 667 μ 1，共計(jì) 1350 μ 1。2)將PCR反應(yīng)后的384孔板200g離心，再加入配制好的Clean-up混合液，每孔3μ1。封膜并以200g離心。3)在PCR儀上進(jìn)行純化過程，程序?yàn)?7°C 30分鐘，96°C 10分鐘，保持在4°C待用。4、單堿基延伸1)配制引物延伸反應(yīng)混合液。按照一個(gè)384孔板的用量，各組分體積如下 ExtensionDilution Buffer 1692. 5 μ 1, Extension Primer Mix 13. 5 μ 1, 20XExtension Mix 90. O μ 1, ddH20 1336. 5 μ 1，DNA Polymerase 9. 4 μ 1，共計(jì) 3150 μ 1。2)將純化后的PCR產(chǎn)物200g離心，向每孔中加入7 μ 1配制好的引物延伸反應(yīng)混合物。封膜并以200g離心。3)在PCR儀上進(jìn)行延伸反應(yīng)。PCR程序?yàn)?6°C 3分鐘，接下來的46個(gè)循環(huán)中包括兩步，即94°C 20秒和40°C 11秒，PCR結(jié)束后保持在4°C待用。5、雜交反應(yīng)1)配制 12 重 SNPware 雜交板清洗液 I。用 ddH20 將 20XSNPware Wash Buffer I 稀釋到終濃度為IX的雜交板清洗液I。2)清洗SNPware雜交板3次。每次吸取10 μ 1雜交板清洗液I，加入到雜交板上的每個(gè)孔中。將SNPware雜交板翻過來放在無塵紙上，放在離心機(jī)的托盤內(nèi)進(jìn)行離心，使雜交板上每個(gè)孔中的清洗液全部脫離。離心速度為200g，時(shí)間為1分鐘。按照上述步驟共重復(fù)清洗3次。注意離心力不可超過200g，以免損壞雜交板。3)配制雜交混合液。按照一個(gè)384孔板的用量，各組分體積如下=Hybridization Solution3402 μ 1, Hybridization Additive 198 μ l，#if 3600 μ 1。4)向PCR板每孔中加入8 μ 1上述雜交混合液，在離心機(jī)上稍微離心使其混合均勻。取出15 μ 1加入到SNPware雜交板上對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，并用槍頭反復(fù)吹打使之混勻。5)將加入混合液的SNPware雜交板放入一個(gè)密封的盒子中，盒內(nèi)預(yù)先放幾張濕潤的紙巾，保證孵育過程中盒內(nèi)濕度，防止雜交板蒸干。于42°C溫箱孵育濁士 15min。6)配制 SNPware 雜交板清洗液 II。用 ddH20 將 64XSNPware Wash Buffer II 稀釋到終濃度為IX的雜交板清洗液II。7)雜交完成后，吸取10μ 1雜交板清洗液II，加入到雜交板上的每個(gè)孔中，清洗雜交后的SNPware雜交板。8)將SNPware雜交板翻過來放在無塵紙上，一起放在離心機(jī)的托盤內(nèi)進(jìn)行離心， 使雜交板上每個(gè)孔中的清洗液全部脫離。離心速度為200g，時(shí)間為1分鐘。按照上述步驟共重復(fù)清洗3次。注意離心力不可超過200g，以免損壞雜交板。6、基因型判讀1)清洗完畢后，用無塵紙蘸取少量無水甲醇擦拭雜交板背面玻片，使其清晰無痕跡，然后在掃描儀上掃描原始數(shù)據(jù)。2)使用SNPstream V2. 2軟件包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到rsl7401966和其它11 個(gè)SNP位點(diǎn)在每個(gè)個(gè)體中的基因型。實(shí)施例2該實(shí)施例設(shè)計(jì)并合成了一套擴(kuò)增引物對(duì)和一對(duì)探針，并且在這些引物和探針的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種檢測與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的易感基因組區(qū)域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966基因型的方法。1、基因組DNA的提取同實(shí)施例1。2、引物和探針合成根據(jù)rsl7401966所在基因組區(qū)域設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針序列，其中正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，，反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，，MGB 探針 1 5 ‘ (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘，MGB 探針 2 5' (HEX)-TATGAGTCCGTATTGAGT-3‘。所有引物和探針由商業(yè)公司(如上?；倒镜?合成，以ddH20將引物稀釋成20 μ Μ,將探針稀釋成10 μ Μ。注意探針需_20°C避光保存。3、PCR 反應(yīng)對(duì)樣品基因組DNA，用本發(fā)明提供的引物對(duì)和探針，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5μ 1反應(yīng)體系為dOng/y 1基因組DNA 1 μ 1，20 μ M的上下游引物各 0.25 μ 1，10 μ M 的探針各 0. 125 μ 1，以及 2. 5 μ 1 2Χ 預(yù)混緩沖液(Applied Biosystems TaqManGenotyping Master Mix ；包括 dNTP 及 Taq DNA 聚合酶)。PCR 條件為50°C 2 分鐘； 950C 10 分鐘；95°C 15 秒和 60°C 1 分鐘，共計(jì) 40 循環(huán)。PCR 反應(yīng)在 Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀上完成。4、數(shù)據(jù)分析和基因型判讀1)在Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀上的SDS軟件中，選擇 Analysis — Analysis Settings。2)在Marker下拉菜單中選擇Marker。3)在 Analysis kttings 對(duì)話框中，選擇自動(dòng)分型 Auto Caller，輸入 Quality value或者接受默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)OK接受分析參數(shù)，并退出窗口。4)菜單Analysis — Analyze, SDS軟件即開始分析數(shù)據(jù)，并在Results頁面顯示
計(jì)算結(jié)果。5)切換到Result頁面的Allelic discrimination子頁面，在Marker下拉菜單中選擇Marker，在下面界面中按Excel方式選擇需要查看的樣品孔，即在中間的圖譜上顯示信號(hào)點(diǎn)的分布情況。擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)代表FAM的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表HEX的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度。6)正常的基因型信號(hào)聚為4類，靠近原點(diǎn)處為空白對(duì)照NTC;靠近X軸的是HEX信號(hào)(GG純合子)；靠近Y軸的是FAM信號(hào)(AA純合子)；靠近對(duì)角線位置的樣品既有FAM信號(hào)也有HEX信號(hào)(AG雜合子)。7)從File菜單中選擇Export，輸出基因型數(shù)據(jù)。實(shí)施例3該實(shí)施例用實(shí)施例1和2建立起來的方法，對(duì)六個(gè)人群的rsl7401966基因型進(jìn)行了分析。1、試驗(yàn)對(duì)象本研究包括五個(gè)獨(dú)立病例對(duì)照人群(共計(jì)2，317例病例和1，790例對(duì)照)以及一個(gè)核心家系人群(159個(gè)核心家系)。所有入選者均為中國成年人，其中廣西病例對(duì)照人群、 廣西家系和廣東病例對(duì)照人群從中國南方招募，上海病例對(duì)照人群和江蘇病例對(duì)照人群從中國東部招募，北京病例對(duì)照人群從中國北部招募。HCC病例均為慢性HBV攜帶者、新近確診、未經(jīng)放化療治且不合并其它腫瘤。HCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括組織活檢陽性；血清甲胎蛋白水平彡400ng/ml，合并一項(xiàng)影像學(xué)診斷陽性。對(duì)照也均為慢性HBV攜帶者，其入選標(biāo)準(zhǔn)為 無癌癥病史，且性別與年齡(士5歲)分布與肝癌病例匹配。所有病例和對(duì)照均無直系親屬關(guān)系。HBV攜帶者HBsAg和HBcAb均為陽性并持續(xù)6個(gè)月以上。吸煙者的定義為研究對(duì)象在確診或收集資料之前至少吸煙一年以上。吸煙資料包括吸煙史、每天吸煙量、吸煙起始年齡和戒煙年齡等。吸煙者以“包-年”數(shù)(pack-year) 為累計(jì)吸煙劑量指標(biāo)，計(jì)算公式為(每日吸煙支數(shù)+20支)X吸煙年數(shù)。輕度與重度吸煙的界定標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)照人群吸煙者中“包-年”的均值，在本研究中“包-年” ^ 19為輕度吸煙，> 19為重度吸煙。飲酒者的定義為每周飲酒一次或以上，且持續(xù)6個(gè)月或以上。所有入選者均為HCV、HDV、HIV陰性，且無其他類型的肝病。本研究由北京放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。每名參與者均簽署知情同意書，并通過結(jié)構(gòu)化調(diào)查問卷提供社會(huì)人口學(xué)和臨床信息。下面列出的是六個(gè)人群的詳細(xì)情況廣西病例對(duì)照人群發(fā)明人此前于2002年7月至2004年10月自廣西腫瘤醫(yī)院 (中國南寧)招募了 248例罹患HCC的慢性HBV攜帶者和239例未患HCC的慢性HBV攜帶
-W 9 百 ο在本發(fā)明中，發(fā)明人于2005年5月至2008年1月從該醫(yī)院又招募了 112例病例。 所有360例病例均為無關(guān)中國成年人，居住在廣西扶綏及其周邊地區(qū)，該地區(qū)是中國南部一個(gè)眾所周知的HCC高發(fā)區(qū)。病例的回應(yīng)率(response rate)為91%。發(fā)明人另外招募了 116例未患HCC的慢性HBV攜帶者作為對(duì)照，這些對(duì)照與病例之間無直系親屬關(guān)系。對(duì)照是于同期在同一地區(qū)開展的社區(qū)腫瘤早期篩查計(jì)劃中隨機(jī)挑選的。對(duì)照的回應(yīng)率為90%。 在GWAS階段，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，有7例病例和1例對(duì)照被排除。因此，最終的廣西病例對(duì)照人群為348例病例和359例對(duì)照。北京病例對(duì)照人群這個(gè)病例對(duì)照人群共包括276例罹患HCC的慢性HBV攜帶者和266例未患HCC的慢性HBV攜帶者。所有病例均于2003年3月至2009年2月期間在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤防治研究所腫瘤醫(yī)院招募，這是中國北部的一個(gè)三級(jí)轉(zhuǎn)診中心(中國北京)。HCC患者均為居住于位于中國北部的北京市及其周邊省份的無關(guān)中國成年人，回應(yīng)率為88%。于同期在同一地區(qū)開展的6，450名個(gè)體的社區(qū)營養(yǎng)調(diào)查中，招募非腫瘤個(gè)體作為對(duì)照1CI。基于體檢及血清HBV標(biāo)志物檢查，以及與病例在年齡和性別上的匹配情況來挑選對(duì)照，其回應(yīng)率為83%。廣東病例對(duì)照人群這個(gè)病例對(duì)照人群共包括751例罹患HCC的慢性HBV攜帶者和509例未患HCC的慢性HBV攜帶者，于2003年8月至2007年11月在位于中國南部廣東省廣州市的中山大學(xué)腫瘤防治中心招募。病例的回應(yīng)率為91%。對(duì)照為無關(guān)獻(xiàn)血者，回應(yīng)率為94%。所有病例對(duì)照均為無關(guān)中國漢族成年人，并自稱是居住于廣州及其周邊地區(qū)的廣東人。上海病例對(duì)照人群這個(gè)病例對(duì)照人群于2003年2月至2008年7月在位于中國東部上海市的東方肝膽外科醫(yī)院招募。入選和排除標(biāo)準(zhǔn)此前已有報(bào)道“。在本研究中，只有慢性HBV攜帶者入選。此外，由于DNA耗盡，只有部分病例和對(duì)照入選。因此，這個(gè)病例對(duì)照人群總共包括4 例HCC患者和440例對(duì)照。所有入選者均為居住于中國東部上海市及其周邊地區(qū)的無關(guān)中國人。病例和對(duì)照的回應(yīng)率分別為86%和92%。江蘇病例對(duì)照人群自2005年8月至2009年5月，在位于江蘇省的啟東市肝病研究所、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、海門市疾病預(yù)防控制中心、南通市腫瘤醫(yī)院共招募507 例病例。江蘇省的啟東市、海門市和南通市位置接近，地處中國東部，是另外一處眾所周知的HCC高發(fā)區(qū)?；貞?yīng)率為89%。215例對(duì)照是于同期在江蘇省開展的社區(qū)非傳染病篩查項(xiàng)目中隨機(jī)挑選的，回應(yīng)率為92 %。廣西核心家系人群自2005年7月至2008年2月在廣西腫瘤醫(yī)院(中國南寧) 招募159個(gè)核心家系。HBV相關(guān)的HCC患者作為先證者，其入選標(biāo)準(zhǔn)與前述廣西人群是一樣的。先證者的回應(yīng)率為95%。先證者的診斷年齡只有35. 9歲，這是因?yàn)門DT分析要求其父母均在世。廣西核心家系人群中的先證者與廣西病例對(duì)照人群中的病例之間無重復(fù)。六個(gè)人群的社會(huì)人口學(xué)信息如表1所示。2、rsl7401966基因型的確定在廣西病例對(duì)照人群中(GWAS階段)，rsl7401966的基因型頻率分布如表2所示。 與A等位相比，G等位與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。以加性模式為例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示每增加一個(gè)G等位的患病風(fēng)險(xiǎn)降低0. 53倍[95%置信區(qū)間(95% Cl) = 0. 41-0. 70 ；P = 5. 8X IO"6] (表2)；也即A等位為HCC的易感等位，每增加一個(gè)A等位的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1. 89倍。采用實(shí)施例1中的方法，在北京病例對(duì)照人群中(重復(fù)驗(yàn)證階段1)對(duì)rsl7401966 進(jìn)行了分型，以驗(yàn)證其在廣西病例對(duì)照人群中的關(guān)聯(lián)結(jié)果。以加性模式為例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示每增加一個(gè)G等位的患病風(fēng)險(xiǎn)降低0.49倍[95% CI = 0.37-0.67 ；P = 3. 5X 10_6](表2)； 也即A等位為HCC的易感等位，每增加一個(gè)A等位的患病風(fēng)險(xiǎn)增加2. 04倍。進(jìn)一步采用實(shí)施例2中的方法，在另外三個(gè)病例對(duì)照人群中(重復(fù)驗(yàn)證階段2)驗(yàn)證rsl7401966的關(guān)聯(lián)結(jié)果。以加性模式為例，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在三個(gè)病例對(duì)照人群中，每增加一個(gè)G等位的患病風(fēng)險(xiǎn)分別降低0. 65倍[95% CI = 0. 54-0. 79 ；P = 1. 4X IO"5](廣東病例對(duì)照人群)、0· 66倍[95% CI = 0. 52-0. 83 ；P = 4. 4X 10_4](上海病例對(duì)照人群)和 0. 58倍[95% CI = 0. 45-0. 75 ；P = 3. 9 X IO"5](江蘇病例對(duì)照人群)；也即在三個(gè)病例對(duì)照人群中A等位均為HCC的易感等位，每增加一個(gè)A等位的患病風(fēng)險(xiǎn)分別增加1. 54、1. 52 和1. 72倍。接下來，發(fā)明人采用實(shí)施例2中的方法在廣西核心家系人群(重復(fù)驗(yàn)證階段3)中對(duì)rsl7401966進(jìn)行了分型。同樣的，傳遞/不平衡檢驗(yàn)(Transmission/disequilibrium test, TDT)發(fā)現(xiàn)rsl7401966與HCC存在顯著關(guān)聯(lián)(x2 = 5. 08,P = 0. 024)，關(guān)聯(lián)方向與前述基于人群的結(jié)果一致(表3)。3、深入分析rsl7401966基因型與HCC發(fā)生的易感性之間的相關(guān)性將兩個(gè)重復(fù)驗(yàn)證階段共四個(gè)病例對(duì)照人群進(jìn)行合并分析，rsl7401966與HCC存在顯著的關(guān)聯(lián)，且達(dá)到了全基因組關(guān)聯(lián)所需的顯著性水平(P = 5. 1X10_15)。進(jìn)一步與GWAS 階段數(shù)據(jù)合并分析，在總共2，310例病例和1，789例對(duì)照中，關(guān)聯(lián)P值達(dá)到了 3. 4X 10_19。 將所有五個(gè)病例對(duì)照人群和一個(gè)核心家系人群合并進(jìn)行薈萃分析(meta-analysis)，結(jié)果表明聯(lián)合P值達(dá)到了 1.7X10_18，聯(lián)合比值比(odds ratio，OR)為0.61(圖1)。此外，在各人群之間不存在顯著的異質(zhì)性(異質(zhì)性檢驗(yàn)P值為0. 60)。發(fā)明人詳細(xì)評(píng)估了 rsl7401966影響HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的遺傳模式。在所有病例對(duì)照人群中，rsl7401966的基因型頻率都是比較類似的。在合并人群中，rsl7401966的次要等位G以劑量效應(yīng)的方式在HCC發(fā)生中起保護(hù)作用(OR雜合子=0. 64,95% CI = 0. 56-0. 73 ；OR 純合子=0. 35,95% CI = 0. 26-0. 47 ；Piii5 = 3·4Χ10_19)?；诎l(fā)明人的數(shù)據(jù)，加性模型和顯性模型都比隱性模型更加適用，但是加性模型更加簡約。發(fā)明人進(jìn)一步按照性別和年齡分層來檢測rsl7401966對(duì)HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響。在合并后的病例對(duì)照人群中發(fā)現(xiàn)，遺傳效應(yīng)在男性中更加明顯(異質(zhì)性檢驗(yàn)P值為0. 027 ；表 4)。按照年齡分層則沒有發(fā)現(xiàn)遺傳效應(yīng)存在任何顯著性差異(異質(zhì)性檢驗(yàn)P值為0. 13)，但是，僅基于病例(case-only)的分析結(jié)果表明，與AA純合子攜帶者相比，保護(hù)性G等位的攜帶者的 HCC 診斷年齡(age at diagnosis)晚 1. 1 歲(P = 0. 020 ；圖 2)。4、解析rsl7401966所在區(qū)域(1ρ36. 22)的HCC易感基因新鑒定的HCC發(fā)生相關(guān)的易感基因組區(qū)域1ρ36. 22至少包括UBE4B、KIF1B、P⑶等基因(圖3)。KIFlB基因編碼驅(qū)動(dòng)蛋白超家族成員，參與細(xì)胞器和泡囊的轉(zhuǎn)運(yùn)15。KIFlB基因有多個(gè)可變剪接體，目前在多種惡性腫瘤中檢測到KIFlB β的種系性(germline)和體細(xì)胞性 (somatic)失活突變16_18。此外，近期兩項(xiàng)獨(dú)立的研究均發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中1ρ36.2區(qū)域的KIFlBii是潛在的腫瘤抑制基因，作用于EglN3脯氨酸羥化酶的下游通路并誘導(dǎo)凋亡
19,20
O泛素通路調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和DNA修復(fù)等多種細(xì)胞功能，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)涉及包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤21’22。UBE4B編碼泛素連接因子E4，參與多泛素鏈組裝23。盡管目前關(guān)于UBE4B參與HCC的證據(jù)很少，UBE4B仍然很有可能是HCC的候選易感基因。在最終死亡的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，UBE4B基因的剪接位置(splice site)發(fā)生突變 24O與早期/預(yù)后良好的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者相比，晚期/預(yù)后不良的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者體內(nèi) UBE4B的表達(dá)顯著降低M。此外，UBE4B在p63介導(dǎo)的順鉬誘導(dǎo)所致凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用M。P⑶基因參與戊糖磷酸代謝，盡管P⑶參與HCC發(fā)生的生物學(xué)可能性尚有待深入闡明，PGD蛋白酶的失調(diào)在多種惡性腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)26’27，提示其功能的重要性。總之，以往的研究以及發(fā)明人的關(guān)聯(lián)研究和功能研究均提示，rsl7401966所在區(qū)域(1ρ36. 22)的HCC易感基因包括UBE4B、KIF1B、PGD等基因。因此，用本發(fā)明的方法解析了基因組區(qū)域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的 rsl7401966基因型與HCC發(fā)生的易感性之間的相關(guān)性。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但所作改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利書所限定的范圍之內(nèi)。這些改動(dòng)或修改包括但不限于1、HCC發(fā)生相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)本發(fā)明鑒定的HCC發(fā)生的易感區(qū)域1ρ36. 22至少包括一個(gè)跨度約2441Λ的較大基因組片段(包含rsl7401966)，如圖3所示。該區(qū)域中有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與rsl7401966呈
12較強(qiáng)的LD狀態(tài)，它們同樣能夠指示HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)這些多態(tài)性位點(diǎn)的檢測同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利書所限定的范圍之內(nèi)。2、HCC發(fā)生相關(guān)的易感基因本發(fā)明鑒定的HCC發(fā)生的易感區(qū)域位于1ρ36. 22，該區(qū)域由緊密相連的多個(gè)較小區(qū)域組成，如圖3所示。其中一個(gè)區(qū)域包括UBE4B、KIF1B和P⑶等易感基因。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，位于1ρ36. 22的其它區(qū)域的基因也有可能是與HCC發(fā)生相關(guān)的易感基因，對(duì)這些基因的檢測同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利書所限定的范圍之內(nèi)。3、檢測rsl7401966或與之呈較強(qiáng)LD的其它多態(tài)性位點(diǎn)的方法本發(fā)明提供了檢測與HCC發(fā)生的易感性關(guān)聯(lián)的1ρ36. 22區(qū)域(UBE4B-KIF1B-P⑶) 多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的兩種方法，包括SNPstream分型和TaqMan分型等方法。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上的分型方法僅是示意性的，用于檢測rsl7401966或與之呈較強(qiáng)LD 的其它多態(tài)性位點(diǎn)的方法可以是任何一種分型方法或其改進(jìn)，可以使用本發(fā)明中列出的引物和探針或針對(duì)這些位點(diǎn)的其它任何引物和探針。這些分型的方法及所用引物和探針同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利書所限定的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種與HCC發(fā)生易感性關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的檢測試劑盒，包括序列1 7所示擴(kuò)增和延伸用基因特異性引物、探針和 dNTP,以及用于PCR反應(yīng)、純化反應(yīng)、延伸反應(yīng)和雜交反應(yīng)的各種酶制劑及緩沖液的一種或多種。
2.一種檢測1ρ36. 22區(qū)域多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因型的特異性擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物，其特征為1)對(duì)包含多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因組區(qū)域，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物對(duì)和延伸引物；2)所設(shè)計(jì)的特異性引物序列為正向引物(見序列表中序列1)，反向引物(見序列表中序列2)，延伸引物(見序列表中序列3)。
3.一種檢測1ρ36. 22區(qū)域多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因型的特異性擴(kuò)增引物對(duì)和探針，其特征為1)對(duì)包含多態(tài)性位點(diǎn)rsl7401966的基因組區(qū)域，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物對(duì)和探針；2)所設(shè)計(jì)的特異性引物和探針序列為正向引物(見序列表中序列4)，反向引物(見序列表中序列5)，MGB探針1 (見序列表中序列6)，MGB探針2 (見序列表中序列7)。
4.權(quán)利要求2或3中所述的引物對(duì)、延伸引物或探針在制備檢測試劑盒中的應(yīng)用，其特征為該檢測試劑盒可檢測與HCC發(fā)生易感性關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-PGD)的多態(tài)性位點(diǎn) rsl7401966 的基因型。
全文摘要
本發(fā)明涉及與HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的易感基因組區(qū)域1p36.22的多態(tài)性位點(diǎn)rs17401966的檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用。所述方法為SNPstream分型和TaqMan分型，本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測上述易感位點(diǎn)的試劑盒及其應(yīng)用。另外，本發(fā)明將1p36.22區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)rs17401966與HBV相關(guān)HCC的患病風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來，確定了1p36.22是HBV相關(guān)HCC的一個(gè)新的易感基因區(qū)域，為HBV相關(guān)HCC的人群預(yù)防和控制提供了新的遺傳咨詢內(nèi)容。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102277414SQ20101019696
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者周鋼橋, 張紅星, 翟蕓, 賀福初 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所