專利名稱：：一種霍亂弧菌o1群檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及體外診斷試劑
技術領域：
，具體涉及一種霍亂弧菌01群檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：霍亂是一類以腹瀉為主要癥狀的烈性傳染病，至今已發(fā)生7次世界大流行，1961年開始由埃爾托霍亂弧菌引起的霍亂第7次世界大流行，波及140個國家和地區(qū)，報告病例400萬以上。據WHO專家會議估計，全球每年約發(fā)生550萬例，其中以亞洲、非洲和拉丁美洲較為嚴重，引起亞洲10萬和非洲2萬人死亡。時至今日，霍亂仍然是最危險的烈性傳染病之一。因此，早期迅速和正確的診斷對治療和預防本病的蔓延有重大意義。目前霍亂弧菌已被分為200多個血清群，但只有01血清群和0139血清群能夠引起流行，準確、快速地檢測霍亂弧菌01群具有十分重要的意義傳統(tǒng)霍亂弧菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求。以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實際應用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(realtimePCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此不適用于現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫擴增(IsothermalAmplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已建立起來的環(huán)介導恒溫擴增技術(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。因此，需要一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的霍亂弧菌01群檢測試劑盒及檢測方法以解決上述問題?；诃h(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplicationofDNA,簡稱LAMP)是利用fetDNA聚合酶和根據靶基因序列設計的兩對特殊的內、外引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應，在靶標DNA區(qū)啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環(huán)的花椰菜結構的莖_環(huán)DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恒溫(6365°C)條件下4590分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增技術與PCR技術(包括熒光實時定量PCR技術)進行比較，可以發(fā)現該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優(yōu)于PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術。目前國家標準中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學鑒定為主、結合生化分析和血清學分型鑒定的通行方法，初步鑒定需23天，完成鑒定報告需1015天；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小時。并且，本發(fā)明的反應體系中加入了顯色液，鑒定結果更為直觀清晰。_
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題之一是克服現有技術中耗時長，漏檢率高的不足提供檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的霍亂弧菌01群檢測試劑盒?；魜y弧菌01群有多個重要抗原。本發(fā)明檢測的是基因，該基因為霍亂弧菌01群0抗原1型的編碼基因，可以特異地檢測出霍亂弧菌01群。與NCBI網站nt數據庫的BLAST比對結果顯示，除霍亂弧菌01群外，無其它菌帶有該基因。本發(fā)明所提供的霍亂弧菌01群檢測試劑盒包括下列組成以霍亂弧菌基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的各兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3，Bstmk聚合酶，反應液，樣品預處理液，顯色液，穩(wěn)定液和陽性對照。所述的兩對內外引物分別為外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTT(SEQIDN01)外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTG(SEQIDN02)內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCC(SEQIDN03)內引物BIP:AGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTT(SEQIDN04)或外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATA(SEQIDN05)外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGC(SEQIDN06)內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTC(SEQIDN07)內引物BIP:GCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGT(SEQIDN08)或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACG(SEQIDN09)外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGC(SEQIDN010)內引物FIP:AACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCT(SEQIDN011)內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGC(SEQIDN012)或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGA(SEQIDN013)外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGT(SEQIDN014)內引物FIP:GTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTC(SEQIDN015)內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTG(SEQIDN016)。所述的內引物FIP/BIP各為0.20.25iimol/L，外引物F3/B3的濃度各為1.22.0umol/L；優(yōu)選內引物FIP/BIP的濃度為0.2umol/L,外引物F3/B3的濃度為1.6umol/L。所述的聚合酶酶濃度4-10U/iiL，優(yōu)選酶濃度為8U/iiL。所述的反應液含1.62mmol/LdNTPs、2025mmol/LTris_HCl、1012.5mmol/LKC1U012.5mmol/L(NH4)2S04、810mmol/LMgS04、0.10.125體積％TritonX-100、0.8lmol/L甜菜堿；優(yōu)選2mmol/LdNTPs、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125體積％TritonX-100、lmol/L甜菜堿。所述的顯色液為SYBRGreenI或EvaGreen，優(yōu)選SYBRGreenI。所述穩(wěn)定液為石蠟油。所述的陽性對照為霍亂弧菌01群基因組DNA。本發(fā)明所要解決的另一技術問題是提供一種霍亂弧菌01群檢測方法，包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀加入本發(fā)明檢測試劑盒中的樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA；(3)在反應容器中加入本發(fā)明試劑盒中的BstDNA聚合酶0.91.8體積份數、反應液3840體積份數、穩(wěn)定液5254.5體積份數、樣品模板DNA4.59體積份數、內引物FIP/BIP各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恒溫反應；(4)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；步驟(3)中所述的恒溫反應的反應條件為溫度6365°C，反應時間4590min。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應用六個區(qū)段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴增快速且高效，在不到1小時即可完成擴增，且產率高；4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的基因作為靶基因設計引物，使得本發(fā)明的檢測試劑盒檢測霍亂弧菌01群的準確率更高。_具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1試劑盒的制備(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTT(SEQIDN01)外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTG(SEQIDN02)內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCC(SEQIDN03)內引物BIP:AGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTT(SEQIDN04)。(2)購置DNA聚合酶聚合酶置于容器；(3)配制反應液和引物反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125體積％TritonX-100、lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各0.2iimol/L和外引物F3/B3各0.25iimol/L,置于容器；(4)配制樣品預處理液樣品預處理液含有20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2體積%TritonX-100,置于容器；(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購置顯色液SYBRGreenI，置于容器；(7)提取陽性對照提取霍亂弧菌01群基因組DNA，置于容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質檢；2、將上述(2廣(4)步驟配制的液體無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質檢；4、將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；5、組裝試劑盒。在本發(fā)明霍亂弧菌01群檢測試劑盒的其他實施例中，所采用的引物還可以是外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACG(SEQIDN09)外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGC(SEQIDN010)內引物FIP:AACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCT(SEQIDN011)內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGC(SEQIDN012)實施例2試劑盒的制備(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATA(SEQIDN05)外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGC(SEQIDN06)內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTC(SEQIDN07)內引物BIP:GCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGT(SEQIDN08)(2)購置DNA聚合酶-.Bstrnk聚合酶置于容器；(3)配制反應液和引物反應液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-Cl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2S04、8mmol/LMgS04、0.1體積％TritonX-100,0.8mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各0.25umol/L和外引物F3/B3各1.2iimol/L，置于容器；(4)配制樣品預處理液樣品預處理液含有10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、lmmol/LEDTA和1.0體積%TritonX-100,置于容器；(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購置顯色液EVAGreenI，置于容器；(7)提取陽性對照提取霍亂弧菌01群基因組DNA，置于容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。其他同實施例1。在本發(fā)明霍亂弧菌01群檢測試劑盒的其他實施例中，所采用的引物還可以是外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGA(SEQIDN013)外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGT(SEQIDN014)內引物FIP:GTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTC(SEQIDN015)內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTG(SEQIDN016)。實施例3霍亂弧菌01群檢測試劑盒的應用1材料與方法1.1材料1.1.1菌株本發(fā)明采用菌株有17株，主要來源于中國疾病預防控制中心、上海市疾病預防控制中心、浦東新區(qū)疾病預防控制中心。詳見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.2分離菌株的鑒定1.2.1將標本接種至TCBS瓊脂、雙洗平板上，TCBS上出現黃色菌落，雙洗平板上出現灰黑色中心的菌落均為可疑菌落。在顯微鏡下菌體為稍彎的桿菌，菌體短，逗點狀，菌體單端有一根鞭毛，運動活潑呈穿梭狀，革蘭氏染色陰性。生化反應氧化酶+蔗糖+靛基質_硫化氫-動力+V-P+。血清學反應與霍亂弧菌01群多價診斷血清發(fā)生凝集，生理鹽水不凝集。1.3樣品處理(模板DNA提取)1.3.1取lmL液體培養(yǎng)的菌液樣品，lOOOOrpm離心2分鐘，獲得菌體沉淀；1.3.2在上述菌體沉淀中加入100yL樣品預處理液混合均勻，沸水中煮20分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘，lOOOOrpm離心2分鐘，上清即為樣品模板DNA。1.4、采用實施例1或實施例2的試劑盒進行環(huán)介導等溫擴增技術的反應過程1.4.1在200uL反應管配制反應體系反應液和引物共22uL，BstDNA聚合酶0.5yL(4U)，穩(wěn)定液30uL，模板DNA2.5yL。1.4.2將配制好的反應管于65°C恒溫反應1小時。1.5反應后處理向上述反應產物中加入2uLSYBRGreenI，混勻，同時也向陽性對照管(霍亂弧菌01群基因組DNA)和陰性對照管(去離子水)中加入SYBRGreenI混勻，若反應管與陽性對照管一樣顯現綠色則為陽性，若反應管與陰性對照管一樣顯現橙色則為陰性。1.6電泳配制0.2%瓊脂糖凝膠電泳。以SYBRGreenI作為染料進行顯色反應觀察結果。1.7特異度試驗1.7.1純菌株LAMP檢測用LAMP方法對25株細菌進行擴增，根據顯色反應觀察結果，綠色為陽性，橙色陰性，驗證方法特異性。1.7.2幾種菌株混合DNA檢測用LAMP對霍亂弧菌01群及沙門氏、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌的DNA等體積混合液取2.5ul作LAMP檢測。1.8靈敏度試驗將霍亂弧菌01群于普通營養(yǎng)瓊脂平板上純培養(yǎng)18-24小時后，挑兩滿環(huán)菌落混懸于5mL無菌生理鹽水中，用生理鹽水10倍倍比稀釋至10-10。選擇適宜的3個濃度級取100ul平鋪于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，分別作3個平板，37°C培養(yǎng)48h，取菌落數在30300之間的平板作平板計數，該濃度級的3個平板的菌落數的均數推算細菌濃度，為菌落平均數X稀釋倍數X10；同時，各濃度級取lmL，提取DNA，作LAMP檢測。1.8重復性試驗特異度試驗和靈敏度試驗分別重復2次。2結果2.1霍亂弧菌01群LAMP檢測方法的建立2.2特異度試驗霍亂弧菌01群(編號N16961)檢測結果陽性，11株非霍亂弧菌01群均陰性，霍亂弧菌01群的5例樣品及霍亂弧菌01群、沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌4種細菌DNA混合液為陽性，如表2所示。結果顯示試劑盒具有高特異性。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>擬■靈._2.3靈敏度試驗經菌落平板計數，選擇第9個稀釋度進行讀數，平均菌落數為126cfu，推算細菌原液濃度為1.26X1011cfu/mL,LAMP方法可檢測到第4個稀釋度，為1.26X107cfu/mL。電泳結果也符合上述結果。2.4重復性試驗特異度試驗重復兩次，結果一致。靈敏度試驗重復兩次，數量級一致。SEQUENCELISTING<110>廣州華峰生物科技有限公司，中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局<120>一種霍亂弧菌01群檢測試劑盒及其檢測方法<160>16<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1acatcaccacagcctctt18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgaacctagaagtgtgtg19<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3agtctttgtgagtgtggtaaagctttttctgctttttttgctcgtcc47<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>4aggtcatctgtaagtacaacattccttttgtaaagtaggcttacttgagtt51<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5acccaatactgaggcgata19<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6cacttgcgagtgaagagc18<210>7<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>7tcaggttattcatattggtggttggtttttaaaggtaattttatccaccttctc54<210>8<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>8gcaattgaaacgagatccccttgttttgctcataatttttggattcacgt50<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9gagctatggctaatatctttacg23<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gctaaccaaccattagaagc20<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>11aacccaatcgtttgaaaaacctgcttttaaaattatccaaaaaagctcgct51<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>12gctaggaagttcaatccagtatgttttttggtttaatcaatgaagcgc48<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>13gctcgtccaatgactttga19<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14cctattctgacgtaattattcgt23<210>15<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>15gttgtacttacagatgaccttggtgtttttttccagctttaccacactc49<210>16<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>16ccggatatgaatgcggtagtggttttgatgaatcgaacctagaagtg4權利要求一種霍亂弧菌O1群檢測試劑盒，包括BstDNA聚合酶，反應液，樣品預處理液，顯色液，穩(wěn)定液和陽性對照，其特征在于還包括以以霍亂弧菌RfbN基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的各兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。2.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于所述的霍亂弧菌01群的兩對內外引物序列分別為外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTTSEQIDN01外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTGSEQIDN02內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCCSEQIDN03內引物BIPAGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTTSEQIDN04或外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATASEQIDN05外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGCSEQIDN06內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTCSEQIDN07內引物BIPGCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGTSEQIDN08或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACGSEQIDN09外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGCSEQIDN010內引物FIPAACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCTSEQIDN011內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGCSEQIDN012或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGASEQIDN013外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGTSEQIDN014內引物FIPGTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTCSEQIDN015內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTGSEQIDN016。3.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于所述的內引物FIP/BIP各為0.20.25μmol/L,外引物F3/B3的濃度各為1.22.0μmol/L。4.根據權利要求3所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于內引物FIP/BIP的濃度為0.2“11101/1，外引物？3/83的濃度為1.6μmol/L。5.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于所述的feiDNA聚合酶酶濃度4-10υ/μ1，所述的顯色液為SYBRGreenI或EvaGreen。6.根據權利要求5所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于所述的酶濃度為8υ/μL，所述的顯色液為SYBRGreenI。7.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于所述的反應液含1.62mmol/LdNTPs、2025mmol/LTris-HCl、1012.5mmol/LKCl、1012.5mmol/L(NH4)2S04、810mmol/LMgS04、0.10.125體積％TritonX_100、0.8lmol/L甜菜堿。8.根據權利要求7所述的沙門氏菌與志賀氏菌聯合檢測試劑盒，其特征在于所述的反應液含2mmol/LdNTPs、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125體積％TritonX-100、lmol/L甜菜堿。9.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為霍亂弧菌01群基因組DNA。10.一種根據權利要求1的試劑盒進行的霍亂弧菌01群檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀加入權利要求1檢測試劑盒中的樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA；(3)在反應容器中加入權利要求1檢測試劑盒中的BstDNA聚合酶0.91.8體積份數、反應液3840體積份數、穩(wěn)定液5254.5體積份數、樣品模板DNA4.59體積份數、內引物FIP/BIP各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恒溫反應；其中所述的內引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以霍亂弧菌基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的各兩對引物，兩對內外引物序列分別為外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTTSEQIDN01外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTGSEQIDN02內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCCSEQIDN03內引物BIPAGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTTSEQIDN04或外引物F3ACCCAATACTGAGGCGATASEQIDN05外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGCSEQIDN06內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTCSEQIDN07內引物BIPGCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGTSEQIDN08或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACGSEQIDN09外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGCSEQIDN010內引物FIPAACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCTSEQIDN011內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGCSEQIDN012或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGASEQIDN013外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGTSEQIDN014內引物FIPGTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTCSEQIDN015內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTGSEQIDN016；(4)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。11.根據權利要求10所述的霍亂弧菌01群檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的恒溫反應的反應條件為溫度6365°C，反應時間4590min。全文摘要本發(fā)明涉及一種霍亂弧菌O1群檢測試劑盒，本發(fā)明的試劑盒包括BstDNA聚合酶，反應液，樣品預處理液，顯色液，穩(wěn)定液和陽性對照，還包括以以霍亂弧菌RfbN基因為靶基因、基于環(huán)介導恒溫擴增技術設計的各兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的霍亂弧菌O1群檢測試劑盒檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低，適用于霍亂弧菌O1群的快速檢測。文檔編號C12Q1/68GK101824482SQ20101019322公開日2010年9月8日申請日期2010年6月7日優(yōu)先權日2010年6月7日發(fā)明者何宇平,馮雪梅,張曉航,張琳,張繼倫,方筠,曹以誠,杜正平,柯佳佳,田楨干,閻俊,陳洵,韓曉輝申請人:廣州華峰生物科技有限公司;中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局