專利名稱：一種乳酸菌細胞高通透性微膠囊的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為一種乳酸菌細胞高通透性微膠囊的制備方法及應用，屬于生物工程技術 領域，是一種提高發(fā)酵乳制品、發(fā)酵果蔬汁等連續(xù)接種發(fā)酵劑效率的新技術。
背景技術：
近年來，隨著我國人民消費水平的提高，酸奶產(chǎn)量以年平均25%的速度增長，已經(jīng) 成為我國第一大發(fā)酵乳制品，是最具盈利和發(fā)展?jié)摿Φ娜橹破贰Ｄ壳坝糜谒崮躺a(chǎn)的發(fā)酵劑有兩類一類傳統(tǒng)的繼代式發(fā)酵劑，一類為直投式發(fā) 酵劑。繼代式發(fā)酵劑含菌量少(107-108cfu/ml)不能直接用于生產(chǎn)，需經(jīng)母發(fā)酵劑、中間 發(fā)酵劑、生產(chǎn)發(fā)酵劑的擴大繁殖才能用于酸奶發(fā)酵，發(fā)酵劑的制作過程比較復雜，無菌要求 高，另外還存在菌種使用時間短，保存?zhèn)鞔щy，容易污染等問題。為了解決這些問題，國外 從90年代末，開發(fā)出直投式酸奶發(fā)酵劑，如丹麥的漢森公司，法國的羅地亞公司。直投式 發(fā)酵劑的使用，簡化了生產(chǎn)工藝，省去了菌種車間，避免了各廠家微生物技術力量不足而造 成的菌種質量不佳的問題，但使用直投式發(fā)酵劑成本恨高，目前國內還沒有直投式發(fā)酵劑 的生產(chǎn)，在一些高檔酸奶中所使用的直投式發(fā)酵劑全部從國外進口。研制開發(fā)具有自主知 識產(chǎn)權的新型、高效酸奶發(fā)酵劑生產(chǎn)技術，克服了上述兩類發(fā)酵劑的不足，即簡化了生產(chǎn)工 藝，又降低了生產(chǎn)成本，顯得尤為重要。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的是針對目前用于連續(xù)接種微囊化發(fā)酵劑生產(chǎn)使用過程中 存在細胞釋放量低、不穩(wěn)定等問題，研究的一種既能在培養(yǎng)過程有效提高微囊內細胞密度， 又能在連續(xù)接種過程中微囊內乳酸菌細胞高效釋放的技術。技術方案本發(fā)明所提供的提供一種乳酸菌細胞高通透性微膠囊制備方法，包括將冷凍干燥的乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基將菌種活化兩次，然后將活化的菌種接種 到乳清或MRS培養(yǎng)基中，30-44°C培養(yǎng)18小時，5000rpm，離心lOmin，棄去上清液，將菌體懸 浮于2% (w/w)的無菌蔗糖溶液中，與10倍濃度為-5% (w/w)無菌淀粉溶液(含有 1% 氯化鈣)混合，通過微囊化細胞無菌制備裝置(專利號ZL2008 2 0035824. 2)，滴 入無菌的含0.3%-0.8% (w/w)的海藻酸鈉(含0. (w/w)吐溫80)溶液中，所得膠囊用 無菌水沖洗后，放入的氯化鈣溶液中硬化20-40分鐘，過濾，棄去氯化鈣溶液，用無菌水 沖洗后，將膠囊放入-3%的殼聚糖淀粉混合溶液中(殼聚糖淀粉=1 6)，30min后 取出，用無菌水沖洗后，置于無菌改良乳清培養(yǎng)基中，在37°C恒定pH6. 5培養(yǎng)至培養(yǎng)基中總 糖含量低于(w/w)，更換無菌改良乳清培養(yǎng)基，繼續(xù)在37°C恒定pH6. 5培養(yǎng)，重復3批， 微膠囊內細胞密度達lO^cfu/g，過濾，去除培養(yǎng)基，即制成高密度乳酸菌微膠囊。將微膠囊 置于含中溫a -淀粉酶(0. 1%-0. 3%)和糖化酶(0. 5%-0.8%)的溶液(pH為5. 5-6. 5) 中，35-40°C保溫2-6小時，制成乳酸菌細胞高通透性微膠囊。MRS 培養(yǎng)基
3
蛋白胨 log牛肉膏10g酵母提取物5g
K2HP04 2g檸檬酸二銨2g乙酸鈉5g
葡萄糖 20g吐溫80lmLMgS04.7H20 0 58g
MnS04.4H20 0. 25g 蒸餾水lOOOmLpH6.2-6. 4 ；
改良乳清培養(yǎng)基
乳清粉60g植物蛋白水解液20g酵母粉0. 8g
K2HP04 4g碳酸鈣8g海藻糖5g
蒸餾水 lOOOmLPH6. 8-7.,2。
用上述乳酸菌細胞高通透性微膠囊發(fā)酵劑，包括單菌微膠囊、；混菌微膠囊、不同菌
的單菌膠囊混合的乳酸菌發(fā)酵劑，廣泛應用于乳制品發(fā)酵(如含菌奶、酸奶、干酪、含益生 菌奶等)，豆奶發(fā)酵，果蔬汁發(fā)酵，葡萄酒降酸。將上述方法制得的膠囊，裝入經(jīng)殺菌的生物 反應器，用于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵果汁、發(fā)酵蔬菜汁的連續(xù)接種即可。有益效果本發(fā)明利用生物工程技術，用乳酸菌細胞高通透性微膠囊制備技術制得的連續(xù)接 種乳酸菌發(fā)酵劑，克服了現(xiàn)有技術中兩類發(fā)酵劑的不足，即簡化了生產(chǎn)工藝，又降低了生產(chǎn) 成本，必定有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。本發(fā)明的主要優(yōu)點和積極效果如下1.既能在培養(yǎng)過程有效提高微囊內細胞密度(> lO^cfu/g)，又能在連續(xù)接種過 程中微囊內乳酸菌細胞高效釋放；2.發(fā)酵劑的生產(chǎn)成本低，不需高速冷凍離心(或超濾)，冷凍干燥工序，只需經(jīng)普 通過濾就可分離菌體。3.乳酸菌細胞包囊后，可以防止嗜菌體感染，從而保證發(fā)酵成功；4.在連續(xù)生產(chǎn)過程中，可以基本保持球菌和桿菌的比例，確保連續(xù)生產(chǎn)酸奶的風 味基本一致。
具體實施例方式方法1 將冷凍干燥的乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基將菌種活化兩次，然后將活化的菌 種接種到乳清或MRS培養(yǎng)基中，30-44°C培養(yǎng)18小時，5000rpm，離心lOmin，棄去上清液，將 菌體懸浮于2% (w/w)的無菌蔗糖溶液中，與10倍濃度為-5% (w/w)無菌淀粉溶液(含 有-3%氯化鈣)混合，通過微囊化細胞無菌制備裝置(專利號ZL2008 2 0035824. 2)， 滴入無菌的含0.3%-0.8% (w/w)的海藻酸鈉(含0.1% (w/w)吐溫80)溶液中，所得膠 囊用無菌水沖洗后，放入1 %的氯化鈣溶液中硬化20-40分鐘，過濾，棄去氯化鈣溶液，用 無菌水沖洗后，將膠囊放入的殼聚糖淀粉混合溶液中(殼聚糖淀粉=1:6)， 30min后取出，用無菌水沖洗后，置于無菌改良乳清培養(yǎng)基中，在37°C恒定pH6. 5培養(yǎng)至培 養(yǎng)基中總糖含量低于(w/w)，更換無菌改良乳清培養(yǎng)基，繼續(xù)在37°C恒定pH6. 5培養(yǎng)， 重復3批，微膠囊內細胞密度達lO^cfu/g，過濾，去除培養(yǎng)基，即制成高密度乳酸菌微膠囊。 將微膠囊置于含中溫a “淀粉酶(0. 1% -0. 3% )和糖化酶(0. 5% -0. 8% )的溶液(pH為 5. 5-6. 5)中，35-40°C保溫2_6小時，制成乳酸菌細胞高通透性微膠囊。將上述方法制得的膠囊，裝入經(jīng)殺菌的生物反應器，用于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵果汁、發(fā)酵蔬菜汁的連續(xù)接種。 用上述乳酸菌細胞高通透性微膠囊制備及應用技術制得的乳酸菌發(fā)酵劑，包括單 菌微膠囊、混菌微膠囊、不同菌的單菌膠囊混合的乳酸菌發(fā)酵劑，廣泛應用于乳制品發(fā)酵 (如含菌奶、酸奶、干酪、含益生菌奶等)，豆奶發(fā)酵，果蔬汁發(fā)酵，葡萄酒降酸。上述用于乳酸菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方
MRS培養(yǎng)基
蛋白胨 10g牛肉膏10g酵母提取物5g
K2HP04 2g檸檬酸二銨2g乙酸鈉5g
葡萄糖 20g吐溫80lmLMgS04.7H200. 58g
MnS04. 4H20 0. 25g蒸餾水1000mLpH6. 2-6. 4
改良乳清培養(yǎng)基
乳清粉60g 植物蛋白水解液20g酵母粉0.y
K2HP04 4g 碳酉髮鈣8g海藻糖5g
蒸餾水 lOOOmL pH6. 8-7.2
上述乳酸菌細胞高通透性微膠囊制備及應用技術制得的乳酸菌發(fā)酵劑應用實施例(注以下實施例所用乳酸菌都是目前生產(chǎn)上常規(guī)菌種，公眾可以得到)
實施例1.發(fā)酵果蔬汁生產(chǎn)
按上述方法將植物乳桿菌(L. plantarum)、營養(yǎng)乳桿菌(L. alimentarius)、
乳酸乳球菌(L. lactis)、羅旺醋桿菌(Acetobacter lovaniensis)、漢氏醋桿菌 (Gluconacetobacter hansenii)制備成單種或混合的微膠囊發(fā)酵劑，裝入經(jīng)殺菌的生物反 應器，將該生物反應器的進料口與巴氏殺菌器(帶冷卻)的出口相連接，反應器出口與發(fā) 酵罐相連，連續(xù)泵入巴氏殺菌果蔬汁，同時從生物反應器中流出含菌果蔬汁，控制含菌果蔬 汁中菌密度在105-106cfU/ml。含菌果蔬汁流入下一級發(fā)酵罐，20-30°C恒溫發(fā)酵，生產(chǎn)各種 發(fā)酵果蔬汁飲料。一般一次投入的發(fā)酵劑可連續(xù)使用15-30天，成本比直透式發(fā)酵劑降低 50-60 %，同時避免了使用繼代式發(fā)酵劑質量不穩(wěn)定的缺陷。
實施例2.發(fā)酵乳制品生產(chǎn) 按上述方法制得的嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)、德氏保加利亞乳桿菌 (L. dellrueckii subsp. bulgraricus)、干酷桿菌(L. casei)、長雙歧桿菌((B. longum)、 發(fā)酵乳桿菌(L. fermentum)單種或混合的微膠囊發(fā)酵劑裝入經(jīng)殺菌的生物反應器，將該生 物反應器的進料口與巴氏殺菌器(帶冷卻)的出口相連接，反應器出口與發(fā)酵罐相連，連續(xù) 泵入巴氏殺菌奶，同時從生物反應器中流出含菌奶，控制含菌奶中菌密度在106-107cfu/ml。 含菌奶流入下一級發(fā)酵罐，若直接灌裝，可生產(chǎn)益生菌鮮奶，若在30-42°C恒溫發(fā)酵，可生產(chǎn) 各種發(fā)酵乳制品。一般一次投入的發(fā)酵劑可連續(xù)使用15-30天，成本比直透式發(fā)酵劑降低 50-60 %，同時避免了使用繼代式發(fā)酵劑質量不穩(wěn)定的缺陷。實施例3.發(fā)酵豆乳生產(chǎn)按上述方法制得的嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)、德氏保加利亞乳桿菌 (L. dellrueckii subsp. bulgraricus)、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌(L. plantarum)、發(fā)酵乳桿 菌(L. fermentum)、乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)單種或混合的微膠囊發(fā)酵劑裝入 經(jīng)殺菌的生物反應器，將該生物反應器的進料口與巴氏殺菌器(帶冷卻)的出口相連接，反應器出口與發(fā)酵罐相連，連續(xù)泵入巴氏殺菌豆奶，同時從生物反應器中流出含菌豆奶，控制 含菌奶中菌密度在106-107cfU/ml。含菌豆奶流入下一級發(fā)酵罐，在30-42°C恒溫發(fā)酵，可生 產(chǎn)各種發(fā)酵豆奶。一般一次投入的發(fā)酵劑可連續(xù)使用15-30天，成本比直透式發(fā)酵劑降低 50-60 %，同時避免了使用繼代式發(fā)酵劑質量不穩(wěn)定的缺陷。
權利要求
一種乳酸菌細胞高通透性微膠囊的制備方法，包括將冷凍干燥的乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基將菌種活化兩次，然后將活化的菌種接種到乳清或MRS培養(yǎng)基中，30-44℃培養(yǎng)18小時，5000rpm，離心10min，棄去上清液，將菌體懸浮于質量比2％的無菌蔗糖溶液中，與10倍含有質量比1％-3％氯化鈣、濃度為1％-5％無菌淀粉溶液混合，通過微囊化細胞無菌制備裝置，滴入無菌的含質量0.1％吐溫80、0.3％-0.8％海藻酸鈉的溶液中，所得膠囊用無菌水沖洗后，放入1％氯化鈣溶液中硬化20-40分鐘，過濾，棄去氯化鈣溶液，用無菌水沖洗后，將膠囊放入1％-3％的殼聚糖淀粉混合溶液中，其中殼聚糖∶淀粉＝1∶6，30min后取出，用無菌水沖洗后，置于無菌改良乳清培養(yǎng)基中，在37℃恒定pH6.5培養(yǎng)至培養(yǎng)基中總糖含量低于1％，更換無菌改良乳清培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃恒定pH6.5培養(yǎng)，重復3批，微膠囊內細胞密度達1011cfu/g，過濾，去除培養(yǎng)基，即制成高密度乳酸菌微膠囊，將微膠囊置于含0.1％-0.3％α-淀粉酶(中溫型)和0.5％-0.8％糖化酶的溶液中，pH為5.5-6.5，35-40℃保溫2-6小時，制成乳酸菌細胞高通透性微膠囊，其中MRS培養(yǎng)基蛋白胨 10g牛肉膏 10g 酵母提取物 5gK2HPO4 2g 檸檬酸二銨 2g 乙酸鈉 5g葡萄糖 20g吐溫80 1mL MgSO4.7H2O 0.58gMnSO4.4H2O 0.25g 蒸餾水 1000mL pH 6.2-6.4；改良乳清培養(yǎng)基乳清粉 60g 植物蛋白水解液 20g酵母粉 0.8gK2HPO4 4g 碳酸鈣 8g 海藻糖 5g蒸餾水 1000mL pH 6.8-7.2。
2.權利要求1所述方法制備的乳酸菌細胞高通透性微膠囊發(fā)酵劑產(chǎn)品。
3.根據(jù)權利要求2所述乳酸菌細胞高通透性微膠囊發(fā)酵劑產(chǎn)品，包括單菌微膠囊、混 菌微膠囊、不同菌的單菌膠囊混合的乳酸菌發(fā)酵劑。
4.權利要求2或3所述乳酸菌細胞高通透性微膠囊發(fā)酵劑產(chǎn)品的應用，其特征在于，將 權利要求2或3所述乳酸菌細胞高通透性微膠囊發(fā)酵劑產(chǎn)品裝入經(jīng)殺菌的生物反應器，用 于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵果汁、發(fā)酵蔬菜汁的連續(xù)接種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乳酸菌細胞高通透性微膠囊制備方法，屬于生物工程技術領域。用液心包囊乳酸菌制備方法制得的含菌微膠囊，經(jīng)高密度培養(yǎng)、生物酶處理，在囊壁形成多孔結構，使囊內乳酸菌細胞極易透過囊壁，釋放到囊外的基質中，提高了連續(xù)接種的效率，降低了單位產(chǎn)品(發(fā)酵乳制品、發(fā)酵果汁等)接種成本，具有廣闊的市場前景。
文檔編號A23C9/12GK101869139SQ20101018573
公開日2010年10月27日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權日2010年5月28日
發(fā)明者劉小莉, 單成俊, 周劍忠, 張麗霞, 李瑩, 王英, 黃開紅, 黃自蘇 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院