專利名稱：一種產(chǎn)洛伐他汀真菌及其在普洱茶生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)洛伐他汀真菌及其在普洱茶生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，普洱茶由于其良好的降脂功效和獨(dú)特品質(zhì)而受到廣泛關(guān)注，且有多位 學(xué)者報(bào)道在普洱茶中發(fā)現(xiàn)了洛伐他汀，他汀藥物是羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶 抑制劑，是最為經(jīng)典和有效的降脂藥物，廣泛應(yīng)用于高脂血癥的治療，但目前還未有關(guān) 于洛伐他汀和普洱茶中微生物的系統(tǒng)研究，也尚未有產(chǎn)洛伐他汀菌株應(yīng)用在普洱發(fā)酵中 的研究。利用紅曲霉菌生產(chǎn)紅曲米和紅曲色素的生產(chǎn)和應(yīng)用已有上千年的歷史，其用途 也由醫(yī)用領(lǐng)域逐漸擴(kuò)展到食品領(lǐng)域。紅曲霉在發(fā)酵過程稱產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物洛伐他汀 做為良好的天然降脂藥成為研究與生產(chǎn)的熱點(diǎn)，天然紅曲中的洛伐他汀多為酸式，其空 間結(jié)構(gòu)與體內(nèi)HMG-CoA更為接近，無(wú)需水解，直接發(fā)揮抑制體內(nèi)膽固醇合成的作用， 其活性較內(nèi)酯式高約一倍，福建、浙江一帶已經(jīng)開發(fā)出多種含有洛伐他汀的功能性蕎麥 紅酒、餅干等保健食品。在普洱茶研究領(lǐng)域，由于長(zhǎng)期缺乏學(xué)科的研究，尤其是從微生物的角度來(lái)進(jìn)行 普洱茶的研究。而如何通過對(duì)云南普洱茶加工中微生物的研究，控制普洱茶中洛伐他汀 的含量尚未見公開的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從微生物的角度對(duì)普洱茶進(jìn)行研究，為生產(chǎn)企業(yè)提供生產(chǎn)含洛 伐他汀普洱茶的有益菌株來(lái)源。本發(fā)明的另一目的是通過控制有益菌種在普洱茶生產(chǎn)中 的比例，為促進(jìn)云南普洱茶品質(zhì)穩(wěn)定和提高發(fā)揮作用。本發(fā)明的產(chǎn)洛伐他汀真菌，由生產(chǎn)菌株的分離、純化、經(jīng)薄層層析初篩、高 效液相復(fù)篩工序后得到。生產(chǎn)菌株為產(chǎn)洛伐他汀紫色紅曲菌霉(Monascus purpurevs) MPT13,保藏日期2010年5月20日，保藏號(hào)CCTCC M 2010123，保藏單位中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明的紫色紅曲霉(Monascuspurpurevs)的形態(tài)學(xué)特征為培養(yǎng)7d，在PDA培養(yǎng)基上菌落直徑達(dá)2.9cm，菌落稍隆起，有放射狀溝紋，邊 緣整齊，氣生菌絲稀少，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)，菌落顏色以桔紅色為主，邊緣為淺肉色；菌落 背面有放射狀溝紋，邊緣整齊，顏色以深桔紅色為主，邊緣桔黃色。在麥芽汁培養(yǎng)基上 菌落直徑達(dá)2.5cm，菌落稍隆起，有放射狀深溝紋，邊緣整齊，氣生菌絲非常稀少，基內(nèi) 菌絲發(fā)達(dá)，菌落邊緣凹陷，菌落表面有皮膜狀，菌落顏色由里到外從土色變成桔紅色； 菌落背面有放射狀溝紋，有呈開裂狀，邊緣整齊，顏色呈土色。在察氏培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng) 弱，菌落平，直徑為1.2cm，邊緣不整齊，界限不清，氣生菌絲稀疏，基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)弱，菌落顏色呈淡桔紅色；菌落背面顏色呈淡桔紅色，邊緣界限不清。本發(fā)明經(jīng)公知的初 篩、復(fù)篩、天然培養(yǎng)基培養(yǎng)、根霉純化培養(yǎng)等傳統(tǒng)工序后得到。顯微形態(tài)為菌絲不規(guī)則地分枝、有隔膜，內(nèi)有油滴，壁上附有許多顆粒，直徑 為2.9 9.2μιη。分生孢子單生或成鏈，球形或倒梨形，6.6 9.2 X 7.9 13.1 μ m。閉 囊殼無(wú)孔口，球形或稍橢圓形，直徑20.4 71.4 μ m，呈桔紅色或稍淺紅色。子囊孢子 卵形或橢圓形，3.9 5.3X4.7 6.6 μ m。紅曲霉所產(chǎn)生的大量酶類和色素對(duì)普洱茶品質(zhì)形成有著重要作用，接種產(chǎn)洛伐 他汀菌株(紫色紅曲霉M0nascus pUrpUrevS)MPT13發(fā)酵的普洱，在保持傳統(tǒng)普洱茶品風(fēng) 味的基礎(chǔ)上，香氣和湯色方面也具有新的特點(diǎn)。本發(fā)明的產(chǎn)洛伐他汀的真菌應(yīng)用于普洱茶的生產(chǎn)中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將紫色紅曲霉(Monascus purpurevs)按一定的比例接種應(yīng)用
到普洱茶發(fā)酵過程中，得到了含洛伐他汀的普洱茶且在保持傳統(tǒng)普洱茶風(fēng)味的基礎(chǔ)上， 香氣和湯色方面也具有新的特點(diǎn)，并且縮短了加工時(shí)間，對(duì)普洱茶新產(chǎn)品與特色普洱茶 的開發(fā)發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 紫色紅曲霉(Monascuspurpurevs)菌種的分離純化從采集到的樣品中，通過PDA培養(yǎng)基(200g馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水IOOOmL 煮半小時(shí)，紗布過濾，再加20g葡萄糖和18g瓊脂，121°C滅菌30分鐘后倒平板)和麥芽 汁培養(yǎng)基(麥芽汁750 800ml，加水至IOOOmL,加15 18g瓊脂，121°C滅菌30分鐘 后倒平板)分離純化。分離純化方法如下(1)將固體培養(yǎng)基熔化，冷卻至45°C，注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿約15 20毫 升，稍微搖轉(zhuǎn)，靜置，使成平板備用。(2)取要分離的粉碎樣品lg，在火焰旁加到裝有9ml無(wú)菌水的試管中，此時(shí)得到 的是10_2的菌懸液。(3)稀釋按十倍稀釋法把菌懸液稀釋至10_8，十倍法是指下一管的菌懸液要比 上一管的稀十倍。(4)接種事先準(zhǔn)備好的平板9套，分別標(biāo)號(hào)為10_6、10_7、ΙΟ"8,每個(gè)稀釋度 寫三套平皿，以便比較。在每個(gè)已標(biāo)號(hào)的平皿中注入Iml相應(yīng)的菌懸液，用涂布棒涂均 勻，放入25 28°C培養(yǎng)24小時(shí)觀察。(5)培養(yǎng)2 5天后，挑取單個(gè)菌落，多次劃線純化得到純化菌株。實(shí)施例2:產(chǎn)洛伐他汀紫色紅曲霉(Monascuspurpurevs)的篩選(1)液態(tài)發(fā)酵分離純化得到的菌株，接種麥芽汁斜面，28°C培養(yǎng)6d后，以IOmL無(wú)菌水洗入 帶玻璃珠的小三角瓶中制成孢子懸液。取3mL孢子懸液接種于50mL液體種子培養(yǎng)基中 (每250ml三角瓶裝液50ml) 30°C，150r/m,培養(yǎng)2 3d至液體顏色微紅。按5%的接種量將液體種子培養(yǎng)基接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL裝液量 50mL)28°C, 150r/m 培養(yǎng) 12 14d 左右。
(2)薄層層析初篩取發(fā)酵液lmL，加乙酸乙酯5mL — 30°C下150r/min振搖3小時(shí)一離心，收集上
清液一沉淀再以5mL乙酸乙酯抽提2次一合并上清液，蒸干一以少許苯溶解干燥物一待 苯溶液會(huì)發(fā)后，加0.2mL甲醇溶解。待測(cè)液在薄層層析板上點(diǎn)樣10 μ L，在環(huán)己烷氯 仿異丙醇=6:3:1的展開劑中展開，吹干后，以10%磷鉬酸顯色。(3)高效液相復(fù)篩取ImL發(fā)酵液，加入IOmL甲醇，超聲波提取lh，先用濾紙過濾，再用微膜過 濾，收集濾液，進(jìn)行高效液相檢測(cè)分析，分析條件為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)238nm ；色譜柱 EclipseXDB-C 18 (5 μ m，4.4X 150mm)；流動(dòng)相:A 甲醇；B 60 % 甲醇；柱溫 30 "C ； 洗脫程序0-12min(A 液，100 % -0 ； B 液，0-100 % )，12_15min(100 % B 液)， 15-20min(100% A 液)；流速lmL/min ；進(jìn)樣量10 μ 1。實(shí)施例3 紫色紅曲霉(Monascuspurpurevs)在普洱茶發(fā)酵中的應(yīng)用將毛茶按傳統(tǒng)的方法進(jìn)行濕熱，隨后在毛茶中接種重量比5%的紫色紅曲霉 (Mcmascus purpurevs)的固態(tài)發(fā)酵劑讓其發(fā)酵，定期翻堆，當(dāng)堆溫升高到25士3°C時(shí)， Monascus purpurevs開始進(jìn)行代謝，洛伐他汀為紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在接種發(fā)酵后的 3-5天后開始產(chǎn)生，12-15天產(chǎn)量達(dá)到最高。經(jīng)接種紫色紅曲霉(Monascus purpurevs)后生產(chǎn)的普洱茶，洛伐他汀含量最高達(dá) 到0.263mg/mL，且形成了湯色紅濃明亮，滋味甘滑，香氣酯香突出的風(fēng)味特征。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)洛伐他汀真菌，由生產(chǎn)菌株的分離、純化、經(jīng)薄層層析初篩、高效液相 復(fù)篩工序后得到，其特征在于生產(chǎn)菌株為產(chǎn)洛伐他汀紫色紅曲霉(Monascus purpurevs) MPT13,保藏日期2010年5月20日，保藏號(hào)CCTCC M 2010123，保藏單位中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢武漢大學(xué)。
2.權(quán)利1所述的產(chǎn)洛伐他汀真菌，其特征在于產(chǎn)洛伐他汀真菌應(yīng)用于普洱茶的生產(chǎn)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)洛伐他汀真菌及其在普洱茶生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株由生產(chǎn)菌株的分離、純化、經(jīng)薄層層析初篩、高效液相復(fù)篩工序后得到。生產(chǎn)菌株為產(chǎn)洛伐他汀紫色紅曲霉(Monascus purpurevs)MPT13，保藏日期2010年5月20日，保藏號(hào)CCTCC M 2010123，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明將產(chǎn)洛伐他汀的真菌應(yīng)用于普洱茶的生產(chǎn)中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將紫色紅曲霉(Monascus purpurevs)按一定的比例接種應(yīng)用到普洱茶發(fā)酵過程中，得到了含洛伐他汀的普洱茶且在保持傳統(tǒng)普洱茶風(fēng)味的基礎(chǔ)上，香氣和湯色方面也具有新的特點(diǎn)，并且縮短了加工時(shí)間，對(duì)普洱茶新產(chǎn)品與特色普洱茶的開發(fā)發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102010831SQ20101018296
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者卓婧, 周紅杰, 李亞莉, 李家華, 秘鳴, 袁文俠, 趙明, 魏珍珍 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)